摘要：【目的】對意大利蜜蜂（Apis mellifera）防御素-2蛋白（Defensin-2，Def-2）進(jìn)行蛋白序列分析和表達(dá)特性研究，以期為意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御機(jī)制、發(fā)育和代謝途徑研究提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)在線網(wǎng)站及軟件對Def-2蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，并采用實時熒光定量PCR對意大利蜜蜂不同發(fā)育時期（幼蟲期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂）的基因相對表達(dá)量進(jìn)行檢測分析?！窘Y(jié)果】意大利蜜蜂防御素-2基因（Def-2）編碼104個氨基酸殘基，相對分子量為11858.90 Da，理論等電點（pI）為8.54，為兩性不穩(wěn)定蛋白。該蛋白N-末端有一段含21個氨基酸的信號肽，存在1個跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和高爾基體，無糖基化位點，存在15個磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲（54.81%）為主、延伸鏈（28.85%）分布較多，α-螺旋（16.35%）分布較少，蛋白序列高度保守，與Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作關(guān)系，具有防御蛋白樣結(jié)構(gòu)域（DEFL），結(jié)構(gòu)域采用以半胱氨酸穩(wěn)定的α/β支架為特征的結(jié)構(gòu)，親緣關(guān)系與小蜜蜂極為相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同發(fā)育時期的表達(dá)水平存在差異且隨日齡增大而升高，30 d的相對表達(dá)量顯著高于其他日齡（Plt;0.05）?！窘Y(jié)論】意大利蜜蜂Def-2蛋白屬于兩性不穩(wěn)定蛋白，參與細(xì)胞間信號傳輸并維持細(xì)胞正常形態(tài)；蛋白序列高度保守，親緣關(guān)系與小蜜蜂最近，且該基因在30 d成年期工蜂中高豐度表達(dá)，推測其可能調(diào)節(jié)免疫基因轉(zhuǎn)運而影響蜜蜂的免疫識別過程。

關(guān)鍵詞：意大利蜜蜂；防御素-2蛋白；表達(dá)差異；實時熒光定量PCR

中圖分類號：S891文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）05-1454-09

Sequence analysis and expression characteristics of defensin-2 protein from Apis mellifera

DENG Xiao-yin1，YU Dian-dian1，WANG Jue1，ZHANG Xu-feng2，GUO Yuan2*，GUO Li-na1*

（1College of Animal Science，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China；2College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to conduct the protein sequence analysis and expression charac-teristics studies of Defensin-2（Def-2）protein of Apis mellifera，in order to provide a theoretical references for exploring the immune defense mechanism，development and metabolic pathway of defensin gene in A.melliferia.【Method】Bioin-formatics analysis websites and software were used to predict and analyze Def-2 protein，while the gene relative expres-sionlevels of A.mellifera at different developmental stages（larva stage，pupa stage and 1，5，10，15，20，25 and 30 d adult stage worker bee）were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】The Def-2 gene ofA.melliferaen-coded 104 amino acids residues with a relative molecular weight of 11858.90 Da and an isoelectric point（pI）of 8.54，identifying it as an amphipathic，unstable protein.This protein had a signal peptide of 21 amino acids at its N-terminus and had one transmembrane domain.The subcellular location was primarily in the endoplasmic reticulum，vacu-oles，and Golgi body.There were no glycosylation sites and only 15 phosphorylation sites.The secondary structure of this protein was dominated by random coil structure（54.81%），with large distribution of extended chain（28.85%）and a fewα-helix（16.35%）.The protein sequence was highly conserved and interacted genetically with proteins such as Def-1，GB44032-PA，Dl-2 and Imd，and contained defense protein-like domain（DEFL），which adopted a structure characterized by a cysteine-stabilizedα/βscaffold.The phylogenetic relationship showed close similarity to A.florea.The expression level of Def-2 gene ofA.mellifera varied at different developmental stages and increased with age，the relative expression of 30 d was significantly higher than the other days（Plt;0.05）.【Conclusion】Def-2 protein of A.mellifera is an amphipa-thic unstable protein，which is involved in intercellular signal transmission and maintains normal cell morphology.The pro-tein sequence is highly conserved，with the closest phylogenetic relationship to A.florea.The gene is expressed in high abundance at 30 d of adult A.mellifera，suggesting that it may regulate immune gene transport and affect the immune recog-nition process ofA.mellifera.

Key words：Apis mellifera；defensin-2 protein；expression difference；real-time fluorescence quantitative PCR

Foundation items：Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs：China Agriculture Research System（CARS-44-KXJ2）；Shanxi Applied Basic Research Plan（Youth）Project（20210302124360）；Shanxi University Science and Technology Innovation Project（2021L098）；Shanxi Agricultural University Youth Science and Technology In-novation Project（2019003）

0引言

【研究意義】意大利蜜蜂（Apis mellifera）是重要的傳粉媒介，生命力頑強(qiáng)，對外界細(xì)菌具有較強(qiáng)抵抗力（Breeze et al.，2014），在以農(nóng)業(yè)為主的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用（Kevan，1999）。然而，在世界大部分地區(qū)，意大利蜜蜂種群卻遭受大量損失，大量寄生蟲和病原體感染導(dǎo)致蜜蜂群落數(shù)量與生產(chǎn)力均呈下降趨勢（Vanengelsdorp and Meixner，2010），迫切需制定策略來防止此類不利影響的發(fā)生。研究表明，抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMP）是昆蟲天然免疫的關(guān)鍵成分（Crowley and Houck，2002），能通過對病原生物細(xì)胞質(zhì)膜完整性和通透性進(jìn)行干擾而發(fā)生防御作用（Cociancich et al.，1993），并可用于制備具有抗真菌和抗細(xì)菌特性的藥物（Bulet et al.，1999）。因此，通過對意大利蜜蜂防御素-2蛋白（Defensin-2，Def-2）進(jìn)行蛋白序列分析和表達(dá)特性研究，以期為進(jìn)一步探究其在蜜蜂體內(nèi)的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多關(guān)于AMP物理化學(xué)性質(zhì)的研究，證實其在蜜蜂免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用（Hoffmann et al.，1999）。在蜜蜂體內(nèi)共檢測到4種AMP，分別為蜂毒素apidaecin（Casteels et al.，1989）、蜂毒素abaelin（Casteels et al.，2010）、膜孔菌素和防御素（Wang et al.，2015），防御素于后生動物中廣泛存在。Casteels-Josson等（1994）利用從蜜蜂腹部組織制備的RNA合成的cDNA對血淋巴防御素及其前體前肽進(jìn)行鑒定，在蜜蜂血淋巴中發(fā)現(xiàn)了防御素。最初，在蜜蜂的下咽、下頜和胸腺中，僅發(fā)現(xiàn)防御素-1蛋白（Defensin-1）的mRNA，表明其表達(dá)具有組織特異性，Defensin-1在蜜蜂的頭部和胸部表達(dá)（Klaudiny et al.，2005），并分泌成蜂王漿（Quetal.，2008）和蜂蜜（Kwakman et al.，2010），參與蜜蜂群體免疫。與Defensin-1不同，Defensin-2由脂肪細(xì)胞和血細(xì)胞分泌，淋巴細(xì)胞合成，在蜜蜂個體免疫系統(tǒng)中具有不可替代的作用。Yoona等（2009）通過注射調(diào)節(jié)細(xì)菌感染作用的脂多糖，誘導(dǎo)蜜蜂科其他蜂種，如Bombus terrestris、B.ardensardens和B.hypocritesapporoensis 3種熊蜂個體的脂肪體中防御素基因的表達(dá)。防御素的表達(dá)通常晚于其他種類AMP，但其活性在蜜蜂感染試驗后仍可保存2周以上（Casteels et al.，1989）。【本研究切入點】不同蜜蜂在特定生活條件下有不同抗感染機(jī)制以抵制病害，其中最重要的機(jī)制之一是防御素機(jī)制，防御素-2基因（Def-2）在意大利蜜蜂個體免疫中發(fā)揮重要作用（Simone-Finstrom，2017）。但目前關(guān)于該基因在意大利蜜蜂蛋白結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析方面的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對意大利蜜蜂Def-2蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從NCBI下載不同蜜蜂防御素氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹并對其進(jìn)行同源性比對；采用實時熒光定量PCR對意大利蜜蜂不同日齡的Def-2基因相對表達(dá)量進(jìn)行檢測分析，以期為意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御機(jī)制、發(fā)育和代謝途徑研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

試驗用樣本由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蜂場提供。從健康的（無病無蟲害）意大利蜜蜂蜂群中選取2張封蓋子脾置于人工恒溫培養(yǎng)箱［培養(yǎng)溫度（35.0±0.2）℃，相對濕度50%～70%］，待蜜蜂出房后使用無味無毒的彩色油漆在其背部進(jìn)行標(biāo)記，待油漆干后放回原蜂巢，選擇幼蟲期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂，液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑：TRIzol試劑、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Mas-ter Mix購自日本TaKaRa公司；RNase-free Water、無水乙醇、三氯甲烷、氯仿和異丙醇購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。試驗儀器：高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司、ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.3 RNA提取和cDNA合成

從-80℃冰箱內(nèi)取出樣品，經(jīng)液氮研磨后，按照TRIzol試劑盒說明書提取各組織總RNA，測定濃度和純度后，再按照PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒說明將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNase-free Water稀釋后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計及熒光定量PCR檢測

在NCBI進(jìn)行Apis mellifera Def-2關(guān)鍵詞搜索獲得序列信息。根據(jù)所得的編碼區(qū)（CDS）序列設(shè)計熒光定量引物（F：5'-CGTGCCGACAGACATA-3'，R：5'-GCTTTACCCAAACTGA-3'），內(nèi)參基因為β-Actin（F：5'-CACTCCTGCTATGTATGTC-3'，R：5'-CAGCC AAGTCCAAACGA-3'），熒光定量引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。

根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20.0μL：cDNA模版2.0μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL，10μmol/L正、反向引物各0.4μL，ddH2O 7.2μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃20 s，57℃20 s，72℃30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。將意大利蜜蜂Def-2基因?qū)崟r熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)特性研究。不同日齡樣本進(jìn)行3次重復(fù)，以減少試驗誤差。

1.5生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)址見表1。

1.6統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析采用基于標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光曲線Ct值的2-ΔΔCt方法，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式。使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）以評估各組間的統(tǒng)計學(xué)差異并作圖。

2結(jié)果與分析

2.1意大利蜜蜂Def-2蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

利用ProtParam分析意大利蜜蜂Def-2蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果（表2）顯示，意大利蜜蜂Def-2基因編碼104個氨基酸殘基，包含20種常見氨基酸，含量最多的3種氨基酸殘基分別為Leu（9.6%）、Ile（8.7%）和Ser（7.7%）。意大利蜜蜂Def-2蛋白分子式為C522H843N151O146S9，相對分子量為11858.90 Da，理論等電點（pI）為8.54，總平均疏水指數(shù)為0.000，屬于兩性蛋白。蛋白質(zhì)穩(wěn)定指數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，意大利蜜蜂Def-2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為76.16，推測其為不穩(wěn)定蛋白。

2.2意大利蜜蜂Def-2蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

由意大利蜜蜂Def-2蛋白的信號肽分析結(jié)果（圖1-A）可知，該蛋白N-末端有一段含21個氨基酸的信號肽，位于第1～17位氨基酸處，剪切位點在第18和19位氨基酸之間；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖1-B）發(fā)現(xiàn)，該蛋白有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，推測其為分泌型蛋白。

意大利蜜蜂Def-2蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果（表3）表明，該蛋白主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（22.0%）、液泡（22.0%）及高爾基體（22.0%）內(nèi)，表明意大利蜜蜂Def-2蛋白參與并維持細(xì)胞正常形態(tài)。

2.3意大利蜜蜂Def-2蛋白糖基化位點和磷酸化位點預(yù)測結(jié)果

利用在線網(wǎng)站對意大利蜜蜂Def-2的O-糖基化位點、N-糖基化位點和磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示：Def-2蛋白無糖基化位點（圖2-A和圖2-B）；Def-2蛋白存在15個磷酸化位點，其中磷酸絲氨酸位點8個（17Ser、20Ser、50Ser、68Ser、68Ser、94Ser、94Ser和94Ser），磷酸蘇氨酸位點6個（45Thr、63Thr、63Thr、63Thr、63Thr和63Thr），磷酸色氨酸位點1個（31Tyr）（圖2-C）。

2.4意大利蜜蜂Def-2蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

意大利蜜蜂Def-2蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占16.35%（17個氨基酸），延伸鏈占28.85%（30個氨基酸），無規(guī)則卷曲占54.81%（57個氨基酸）（圖3-A）；該蛋白三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲、延伸鏈為主，但α-螺旋分布較少，與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果分布一致性較高（圖3-B）；進(jìn)一步對三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型的拉曼圖可靠性進(jìn)行驗證分析，該區(qū)構(gòu)象為立體化學(xué)允許區(qū)，可穩(wěn)定存在（圖3-C）。

2.5意大利蜜蜂Def-2蛋白模體結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

利用NCBI在線網(wǎng)站下載Def-2蛋白氨基酸序列，對該蛋白的模體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖4）表明，該家族包括一組防御素樣蛋白，包括擬南芥蛋白LURE1.2（AtLURE1.2）和LURE1.6（AtLURE1.6）、馬氏中葉松神經(jīng)毒素BmBKTx1、擬南芥防御素樣蛋白32（AtDEF32）及殺菌蛋白（如defensins、sapecins、tenecins、phormicins和lucifensins）。其具有防御蛋白樣結(jié)構(gòu)域（DEFL），其結(jié)構(gòu)域采用以半胱氨酸穩(wěn)定的α/β支架為特征的結(jié)構(gòu)。

2.6意大利蜜蜂Def-2蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

利用在線網(wǎng)站SMART對意大利蜜蜂Def-2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果（圖5）表明，意大利蜜蜂Def-2蛋白具有1個典型的Knot1型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，位于63～104位氨基酸殘基處，該區(qū)域能與DNA結(jié)合，以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。

從NCBI在線網(wǎng)站下載我國境內(nèi)蜜蜂屬的防御素氨基酸序列，包括中華蜜蜂（A.ceranacerana）、大蜜蜂（A.dorsata）、黑大蜜蜂（A.laboriosa）、小蜜蜂（A.florea）和黑小蜜蜂（A.andreniformis），以DNAMAN對意大利蜜蜂Def-2氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果（圖6）顯示，Def-2蛋白序列高度保守。

使用MEGA 11對不同蜜蜂防御素基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，在上述蜂種中意大利蜜蜂Def-2序列與小蜜蜂進(jìn)化距離較近，意大利蜜蜂Def-2蛋白保守性較高，與多重序列比對結(jié)果一致，推測其可能具有重要功能（圖7）。

2.7意大利蜜蜂Def-2蛋白String數(shù)據(jù)庫分析

通過String數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測與意大利蜜蜂Def-2蛋白發(fā)生相互作用的蛋白，結(jié)果（圖8）顯示，意大利蜜蜂Def-2蛋白與驅(qū)動蛋白樣蛋白Def-1（GB41428-PA）、GB44032-PA、Dl-2（GB42472-PA）、Imd（GB-45648-PA）、LOC406144（GB47318-PA）、LOC406142（GB51223-PA）和B-gluc1（GB42685-PA）等蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2.8 Def-2基因在意大利蜜蜂不同發(fā)育時期的表達(dá)情況

通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析Def-2基因在意大利蜜蜂不同發(fā)育時期（幼蟲期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期）基因表達(dá)水平，結(jié)果（圖9）顯示，Def-2基因在意大利蜜蜂不同發(fā)育時期的表達(dá)水平存在差異，相對表達(dá)量隨日齡增大而增加，其中在30 d成年期工蜂中的相對表達(dá)量顯著高于其他日齡（Plt;0.05）。

3討論

近年來，防御素蛋白研究多集中在人（Hoffmann et al.，1999）、羊（Poindexter et al.，2009）和小鼠（Deng et al.，2012）等，在意大利蜜蜂方面暫無相關(guān)報道，研究蜜蜂的防御素基因?qū)沂酒浞肿幼饔脵C(jī)制及開發(fā)新的抗病菌藥物具有特定意義。防御素是昆蟲體內(nèi)抵抗外界病原微生物的重要物質(zhì)，短時間內(nèi)即可有效殺滅革蘭氏陽性細(xì)菌（張愛靜等，2011），是理想的抗生素替代物（Casteels-Josson etal.，1994）。Kwak-man等（2010）研究表明，即使在10%的稀釋條件下，防御素依然具有抗菌特性。本研究分析意大利蜜蜂Def-2蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)，可為進(jìn)一步探究意大利蜜蜂防御功能及其所發(fā)揮的功能作用提供理論基礎(chǔ)。

防御素的作用機(jī)理是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)K+流失、部分內(nèi)膜產(chǎn)生去極化反應(yīng)，使ATP水平下降，抑制呼吸作用，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡（松崎勝巳，1998）。本研究通過信號肽和亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Def-2存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和高爾基體內(nèi)，推測其為分泌性蛋白，表明Def-2是分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用的，參與并維持細(xì)胞正常形態(tài)，與防御素功能一致。蛋白質(zhì)糖基化比所有其他類型的翻譯后修飾的總和更豐富，結(jié)構(gòu)更多樣化（Seitz，2000），是蛋白質(zhì)最復(fù)雜的修飾后效應(yīng)，參與許多生物過程，與多種疾病狀態(tài)密切相關(guān)。其中，N-糖基化是含糖基化數(shù)據(jù)最多的，具有位點特異性和五糖核心的特點，通過比較已知O-糖基化部位周圍的氨基酸序列，可推測出O-糖基化位點的一些規(guī)律及其酶的催化特性（劉可人等，2006）。蛋白質(zhì)磷酸化對細(xì)胞間的信號傳輸具有重要影響，主要調(diào)節(jié)蛋白的翻譯和細(xì)胞增殖活動，與幾乎所有真核細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)聯(lián)（潘劍鋒等，2023）。本研究發(fā)現(xiàn)，意大利蜜蜂Def-2蛋白無糖基化位點，僅存在15個磷酸化位點，且該蛋白質(zhì)為兩性不穩(wěn)定蛋白。

蛋白質(zhì)具有自發(fā)折疊成精準(zhǔn)確定三維結(jié)構(gòu)的能力（Kuhlman and Bradley，2019），α-螺旋可協(xié)助防御素辨識病原菌細(xì)胞膜，并錨定在病原菌膜上（Chan-drababu et al.，2009），β-折疊促使防御素小分子緊湊聚集并形成較穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可使其生物學(xué)活性更穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Def-2蛋白無規(guī)則卷曲、延伸鏈分布較多，而α-螺旋分布較少，預(yù)測的構(gòu)件元件分布大致相同，且拉曼圖也顯示該構(gòu)象為立體化學(xué)允許區(qū)，可穩(wěn)定存在，表明Def-2是一種抗菌活性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的防御素。多序列比對揭示了蛋白質(zhì)家族的同源區(qū)域，并提供該家族合成蛋白質(zhì)概貌的概述，對于可靠的系統(tǒng)發(fā)育研究、結(jié)構(gòu)域識別和潛在剪接位點的識別至關(guān)重要，并有助于啟動密碼子驗證（Thompson et al.，2000）。本研究對防御素氨基酸序列與意大利蜜蜂Def-2氨基酸序列進(jìn)行多重比對，發(fā)現(xiàn)Def-2蛋白序列高度保守，具有防御蛋白樣結(jié)構(gòu)域（DEFL），其結(jié)構(gòu)域采用以半胱氨酸穩(wěn)定的α/β支架為特征的結(jié)構(gòu)，意大利蜜蜂Def-2序列與小蜜蜂進(jìn)化距離較近，意大利蜜蜂Def-2蛋白保守性較高，與多重序列比對結(jié)果一致。分析蛋白質(zhì)相互作用的特異性是研究和重定向細(xì)胞信號通路的有效方法（Kolch et al.，2000），研究發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Def-2與驅(qū)動蛋白樣蛋白Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd、LOC406144、LOC406142和B-gluc1等蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，可推測其在蜜蜂免疫方面發(fā)揮重要作用。蜜蜂防御素差異表達(dá)取決于多種原因，如細(xì)菌狀態(tài)和細(xì)菌攝入時間（Kim etal.，2022）、熱應(yīng)激等（Li et al.，2022）。Ilyasov等（2013）研究證明，殼聚糖通過模擬微生物入侵也可刺激蜜蜂防御素基因的表達(dá)，Lin等（2022）發(fā)現(xiàn)成年工蜂表現(xiàn)出比幼年工蜂更高的先天免疫力。本研究通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Def-2蛋白在健康意大利蜜蜂不同發(fā)育時期表達(dá)水平存在明顯差異，10日齡后表達(dá)明顯上調(diào)，防御素水平隨著日齡增大而增高，且30 d的表達(dá)量顯著高于其他日齡，驗證了成年工蜂比幼年工蜂免疫力更高，表明Def-2蛋白在意大利蜜蜂機(jī)體中的大量存在，也表明其在免疫過程中具有普遍且重要的功能。

4結(jié)論

意大利蜜蜂Def-2蛋白為兩性不穩(wěn)定蛋白，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和高爾基體內(nèi)，參與細(xì)胞間信號傳輸并維持細(xì)胞正常形態(tài)；蛋白序列高度保守，親緣關(guān)系與小蜜蜂極為相近，且該基因在30 d成年期工蜂中特異性高豐度表達(dá)，推測其可能調(diào)節(jié)免疫基因轉(zhuǎn)運而影響蜜蜂的免疫識別過程。

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（責(zé)任編輯王暉）