顧曉霞，龐 萍，王晶晶，文堯鋒，胡 奎，陳 昊

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉手術(shù)中心；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床科研中心，廣東 湛江 524001）

異丙酚是烷基酸類麻醉藥，不僅具有鎮(zhèn)靜麻醉的作用，還可抑制炎癥反應(yīng)，對抗機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，具有器官保護(hù)效應(yīng)[1]。研究表明，在體外心肌缺血再灌注損傷中，異丙酚可減少氧自由基的生成，具有抗氧化損傷的作用[2-3]。更有臨床研究證實，采用異丙酚全憑靜脈麻醉的體外循環(huán)下心臟手術(shù)患者，血液中的氧自由基及炎癥介質(zhì)明顯減少[4]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，加入異丙酚-內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡（MVs）后，缺氧再復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、線粒體損傷明顯改善。外泌體是一類微囊泡物質(zhì)，異丙酚預(yù)處理產(chǎn)生的外泌體可否通過抑制缺血再灌注時發(fā)生的心肌壞死性凋亡，來減少心肌細(xì)胞損傷和死亡，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，尚未見研究報道?；诖?，本研究旨在探討異丙酚預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體（p-exo）對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 提取與鑒定方法 異丙酚處理外泌體的分離提取和鑒定：采用人胚胎臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECS），Propofol濃度25 μm處理6、12、24 h；Propofol濃度50 μm處理6、12、24 h；Propofol濃度100 μm處理6、12、24 h。找到異丙酚最適濃度及最佳處理時間。然后進(jìn)行蛋白免疫印跡（WB）鑒定。采用H9C2心肌細(xì)胞系，用過氧化氫（H2O2）處理模擬細(xì)胞內(nèi)缺血再灌注損傷，制備損傷模型。用PKH67標(biāo)記外泌體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察外泌體攝取內(nèi)化情況，確定心肌細(xì)胞能否很好地攝取外泌體，并通過對各分組熒光強(qiáng)弱的觀察，判斷各組外泌體攝入有無差異及外泌體攝取的最適共培養(yǎng)時間。利用不同條件處理下外泌體與損傷心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，驗證異丙酚處理來源的外泌體通過減弱壞死性凋亡對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

1.2 檢測方法及指標(biāo) 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK8）檢測細(xì)胞活性；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）檢測細(xì)胞壞死性凋亡情況；通過透射電子顯微鏡檢測細(xì)胞損傷情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 20.0及GraphPad Prism 7統(tǒng)計學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)是至少三個獨立實驗的（），計量資料使用t檢驗，組間比較通過單向方差分析，如果方差是均質(zhì)的，則使用LSD-t檢驗，如果方差不是均質(zhì)的，則使用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 7軟件及Image J軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 異丙酚處理來源外泌體的分離、提取和鑒定 分離外泌體并通過透射電子顯微鏡鏡、納米顆粒示蹤分析和表面標(biāo)志物等進(jìn)行表征，透射電子顯微鏡下可見多個粒徑范圍30～150 nm的雙層膜狀囊泡。納米顆粒跟蹤分析儀（NTA)結(jié)果：NC組（對照組）外泌體濃度為1.85×109particles/mL，粒徑約127 nm；P組(異丙酚處理組)外泌體濃度為2.54×1010particles/mL，粒徑約97 nm；DMSO組（溶劑對照組）外泌體濃度為1.1×1010particles/mL，粒徑約129 nm，異丙酚處理組外泌體濃度明顯高于另外兩組，說明異丙酚可促進(jìn)外泌體的釋放，增加外泌體濃度。外泌體蛋白WB結(jié)果：CD63、CD9、TSG101等外泌體表面標(biāo)志物有表達(dá)，只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Grp94不表達(dá)。異丙酚處理組無論是在細(xì)胞還是外泌體，表面標(biāo)志物CD63、CD9及TSG101的表達(dá)均增加，其中細(xì)胞中TSG101表達(dá)的增加不明顯。GAPDH為內(nèi)參蛋白，見圖1。

圖1 異丙酚處理來源的外泌體

2.2 建立心肌細(xì)胞損傷模型 具體建立體外心肌細(xì)胞損傷模型如方法中所述，H2O2被證實可用于模擬IRI產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，高濃度的H2O2（500 μmol/L）可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞的壞死性凋亡。CCK8檢測結(jié)果顯示：與NC組相比，H2O2500 μmol/L處理后，心肌細(xì)胞活性顯著降低，尤其是處理2 h后（P＜0.000 1，100.0%±0.0% vs 31.64%±1.384%, N=3）。顯微鏡下可見NC組心肌細(xì)胞邊界清晰，排列有序，貼壁生長。H2O2500 μmol/L處理2 h后，心肌細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，邊界不清；電鏡下可見H2O2500 μmol/L處理2 h后細(xì)胞損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體水腫變圓。故選用500 μmol/L濃度H2O2處理H9C2心肌細(xì)胞2 h的建模方法進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖2。

圖2 細(xì)胞活性、形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化

2.3 外泌體的攝取內(nèi)化及產(chǎn)生保護(hù)作用最適外泌體濃度 激光共聚焦顯微鏡下可見：細(xì)胞核染藍(lán)色熒光，外泌體染綠色熒光，將不同分組來源的外泌體與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)12 h和24 h后，綠色熒光的外泌體被心肌細(xì)胞攝取內(nèi)化，聚集在細(xì)胞核周圍，但是熒光強(qiáng)度顯示共培養(yǎng)12 h和24 h對外泌體的攝入沒有明顯影響。用BCA蛋白濃度檢測法對外泌體蛋白濃度進(jìn)行統(tǒng)一定量處理，配平為1 μg/μL。CCK8結(jié)果：與H2O2處理組相比，10 μg/100 μL（P=0.028,45.81%±1.751% vs 63.68%±5.003%, N=3）、15 μg/100 μL（P=0.000 5, 45.81%±1.751%vs 81.08%±2.996%，N=3）及20 μg/100 μL(P=0.001 5，45.81%±1.751% vs 74.30%±3.204%, N=3)濃度的外泌體加入后均產(chǎn)生保護(hù)作用，心肌細(xì)胞活性恢復(fù)，其中15 μg/100 μL濃度外泌體保護(hù)作用最強(qiáng)，見圖3。

圖3 外泌體的攝取內(nèi)化及保護(hù)作用

2.4 H2O2處理H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡 WB結(jié)果顯示：與NC組相比，H2O2500 μmol/L處理2、6、12 h后，壞死性凋亡相關(guān)蛋白受體相互作用蛋白（RIP）1和RIP3升高，處理2 h時升高最顯著（P=0.035 4，0.806 3±0.115 2 vs 1.498±0.189 2, N=3；P=0.000 5,0.639 3±0.017 40 vs 1.119±0.042 52, N=3）；為了進(jìn)一步驗證壞死性凋亡模型，單獨用H2O2500 μmol/L處理H9C2心肌細(xì)胞2 h，WB結(jié)果顯示：與NC組相比，H2O2500 μmol/L處理2 h后，壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1（P=0.018 2,0.331 3±0.056 19 vs 0.773 0±0.099 86, N=3）、RIP3（P=0.023 6,0.486 0±0.058 32 vs 0.856 0±0.086 02, N=3）、mLKL（P=0.006 2,0.696 3±0.018 77 vs 1.232±0.099 91, N=3）和膜蛋白p-mLKL（P=0.000 8,0.734 7±0.119 7 vs 2.408±0.140 2, N=3）顯著上調(diào)。GAPDH為細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)參蛋白，beta-tubuLin為細(xì)胞膜中的內(nèi)參蛋白。qRT-PCR 結(jié)果顯示：與NC組相比，H2O2500 μmol/L處理2 h后，壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1（P=0.041 6,1.000±0.0 vs 5.183±0.880 5, N=2）、RIP3（P=0.022 3,1.000±0.0 vs 5.697±0.712 5,N=2）和混合普系激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（mLKL）（P=0.001 6,1.000±0.0 vs 2.490±0.059 00, N=2）顯著上調(diào)。這表明500 μmol/L濃度H2O2處理2 h的H9C2心肌細(xì)胞引起壞死性凋亡，見圖4。

圖4 WB和qRT-PCR檢測壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1和RIP3的表達(dá)變化

2.5 異丙酚處理來源的外泌體通過抑制壞死性凋亡對損傷心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用 AnnexinV-FITC/PI試劑盒對不同處理的H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞壞死性凋亡數(shù)目，Q1區(qū)域為許可范圍內(nèi)的檢測誤差，Q2區(qū)域為壞死性凋亡細(xì)胞，Q3區(qū)域為正?；罴?xì)胞，Q4區(qū)域為早期凋亡細(xì)胞。結(jié)果示：與NC組相比，H2O2500 μmol/L 處理2 h后，壞死性凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多 （P=0.003，1.550%±0.150 0% vs 8.450%±0.350 0%, N=2），加入異丙酚來源外泌體（p-exo）后，壞死性凋亡細(xì)胞數(shù)減（P=0.004 9,8.450%±0.350 0% vs 3.050%±0.150 0%, N=2）；與H2O2處理組相比，加入p-exo后，CCK8檢測的細(xì)胞損傷減少（P=0.000 2,71.85%±1.936% vs 96.08%±0.174 6%,N=3）；WB結(jié)果也顯示壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1（P=0.019,1.624±0.184 1 vs 0.607 3±0.131 7, N=3)、RIP3（P=0.002 7,1.866±0.168 6 vs 0.631 3±0.079 43,N=3)、mLKL（P=0.006 2，1.543±0.177 4 vs 0.508 7±0.083 01, N=3）和膜蛋白p-mLKL（P=0.019 4，1.487±0.151 2 vs 0.705 0±0.140 9, N=3）下調(diào)，對照組nc-exo和d-exo的變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

圖5 異丙酚處理來源的外泌體抑制壞死性凋亡對損傷心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用

3 討論

外泌體是一類可在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞的囊泡狀物質(zhì)，其包含的生物學(xué)成分十分復(fù)雜，主要為蛋白質(zhì)、RNA及脂質(zhì)等[5-6]。Huang P等[7]研究報道，阿托伐他汀預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞，然后從細(xì)胞上清中提取外泌體，加入大鼠IRI模型后梗死面積減少，心肌功能得到改善。這表明外泌體裝載藥物并將有效成分傳遞給靶細(xì)胞及靶器官發(fā)揮生物學(xué)作用的可行性。課題組前期研究結(jié)果表示異丙酚有抗氧化作用，可對抗機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，對心肌細(xì)胞IR損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。與單獨異丙酚藥物處理相比，來自于外泌體裝載的異丙酚藥物處理具有以下優(yōu)勢：外泌體由脂質(zhì)雙層膜包裹，性質(zhì)穩(wěn)定，能夠保證藥物在體液運輸中不被降解，提高藥物的生物利用度[8]。外泌體雙層膜表面攜帶大量蛋白分子，可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)定向作用于靶細(xì)胞[9]。外泌體粒徑小，通透性強(qiáng)，幾乎存在所有體液中，能更有效地穿透人體生物屏障。本實驗采用異丙酚處理 HUVECS，然后超高速離心提取p-exo，差速超高速離心法提取的外泌體雜質(zhì)少，濃度高且雙層膜結(jié)構(gòu)完整，可滿足后續(xù)實驗要求。透射電子顯微鏡、納米顆粒示蹤分析及外泌體表面標(biāo)志物檢測是鑒定外泌體的重要方法。透射電子顯微鏡對外泌體的形態(tài)及大小進(jìn)行可視化觀測，可見多個大小在30～150 nm范圍的雙層膜狀囊泡；同時采用 NTA 對外泌體的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析，計算出粒度分布和濃度。對照組外泌體濃度為1.85×109particles/mL，粒徑約127 nm；異丙酚處理組外泌體濃度為 2.54×1010particles/mL，粒徑約97 nm；DMSO溶劑對照組外泌體濃度為1.1×1010particles/mL，粒徑約129 nm，研究發(fā)現(xiàn)與單純HUVECS來源外泌體組和DMSO溶劑處理來源外泌體組比較，加入異丙酚處理后來源外泌體的釋放濃度增加，說明異丙酚對 HUVECS 分泌外泌體有促進(jìn)作用。CD63、CD9及TSG101是目前鑒定外泌體的主要表面標(biāo)志蛋白，WB結(jié)果可見CD63、CD9、TSG101等外泌體表面標(biāo)志物有表達(dá)，只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 Grp94不表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參蛋白。PKH67是目前最常用的外泌體染色試劑，將染色的外泌體與H9C2心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察外泌體被染色為綠色熒光，細(xì)胞核被DAPI染色為藍(lán)色熒光，綠色熒光聚集在藍(lán)色熒光周圍，說明外泌體能夠被攝取內(nèi)化進(jìn)入H9C2心肌細(xì)胞中，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。

H2O2是一類具有極強(qiáng)氧化作用的物質(zhì)，是引起細(xì)胞死亡的主要活性氧，其介導(dǎo)的細(xì)胞損傷與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。故采用H2O2不同濃度處理H9C2心肌細(xì)胞，模擬細(xì)胞內(nèi)缺血再灌注時的氧化應(yīng)激損傷，制備損傷模型。CCK8檢測結(jié)果顯示：與NC組（對照組）相比，經(jīng)H2O2500 μmol/L處理后，心肌細(xì)胞活性顯著降低，尤其是處理2 h后。顯微鏡下可見 NC組心肌細(xì)胞邊界清晰，排列有序，貼壁生長。經(jīng)H2O2500 μmol/L處理 后，心肌細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，邊界不清；電鏡下可見H2O2500 μmol/L處理2 h后細(xì)胞損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體水腫變圓。文獻(xiàn)報道高濃度的H2O2（500 μmol/L）可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞的壞死性凋亡[10]，故選用500 μmol/L濃度的H2O2處理細(xì)胞2 h的建模方式進(jìn)行后續(xù)實驗。將p-exo加入H9C2心肌細(xì)胞 IR 模型中，觀察其對體外H9C2心肌細(xì)胞 IR 氧化應(yīng)激損傷的作用；CCK8 是反應(yīng)細(xì)胞損傷最直觀和便利的指標(biāo)，結(jié)果示p-exo可顯著減少IR心肌細(xì)胞的損傷。AnnexinVFITC/PI細(xì)胞染色是檢測細(xì)胞死亡的有效方法，PI是一種胞核核酸染料，不能穿過正常細(xì)胞的完整胞膜，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡時，胞膜被破壞，PI對其胞核進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀可定向識別被染色的壞死細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)，將正常細(xì)胞與壞死性凋亡細(xì)胞區(qū)分開來，結(jié)果顯示p-exo可顯著減少IR模型H9C2心肌細(xì)胞的壞死性凋亡的發(fā)生。

壞死性凋亡是新的程序性細(xì)胞死亡方式，是一種受到高度調(diào)控的細(xì)胞壞死[11-12]，主要由RIP1和RIP3介導(dǎo)，與mLKL形成復(fù)合體，激活磷酸化mLKL并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，在膜結(jié)構(gòu)上形成通透孔道，破壞膜完整性，引起細(xì)胞死亡[13-14]。RIP1、RIP3及mLKL均為壞死性凋亡的重要調(diào)控蛋白。mLKL是壞死性凋亡的最終執(zhí)行蛋白，mLKL磷酸化是機(jī)體發(fā)生壞死性凋亡的必要條件。壞死性凋亡參與了多種疾病的病理生理過程，Zhang T等[15]發(fā)現(xiàn)，IR或氧化應(yīng)激可以通過RIP3依賴性信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致心肌壞死性凋亡。因此在建立IRI壞死性凋亡模型時，不僅要檢測IRI細(xì)胞內(nèi)壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1、RIP3及mLKL的表達(dá)變化，還要提取損傷細(xì)胞的胞膜蛋白，檢測其中p-mLKL蛋白的水平變化。本次實驗在驗證p-exo能明顯減輕H9C2心肌細(xì)胞IR損傷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究p-exo在心肌細(xì)胞壞死性凋亡中可能發(fā)揮的作用，結(jié)果顯示：H2O2500 μmol/L處理H9C2心肌細(xì)胞2 h后，流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示：Q3區(qū)域壞死性凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多，WB檢測壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1、RIP3、mLKL和膜蛋白p-mLKL顯著上調(diào)，qRT-PCR結(jié)果顯示：壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1和mLKL的mRNA顯著上調(diào)；在加入p-exo 150 μg/mL濃度后,CCK8 檢測的細(xì)胞損傷減少，流式細(xì)胞學(xué)示壞死性凋亡細(xì)胞數(shù)減少，WB結(jié)果顯示：壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1、RIP3、mLKL和膜蛋白p-mLKL上調(diào)受到抑制。結(jié)果表明，p-exo能夠抑制IR損傷導(dǎo)致的H9C2心肌細(xì)胞壞死性凋亡，對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。p-exo減少H9C2心肌細(xì)胞死亡的過程與降低心肌細(xì)胞中RIP1、RIP3及mLKL的活力，同時，抑制p-mLKL的表達(dá)及向胞膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)p-exo對H9C2心肌細(xì)胞IR氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，并證明是通過下調(diào)IR心肌細(xì)胞中壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1、RIP3及mLKL的表達(dá)，抑制p-mLKL遷移至膜上，避免破壞胞膜完整性，從而減少細(xì)胞死亡。但外泌體傳遞的具體有效生物活性物質(zhì)仍未明確，其產(chǎn)生作用的具體信號通路仍需進(jìn)一步探索研究。本次研究探討了外泌體作為異丙酚這個藥物的載體，不僅可以將有效信息傳遞至心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，還闡明了具體的保護(hù)方式，將延展異丙酚保護(hù)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的新方向，為臨床防治心肌缺血再灌注損傷的外泌體藥物治療提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)，開拓未來外泌體治療的新領(lǐng)域。