賈震虎,楊云琪,王騰宇,逄曉陽,呂加平

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030000 ; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 海淀 100193)

干酪乳桿菌SY13(LactobacilluscaseiSY13) 屬于厚壁菌門乳桿菌屬,分離自我國牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,前期研究表明,SY13作為兼性異型發(fā)酵乳酸菌,其活菌制劑能有效提高亞急性衰老小鼠的抗氧化能力,具有一定的延緩衰老作用,并且SY13和低聚糖組成的合生元可調(diào)節(jié)小鼠腸道內(nèi)與肥胖和糖尿病代謝相關(guān)的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)的豐度,表明SY13具有潛在的抗氧化、降脂和降糖等功能[1-3]。但是,SY13活菌制劑口服劑量、口服時(shí)間和低聚糖種類都可影響其益生功能,相關(guān)機(jī)制有待深入研究。

研究表明,乳酸菌和特定寡糖益生元可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),即增加腸道中有益菌、降低腸道中致病菌以改善腸道菌群失調(diào),并可通過調(diào)節(jié)機(jī)體腸道致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡,維持免疫穩(wěn)態(tài),在提高機(jī)體免疫的同時(shí)避免炎癥的發(fā)生,從而維護(hù)宿主健康[4-6]。因此,本試驗(yàn)擬探究SY13是否可通過調(diào)節(jié)宿主免疫和腸道菌群來實(shí)現(xiàn)益生功能,從而進(jìn)一步揭示其益生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低聚果糖和乳果糖,均購自上海源葉生物科技有限公司;血清白細(xì)胞介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-10和分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)ELISA檢測試劑盒,均購自Sigma公司;TaqMan?Universal PCR Master Mix(4304437),購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司;糞便基因組 DNA 提取試劑盒(DP328),購自天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(SPARK2M):帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;熒光定量 PCR儀(7500):美國 ABI 公司;TP600型PCR儀:寶生物工程(大連) 有限公司。

1.3 試驗(yàn)菌種和動(dòng)物 干酪乳桿菌SY13:由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院呂加平課題組分離自傳統(tǒng)乳制品;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京) 2016—0011]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌液制備 將穩(wěn)定期的SY13菌液于6 000 r/min離心10 min,收集菌體,無菌PBS洗滌2次,棄去上清液,用PBS懸浮并調(diào)節(jié)菌液濃度至109CFU/mL,取部分懸浮菌液,分別加入低聚果糖和乳果糖混勻,使SY13+低聚果糖和SY13+乳果糖的濃度為50 mg/mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 小鼠飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,環(huán)境溫度24 ℃,濕度40%～60%,光照12 h,試驗(yàn)前先用標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。隨機(jī)將48只小鼠分為4個(gè)組,分別為無菌PBS組(BP1組)、SY13組(BP2組)、SY13+低聚果糖(15 mg/mL)組(BP3組)和SY13+乳果糖(15 mg/mL)組(BP4組)。每天12:00進(jìn)行灌胃,灌胃體積為0.3 mL/只,連續(xù)灌胃28 d,分別于第1、3、5、7天時(shí),每組取3只小鼠,摘眼球采集全血,分離血清并放入4 ℃冰箱備用;處死小鼠,分別取空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物,液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 血清sIgA和細(xì)胞因子定量檢測 取第1、3、5、7天采集的試驗(yàn)各組小鼠血清樣本,采用ELISA試劑盒按說明書操作,檢測血清sIgA以及血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4和IL-10的含量。

1.4.4 TaqMan-MGB 探針檢測腸道SY13含量 取第1天采集的試驗(yàn)各組小鼠空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物,使用糞便基因組 DNA 提取試劑盒提取其基因組DNA,用探針Taqman-MGB(FAM-CTCAAAAATGGATCTTG-MGB)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測SY13含量。反應(yīng)體系總體積20 μL:上游引物06232F(10 μmol)1 μL、下游引物06232R(10 μmol)1 μL、06232P(10 μmol)1 μL、模板DNA 1 μL、TaqMan?Universal PCR Master Mix 10 μL、滅菌超純水6 μL。反應(yīng)條件:50 ℃酶激活2 min;95 ℃預(yù)變性10 min;循環(huán)階段,95 ℃變性15 s,58 ℃退火和延伸60 s,共40個(gè)循環(huán);熒光檢測設(shè)定在退火和延伸階段。

1.4.5 腸道微生物多樣性檢測 取第1、7天采集的試驗(yàn)各組小鼠盲腸內(nèi)容物,進(jìn)行腸道微生物多樣性檢測,利用PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 的V3和V4區(qū)中338～806 bp區(qū)域,上下游引物分別為 338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。將PCR產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫,由北京奧維森科技有限公司采用 Illumina Miseq平臺(tái)完成測序,分析小鼠腸道菌群α多樣性、Beta多樣性和腸道菌群結(jié)構(gòu)[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示。采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清sIgA定量檢測 結(jié)果如表1所示,在第3天時(shí),BP2組小鼠血清sIgA含量顯著高于其他各組 (P<0.05);在第7天時(shí),BP1組小鼠血清sIgA含量顯著低于其他各組 (P<0.05)。

表1 各組小鼠血清sIgA含量Table 1 Serum sIgA level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2 血清細(xì)胞因子定量檢測

2.2.1 IL-1β定量檢測 結(jié)果如表2所示,在第3天時(shí),BP4組小鼠血清 IL-1β含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表2 各組小鼠血清IL-1β含量Table 2 Serum IL-1β level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.2 IL-2定量檢測 結(jié)果如表3所示,在第1、5天時(shí),BP2組小鼠血清IL-2含量顯著高于其他各組(P<0.05);在第7天時(shí),BP2組和BP3組小鼠血清IL-2含量顯著低于BP1組和BP4組(P<0.05)。

表3 各組小鼠血清IL-2含量Table 3 Serum IL-2 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.3 IL-4定量檢測 結(jié)果如表4所示,在第5天時(shí),BP4組小鼠血清 IL-4含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表4 各組小鼠血清IL-4含量Table 4 Serum IL-4 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.4 IL-10定量檢測 結(jié)果如表5所示,在第3天時(shí),BP2組、BP3組和BP4組小鼠血清 IL-10含量顯著高于BP1組 (P<0.05);而在第5天時(shí),BP4組小鼠血清 IL-10含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表5 各組小鼠血清IL-10含量Table 5 Serum IL-10 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.3 TaqMan-MGB 探針檢測小鼠腸道SY13含量 結(jié)果如表6所示,BP1組小鼠腸道菌群中未檢測到SY13;BP4組小鼠空腸、回腸和盲腸菌群中SY13含量顯著高于其他各組 (P<0.05);BP3組和BP4組小鼠結(jié)腸菌群中的SY13含量顯著高于BP2組(P<0.05)。

表6 各組小鼠腸道菌群中SY13含量Table 6 Content of SY13 in the intestinal flora of mice in each group

2.4 小鼠腸道微生物多樣性分析 結(jié)果如表7所示,BP1組的Shannon、Ace指數(shù)和Chao 1均低于其他各組,表明SY13可以增加小鼠腸道的微生物豐富度。各組檢測覆蓋率達(dá)到約99%,表明當(dāng)前測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種信息,可滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

2.5 腸道菌群群落組成分析 Beta多樣性分析表示不同分組條件下樣本之間微生物結(jié)構(gòu)的相似性或差異性。聚類熱圖基于樣本屬水平分類,表示不同組間微生物結(jié)構(gòu)的相似性或差異性。結(jié)果如圖1所示,各組小鼠盲腸菌群有部分聚類的趨勢,菌落能明顯區(qū)分開,但是均以擬桿菌門和厚壁菌門為主,說明各組有一定的同源性和相似性。

圖1 各組間共享屬聚類熱圖Fig.1 Heatmap of shared genus cluster among groupsD1:第1天; D7:第7天D1:Day 1; D7:Day 7

2.6 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 菌群門水平分布 結(jié)果如表8所示,在第1、7天時(shí),BP3組和BP4組小鼠盲腸菌群中的擬桿菌門豐度顯著高于BP1組(P<0.05);BP1組小鼠盲腸菌群中的變形菌門豐度顯著高于其他各組(P<0.05);BP3組小鼠盲腸菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的豐度比值低于其他各組。

表8 干酪乳桿菌SY13對(duì)小鼠盲腸菌群門水平的影響Table 8 Effects of Lactobacillus casei SY13 on the phylum level of cecal flora in mice (%)

2.6.2 菌群屬水平分布 結(jié)果如表9所示,在第7天時(shí),BP3組和BP4組小鼠盲腸菌群中另枝菌屬豐度顯著高于BP1組(P<0.05)。

表9 干酪乳桿菌SY13對(duì)小鼠盲腸菌群屬水平的影響Table 9 Effects of Lactobacillus casei SY13 on the genus level of cecal flora in mice (%)

3 討論

研究表明,宿主口服益生菌后,益生菌在腸上皮粘附和定植,可對(duì)宿主腸道上皮細(xì)胞發(fā)揮直接作用而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[8]。腸道微生物對(duì)益生元糖進(jìn)行發(fā)酵可產(chǎn)生短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs),SCFAs 受體(G蛋白偶聯(lián)受體41和43)能結(jié)合至腸道相關(guān)淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue,GALT) 的免疫細(xì)胞,調(diào)控Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)或Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá),通過調(diào)節(jié)機(jī)體腸道致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡,維持免疫穩(wěn)態(tài),在提高機(jī)體免疫的同時(shí)避免炎癥的發(fā)生[9,10]。細(xì)胞因子根據(jù)在炎性反應(yīng)中的作用不同分為致炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-2等) 和抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10等)。本試驗(yàn)中BP2組小鼠血清IL-2含量在第3天時(shí)顯著升高,而后又逐漸降低,說明SY13前期在宿主腸黏膜腸道微生物定植和占位過程中誘發(fā)了炎性反應(yīng);第5天時(shí)BP4組小鼠血清IL-4和IL-10均顯著升高,表明SY13和乳果糖可調(diào)節(jié)小鼠血清抗炎細(xì)胞因子的表達(dá),維持機(jī)體腸道致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡,同時(shí)用TaqMan-MGB探針檢測到BP4組小鼠空腸、回腸和盲腸菌群中SY13含量顯著高于其他各組,表明長時(shí)間灌胃可使SY13在小鼠腸道中粘附和定殖,與Grattepanche等[11]和Zhang等[12]描述的益生菌在腸道內(nèi)的分布是一致的。由于BP4組中給小鼠灌服的是SY13和乳果糖,說明乳果糖不僅有助于SY13在腸道粘附和定殖,并且可被腸道微生物發(fā)酵利用,產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可顯著調(diào)節(jié)宿主免疫功能。

研究表明,動(dòng)物胃腸道內(nèi)的微生物群中約90%屬于厚壁菌門和擬桿菌門,如果厚壁菌門與擬桿菌門比值逐漸增大,機(jī)體腸道微生物菌群的構(gòu)成和多樣性將下降,導(dǎo)致胃腸道疾病多發(fā)[13],而益生菌能夠調(diào)控宿主腸道菌群恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)[14]。本試驗(yàn)第1、7天時(shí),BP3組和BP4組小鼠盲腸擬桿菌門菌群豐度顯著低于其他各組,BP3組小鼠盲腸厚壁菌門與擬桿菌門菌群的豐度比值低于其他各組,表明BP3組(SY13+低聚果糖)小鼠盲腸菌群豐富度增加,可降低宿主疾病感染概率。低聚果糖和乳果糖對(duì)于小鼠腸道不同的調(diào)節(jié)作用,表明不同益生元對(duì)益生菌的作用效果存在差異[15]。

腸道菌群物種分布相對(duì)豐度大于1%的微生物屬,在代謝-免疫關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。瘤胃球菌屬菌群不僅可降解腸道內(nèi)碳水化合物,而且與疾病相關(guān)[16,17];另枝菌屬菌群可以減緩腸道炎癥,提高宿主對(duì)碳水化合物的利用,增加體內(nèi)脂肪的降解[18,19]。本試驗(yàn)第7天時(shí),BP3組和BP4組小鼠盲腸另枝菌屬菌群豐度顯著高于BP1組,表明低聚果糖和乳果糖可加強(qiáng)SY13對(duì)宿主代謝的調(diào)控,影響宿主腸道菌群和免疫。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,SY13可通過粘附和定殖腸黏膜調(diào)節(jié)小鼠免疫應(yīng)答和腸道菌群,乳果糖不僅有助于SY13在腸道粘附和定殖,并且可被腸道微生物發(fā)酵利用,產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可顯著調(diào)節(jié)宿主免疫功能;低聚果糖可增加小鼠盲腸菌群豐富度,降低宿主感染疾病概率,可見不同益生元對(duì)益生菌的作用效果存在差異。