張夢奇,李彬,王瓊芬,張紅萍,石婧,徐虹,吳纖愫
(浙江省舟山市食品藥品檢驗檢測研究院,舟山 316000)
西紅花又名藏紅花、番紅花,系鳶尾科番紅花屬植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭,是素有“紅色黃金”之稱的名貴藥材,具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效[1]。隨著現(xiàn)代藥理學研究的發(fā)展,西紅花已被證實對心血管疾病、肝腎損傷、精神疾病、糖尿病、眼部疾病、癌癥等多種疾病均有治療作用[2-4]。據(jù)統(tǒng)計,中國西紅花年產(chǎn)量僅約為10 000 kg,僅能滿足約20%的市場需求[5,6],導致國內(nèi)西紅花產(chǎn)地造假、以次充好、摻假摻偽現(xiàn)象較為嚴重。因此,有必要建立一種多指標組合的西紅花質(zhì)量綜合評價方法。
目前,關(guān)于西紅花的質(zhì)量評價研究基本都集中于指標成分苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量測定[7-9]。筆者尚未見基于熵權(quán)逼近理想解排序法(technique for order preference by similarity to ideal solution,TOPSIS)的西紅花質(zhì)量綜合評價相關(guān)研究報道。TOPSIS是一種目前已廣泛應用于各領域的多指標決策分析方法,能充分利用原始數(shù)據(jù),避免數(shù)據(jù)的主觀性,客觀地反映各評價對象間的相對優(yōu)劣[10-11]??蓾M足西紅花質(zhì)量綜合評價需求,實現(xiàn)藥材擇優(yōu)、排序。基于此,本研究采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法波長切換法測定苦番紅花素及西紅花苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量,以4種成分總含量、干燥失重、總灰分、吸光度和浸出物作為質(zhì)量綜合評價指標,采用熵權(quán)TOPSIS法,以計算出的相對貼近度大小進行排序,對不同產(chǎn)地西紅花質(zhì)量進行比較,旨在為西紅花質(zhì)量綜合評價、實現(xiàn)藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)價,促進優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)開發(fā)提供參考。
1.1儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色譜儀,DAD檢測器(美國安捷倫公司);XSE205DU電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.01 mg];UV-2700紫外-可見分光光度計(日本島津公司);DHG9240A型熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);HWS-12電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);KQ- 300VDE 雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2試藥 苦番紅花素(批號:112056-202102,含量:97.3%)、西紅花苷-Ⅰ(批號:111588-201704,含量:88.4%)、西紅花苷-Ⅱ(批號:111589-201705,含量:92.2%)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院;西紅花苷-Ⅲ對照品(批號:wkq-21081003,含量:99.75%)購于四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純(J.T.Baker 公司);水為Milli-Q自制水,其他試劑均為分析純。
1.3藥材 18批西紅花產(chǎn)地信息見表 1,由舟山市食品藥品檢驗檢測研究院鄭國平主任中藥師鑒定為番紅花(CrocusSativusL.)的干燥柱頭。
表1 西紅花產(chǎn)地信息Tab.1 Origin information of Croci Stigma
2.1多指標成分含量測定
2.1.1色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);流動相:乙腈(A)-水(B);梯度洗脫(0~6 min,流動相A為15%→25%,6~14 min,流動相A為25%,14~30 min,流動相A為25%→40%);流速1.0 mL·min-1;檢測波長(0~6 min,254 nm;6~30 min,440 nm);柱溫25 ℃;進樣體積10 μL。在該色譜條件下,各成分峰分離良好,見圖1。
A.混合對照品溶液;B.供試品溶液。1.苦番紅花素;2.西紅花苷-Ⅰ;3.西紅花苷-Ⅱ;4西紅花苷-Ⅲ。圖1 西紅花HPLC色譜圖 A.mixed reference solution;B.sample solution;1.picrocrocin;2.crocin Ⅰ;3.crocin Ⅱ;4.crocin Ⅲ.Fig.1 HPLC chromatogram of Croci Stigma
2.1.2對照品溶液的制備 取苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ對照品適量,精密稱定,分別加稀乙醇制成濃度為0.274 0、0.288 5、0.099 4、0.031 4 mg·mL-1的混合對照品貯備溶液(1)。精密量取上述貯備溶液(1)1.0 mL,置10 mL量瓶中,加稀乙醇稀釋至刻度,制成各對照品濃度分別為27.40、28.85、9.94、3.14 μg·mL-1的混合對照品溶液。另取苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ對照品適量,精密稱定,分別加稀乙醇制成濃度為0.164 5、0.173 9、0.071 2、0.022 6 mg·mL-1的混合對照品貯備溶液(2)。
2.1.3供試品溶液的制備 取西紅花細粉約10 mg,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加稀乙醇適量,置冰浴中超聲處理20 min,放至室溫,加稀乙醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.1.4線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2節(jié)”下混合對照品貯備溶液0.1,0.2,0.5,1.0和2.0 mL,分別置10 mL量瓶中,加稀乙醇稀釋至刻度,按“2.1.1節(jié)”下的色譜條件,依次進樣測定苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ的峰面積,以各對照品濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,相應峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸,結(jié)果見表2。
表2 4種成分的回歸方程與線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges of four components
2.1.5精密度試驗 精密量取“2.1.2節(jié)”下混合對照品溶液,按“2.1.1節(jié)”下的色譜條件,連續(xù)進樣6次,記錄各成分的峰面積,計算苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ峰面積的RSD,結(jié)果分別為0.14%、0.53%、0.32%、0.44% ,表明儀器精密度良好。
2.1.6重復性試驗 取西紅花樣品(編號S1)細粉適量,精密稱定,共6份,按“2.1.3節(jié)”下方法平行制備供試品溶液,并按“2.1.1節(jié)”下的色譜條件分別進樣測定,計算苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ含量的RSD,結(jié)果分別為0.32%、0.45%、0.76%、0.93%,表明該方法重復性良好。
2.1.7穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,室溫下于制備后0、2、4、8、10、12 h,按“2.1.1節(jié)”下的色譜條件進樣測定,記錄苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ峰面積,并計算峰面積的RSD,結(jié)果分別為0.61%、1.62%、1.34%、1.77%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取西紅花(編號S1)細粉約10 mg,置100 mL棕色量瓶中,共6份,分別加入“2.1.2節(jié)”下混合對照品貯備溶液(2)10 mL,按“2.1.3節(jié)”下方法制備供試品加標溶液,按“2.1.1節(jié)”下色譜條件分別進樣測定,計算加樣回收率。結(jié)果顯示,苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ的平均加樣回收率分別為99.58%、98.40%、99.63%、98.90%,RSD分別為0.70%、1.18%、0.42%、1.35%(n=6),表明該方法準確性良好,結(jié)果見表3。
表3 4種成分的加樣回收率實驗結(jié)果Tab.3 Recovery rate experimental results of four components n=6
2.1.9樣品測定 分別取不同產(chǎn)地西紅花樣品適量,研細,按“2.1.3節(jié)”下方法制備供試品溶液,每個樣品平行制備3份。按“2.2.1節(jié)”下色譜條件測定,按回歸方程分別計算樣品中苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ的含量,18批西紅花4種成分總含量為16.71%~40.84%,不同產(chǎn)地間含量差異較大,浙江、西藏、安徽、江蘇、上海產(chǎn)西紅花4種成分總含量均值分別為31.49%、23.98%、24.70%、19.78%、17.64%,浙江產(chǎn)西紅花整體含量較高,安徽、西藏次之,結(jié)果見表4。
表4 西紅花中4種成分含量測定結(jié)果Tab.4 Content determination results of four components in Croci Stigma %,n=3
2.2干燥失重、總灰分、吸光度、浸出物測定干燥失重 按干燥失重測定法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0831)測定;總灰分按灰分測定法(《中華人民共和國藥典》2020年四部通則2302)測定;吸光度按《中華人民共和國藥典》2020年版一部西紅花項下測定方法測定;浸出物按“醇溶性浸出物測定法”中熱浸法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則2201),以30%乙醇作溶劑測定,每份樣品平行測定3次。18批西紅花干燥失重在8.72%~11.92%,平均值為10.32%;總灰分在4.19%~7.37%,平均值為4.87%;吸光度在0.50~0.85,平均值為0.65;浸出物含量在58.11%~69.72%,平均值為64.50%;上述測定結(jié)果均符合《中國藥典》2020年版一部西紅花各項下的標準規(guī)定,結(jié)果見表5。
表5 西紅花各評價指標測定結(jié)果Tab.5 Results of each evaluation index in Croci Stigma
2.3熵權(quán)TOPSIS法分析
表6 熵權(quán)法權(quán)重計算結(jié)果Tab.6 Weight calculation results by entropy method
公式(1)
pijlnpij=0
公式(2)
公式(3)
表7 西紅花質(zhì)量綜合評價排序Tab.7 Relative ordering of comprehensive quality evaluation of Croci Stigma
公式(4)
公式(5)
公式(6)
3.1評價指標選擇 西紅花中西紅花苷類成分(西紅花苷-Ⅰ~西紅花苷-Ⅴ)為最主要的藥效成分,也是西紅花色澤指標成分,苦番紅花素為西紅花特有苦味的來源[13-14]。本研究在前期對西紅花有效成分含量測定時,發(fā)現(xiàn)除含量較高的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ及苦番紅花素外,西紅花苷-Ⅲ也存在于每批次樣品中,而其他成分如西紅花苷-IV等含量微乎其微,且并不普遍存在于每批樣品中,因此本研究最后選取苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和西紅花苷-Ⅲ4種成分總含量作為質(zhì)量評價指標之一。而以浸出物和吸光度作為指標,可測定出在HPLC檢測中無法精確定量及結(jié)構(gòu)未知的其他活性成分含量。水分是保證西紅花質(zhì)量的重要因素,過高的水分易導致西紅花苷類成分降解同時也更易發(fā)生蟲害、霉變。西紅花作為常見貴細藥材,不法商家為非法牟利,摻雜增重的現(xiàn)象屢見不鮮,而總灰分能夠反映藥材中的外來摻雜物及其潔凈程度,因此也是西紅花質(zhì)量綜合評價的重要指標之一。綜上,本研究最終確定以4種成分總含量、干燥失重、總灰分、吸光度和浸出物,作為西紅花質(zhì)量綜合評價指標。
3.2含量測定方法優(yōu)化 項目組在前期研究中發(fā)現(xiàn),“2.1.2節(jié)”下混合對照品溶液穩(wěn)定性較好,但供試品溶液在配制時間超過12 h后,3種西紅花苷含量均出現(xiàn)一定程度的下降。另外,現(xiàn)行法定標準收載的西紅花含量測定方法分析時間長,且無法有效分離西紅花苷-Ⅲ。鑒于此,項目組對法定標準收載的色譜條件進行了優(yōu)化,首先比較了不同規(guī)格的色譜柱: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm,4 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm),結(jié)果各成分分離度及理論板數(shù)均能滿足檢測需求,故實驗中選用了保留時間短的Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm)。隨后為進一步縮短分析時間,對流動相梯度也進行了優(yōu)化,最終確定“2.2.1節(jié)”下洗脫條件,在30 min內(nèi)即可實現(xiàn)各待測成分間的良好分離。優(yōu)化后的含量測定方法較現(xiàn)行法定標準,在增加了西紅花苷-Ⅲ測定的同時,顯著提高了檢測效率,確保多樣品連續(xù)檢測時結(jié)果的準確性和可靠性。
3.3熵權(quán)TOPSIS法分析 熵權(quán)TOPSIS法分析結(jié)果顯示,浙江、西藏、安徽、江蘇、上海產(chǎn)西紅花的相對貼近度均值分別為0.654、0.396、0.426、0.326、0.341,產(chǎn)地為浙江的西紅花質(zhì)量最佳,6批樣品相對貼近度均大于0.5。浙江、上海、江蘇和安徽均屬于華東地區(qū),所處地理自然環(huán)境相似,但浙江產(chǎn)西紅花整體質(zhì)量最佳,除環(huán)境因素外,可能在種球繁育、栽培技術(shù)等方面具有優(yōu)勢。產(chǎn)地為西藏的西紅花批次間質(zhì)量差異較大,可能是由于西藏栽培西紅花多采用“室外直接種植”的一段法,而非華東地區(qū)所采用的“室外田間種植+室內(nèi)培育開花”的二段法,導致其質(zhì)量更易受外界氣候環(huán)境的影響。
綜上所述,本研究以苦番紅花素和西紅花苷(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)4種成分總含量、干燥失重、總灰分、吸光度和浸出物作為評價指標,采用熵權(quán)TOPSIS法可實現(xiàn)對不同產(chǎn)地西紅花的綜合評價,可為西紅花整體質(zhì)量研究和優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地篩選提供依據(jù)。此外,西紅花的質(zhì)量是否受采收時間、干燥工藝、貯藏條件等其他因素影響還有待進一步的研究。