摘 要：為了研究引起潮州市臨床患者腹瀉沙門(mén)氏菌的血清型分布、耐藥譜和分子分型特征，對(duì)2021年分離自廣東省潮州市的定點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院腹瀉患者的55株沙門(mén)氏菌，采用血清凝集法鑒定血清型、微量肉湯稀釋法檢測(cè)對(duì)17種抗生素的敏感性，脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)菌株進(jìn)行分子分型．結(jié)果顯示，在55株沙門(mén)氏菌中，主要的血清型為鼠傷寒沙門(mén)氏菌，占41.82%；其次是胥萊士亥姆沙門(mén)氏菌和瓦根尼亞沙門(mén)氏菌，均占10.91%．藥物敏感性試驗(yàn)表明，菌株對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率最高，達(dá)80.00%；其次是四環(huán)素、氯霉素和復(fù)方新諾明，分別為76.36%、50.91%和49.09%．在55株沙門(mén)氏菌中，48株沙門(mén)氏菌經(jīng)XbaⅠ內(nèi)切酶處理后獲得分子分型結(jié)果．它們共產(chǎn)生47個(gè)PFGE帶型，呈現(xiàn)高度多態(tài)性，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)PFGE帶型．該研究結(jié)果提示引起腹瀉的沙門(mén)氏菌血清型以鼠傷寒沙門(mén)氏菌為主．PAGE分子分型散在分布，表明潮州市沙門(mén)氏菌總體呈散發(fā)多態(tài)性，沒(méi)有形成大規(guī)模的流行．值得關(guān)注的是，對(duì)抗生素耐藥性及多重耐藥性嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)引起重視并持續(xù)開(kāi)展耐藥及病原學(xué)監(jiān)測(cè)．

關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌；潮州；血清型；藥物敏感性；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

中圖分類號(hào)：R 18" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" 文章編號(hào)：1007-6883（2024）03-0036-08

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2024.03.005

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是全球細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌，能夠引起患者腹痛、腹瀉、發(fā)熱、惡心等臨床癥狀［1-2］．它是腹瀉病四大全球病因之一，在全球范圍內(nèi)每年有近十分之一的人因此患病，并喪失3 300萬(wàn)個(gè)健康生命，并有接近一半的患者為五歲以下兒童［3-4］．在我國(guó)，沙門(mén)氏菌引起的細(xì)菌性食物中毒的次數(shù)居多，其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)［5-6］．近幾十年來(lái)，臨床治療對(duì)抗生素的不規(guī)范使用，畜牧業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中在動(dòng)物飼料中大量使用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑和治療藥物，使沙門(mén)氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，增加了沙門(mén)氏菌對(duì)人類和動(dòng)物健康的威脅［7］．抗藥性感染菌株，特別是多重耐藥菌株，治療難度加大．本研究的目的是了解潮州市2021年腹瀉患者沙門(mén)氏菌耐藥性，并結(jié)合脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）對(duì)菌株進(jìn)行分子分型．

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本研究采用的沙門(mén)氏菌菌株為2021年1月-12月期間，從潮州市疾病監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院采集的感染性腹瀉患者的便樣中分離的55株沙門(mén)菌，其中男31例，女24例，年齡8個(gè)月-69歲，平均（31.65±2.43）歲．全部菌株均已經(jīng)過(guò)生化鑒定復(fù)核確認(rèn)為沙門(mén)菌．沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812、大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922均由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供．

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要試劑

沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉）、沙門(mén)氏菌診斷血清（丹麥SSI）、革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（法國(guó)梅里埃）、VITEK 2革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏卡片（法國(guó)梅里埃）、蛋白酶K（德國(guó)MERCK）、限制性內(nèi)切酶Xba I（日本TakaRa）、GelRed染液（美國(guó)Biotium）、Seakem Glod瓊脂糖（美國(guó)LONZA）．

1.2.2 儀器

全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 compact（法國(guó)梅里埃）、CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）．

1.3 細(xì)菌的分離與鑒定

腹瀉（肛門(mén)拭子）標(biāo)本由SBG增菌培養(yǎng)后，接種在沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基中進(jìn)行分離，挑選可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，使用VITEK 2 compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行生化鑒定．

1.4 血清分型

將分離純化的陽(yáng)性菌株接種在血平板上，并在37 ℃下培養(yǎng)18 h．選擇單個(gè)菌落進(jìn)行O抗原載玻片凝集．然后，用沙門(mén)氏菌H相誘導(dǎo)瓊脂進(jìn)行H1和H2相鞭毛誘導(dǎo)和血清凝集．其血清型結(jié)果依據(jù)Kauffmann White抗原表進(jìn)行判讀．使用生理鹽水作為自凝對(duì)照．

1.5 抗菌藥物敏感性測(cè)試

采用微量肉湯稀釋法（依據(jù)2021食源性疾病監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)），測(cè)定沙門(mén)氏菌的最低抑菌濃度．測(cè)試藥物包括氯霉素（CHL，Chloramphenicol）、萘啶酸（NAL，Nalidixic Acid）、鏈霉素（STR，Streptomycin）、復(fù)方新諾明（SXT，Sulfamethoxazole）、頭孢噻肟（CTX，Cefotaxime）、美羅培南（MEM，Meropenem）、頭孢他啶（CAZ，Ceftazidime）、黏菌素（CT，Colistin）、厄他培南（ETP，Ertapenem）、頭孢他啶/阿維巴塔（CZA，Ceftazidime/Averbata）、阿奇霉素（AZI，Azithromycin）、環(huán)丙沙星（CIP，Ciprofloxacin）、阿米卡星（AMI，Amikacin）、氨芐西林（AMP，Ampicillin）、氨芐西林/舒巴坦（AMS，Ampicillin/Sulbactam）、四環(huán)素（TET，Tetracycline）、替加環(huán)素（TIG，Tigecycline）共計(jì)17種抗菌抗生素．實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照藥敏卡的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體包括：（1）將沙門(mén)氏菌轉(zhuǎn)種到血平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h后，挑取純培養(yǎng)后的菌落于無(wú)菌生理鹽水中反復(fù)混勻，制備成0.5-0.63麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?）取60 μL的上述菌懸液于12 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，充分混勻，以完成稀釋菌液的制備．（3）采用微量移液器取100 μL稀釋菌液加至藥敏板中．（4）37 ℃恒溫培養(yǎng)18-24 h．（5）孵育后，采用VITEK 2-compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，對(duì)藥敏板進(jìn)行讀數(shù)，輸出結(jié)果．根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷，判定結(jié)果用耐藥（R）、中介（I）和敏感（S）表示，耐3種及以上的抗菌藥物的菌株判為多重耐藥（MDR，Multiple drug resistance），大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株．

1.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

參照國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)技術(shù)手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌PFGE方法，對(duì)沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行PFGE分析．使用沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為標(biāo)準(zhǔn)．選用XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812的XbaI的酶切片段為分子量標(biāo)準(zhǔn)．電泳儀初始轉(zhuǎn)換時(shí)間為2.2 s，終末轉(zhuǎn)換時(shí)間為63.8 s，電泳時(shí)間為19 h．電泳結(jié)束后，用GelRed染色后脫色，采用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖譜．使用BioNumerics 7.6軟件分析PFGE指紋圖譜，設(shè)置DICE相關(guān)系數(shù)為1.5%，經(jīng)非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均數(shù)（UPGMA）進(jìn)行聚類分析．參照Tenover判讀方法，相似度100%認(rèn)定為同一PFGE帶型，相似度85%以上為同一聚類．

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)菌血清型鑒定結(jié)果

2021年期間，從潮州市疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中分離出55株沙門(mén)氏菌分離株，鑒定為19種血清型．如圖1所示，鼠傷寒沙門(mén)氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，分離率為41.82%（23/55），其次為胥萊士亥姆沙門(mén)氏菌和瓦根尼亞沙門(mén)氏菌，分離率各占10.91%（6/55）．其余各型菌株數(shù)量較少．在鑒定的55株沙門(mén)氏菌中，19種血清型分為5個(gè)血清組：B組（10種血清型，占78.18%）、C1組（4種血清型，占7.27%）、C2組（2種血清組，占5.45%）、D組（1種血清組，占3.64%）和E1組（2種血清組，占5.45%）．其中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌血清型在B組（優(yōu)勢(shì)血清組）最常見(jiàn)，患病率為53.49%．結(jié)果顯示，潮州市的沙門(mén)氏菌型別十分復(fù)雜，呈多態(tài)性，且存在強(qiáng)流行株．

2.2 沙門(mén)菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1顯示了55株沙門(mén)氏菌對(duì)17種抗生素的藥物敏感性測(cè)試結(jié)果．藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率最高（44/55，80.00%），對(duì)四環(huán)素耐藥率其次42/55（76.36%），對(duì)美羅培南、厄他培南、阿米卡星和黏菌素的耐藥率最低（0/55，0.00%）．17種抗生素的耐藥率在0.00%-80.00%之間．在不同血清型菌株的檢測(cè)中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌株的耐藥率（22/23，95.65%）明顯高于55株沙門(mén)氏菌的總體耐藥率（50/55，90.91%）．此外，鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率最高（21/23，91.30%）也明顯高于55株沙門(mén)氏菌的總體耐藥率（44/55，80.00%）．

多重耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，在全部55株分離菌的檢測(cè)中，對(duì)所有抗菌藥物均敏感的菌株有5株（占9.09%），其余50株（占90.91%）對(duì)至少1種抗菌藥物耐藥．55株沙門(mén)氏菌共產(chǎn)生19種耐藥圖譜，主要耐藥譜為CHL+SXT+AMP+TET（14/55，25.45%）．耐藥種類在3種及以上的沙門(mén)氏菌分離株占72.72%（40/55）；耐藥種類在4種的沙門(mén)氏菌分離株最多，占36.36%（20/55）；多重耐藥最嚴(yán)重的沙門(mén)氏菌分離株可以耐8種藥物，占3.64%（2/55）．從不同的血清型來(lái)看，鼠傷寒沙門(mén)氏菌多重耐藥率（20/23，86.96%）明顯高于55株沙門(mén)氏菌總體多重耐藥率（40/55，72.72%）．

結(jié)果表明，2021年潮州市以沙門(mén)氏菌為代表的腸道致病菌耐藥情況十分嚴(yán)峻，對(duì)8類17種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，且多重耐藥情況較為嚴(yán)重．

2.3 沙門(mén)菌PFGE分型結(jié)果

55株沙門(mén)氏菌經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I酶切后，如圖3所示，得到48個(gè)PFGE圖譜（7株因DNA降解未獲得圖譜），條帶圖譜相似度為29.5%-100%．按照菌株間相似性100%視為同一帶型，48株沙門(mén)氏菌分為47個(gè)PFGE帶型，分別命名為S1型-S47型，其中僅有S22型包含2株菌，其余46種帶型均為1株，無(wú)明顯的同源表現(xiàn)．根據(jù)85%相似性標(biāo)準(zhǔn)可分為32個(gè)聚類，相似度達(dá)到85%以上的克隆系有9個(gè)，每個(gè)克隆系包含2株-4株菌．另外PFGE指紋圖譜聚集性與血清型不存在明顯的關(guān)聯(lián)性，同一血清型的沙門(mén)氏菌帶型存在差異，表現(xiàn)為較大的遺傳多樣性．結(jié)果表明2021年潮州市沙門(mén)氏菌分子分型呈現(xiàn)多態(tài)性，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)PFGE帶型，全年以零星散發(fā)為主，顯示了沙門(mén)氏菌的基因多態(tài)性和傳播的復(fù)雜性．

3 討 論

沙門(mén)氏菌是一種重要且廣泛的人畜共患病原體，可導(dǎo)致食物中毒和傳染性腹瀉［5］．所有沙門(mén)氏菌血清型都可能導(dǎo)致潛在的危及生命的疾?。虼?，了解沙門(mén)氏菌血清型在特定地區(qū)的分布有助于預(yù)防沙門(mén)氏菌的流行．2021年期間，潮州市檢出的55株沙門(mén)氏菌，分屬于19種血清型，說(shuō)明潮州市沙門(mén)氏菌菌型呈多態(tài)性，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌（41.82%）最常見(jiàn)，與濟(jì)南市［8］、南京市［9］、長(zhǎng)沙市［10］、茂名市［11］研究結(jié)果一致，而北京［12］、寧夏［13］地區(qū)以腸炎沙門(mén)氏菌流行為主．歐盟關(guān)于人獸共患病的報(bào)道中，腸炎沙門(mén)菌是引起歐洲腹瀉的主要病原［14］，這表明優(yōu)勢(shì)血清型存在地域差異，而不同血清型沙門(mén)氏菌的致病菌不同，提示不同地區(qū)沙門(mén)氏菌引起的感染癥狀和程度可能不同．因此，持續(xù)監(jiān)測(cè)沙門(mén)氏菌是必要的．

細(xì)菌耐藥性已成為一個(gè)重要問(wèn)題．抗生素在農(nóng)業(yè)中的廣泛使用和臨床實(shí)踐中抗生素的不合理使用導(dǎo)致了包括沙門(mén)氏菌在內(nèi)的細(xì)菌的耐藥性［15-17］．結(jié)果表明，潮州地區(qū)沙門(mén)氏菌耐藥性較為嚴(yán)重；55株沙門(mén)氏菌中有5株對(duì)所有17種抗生素敏感，其余50株對(duì)至少1種抗生素具有耐藥性，其中對(duì)氨芐西林/舒巴坦耐藥率最高，其次為四環(huán)素、氯霉素和復(fù)方新諾明．這與其他城市沙門(mén)氏菌的耐藥性不一致［8，18-20］，可能與不同地區(qū)臨床用藥的差異有關(guān)．值得注意的是，潮州市沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率高達(dá)80.00%，高于北京（63.08%）［12］、中山市（51.4%）［21］、臺(tái)州市（32.95%）［22］，這可能與氨芐西林/舒巴坦作為非限制使用抗菌藥物，臨床使用廣泛有關(guān)．因氨芐西林/舒巴坦的高耐藥性，其已不能用于沙門(mén)氏菌感染的臨床治療藥物．但本市沙門(mén)氏菌對(duì)鏈霉素的耐藥性明顯低于馬琳等［12，23］報(bào)道的北京市以及龍利［18］報(bào)道的貴州省．提示不同地區(qū)沙門(mén)菌對(duì)抗生素的耐藥性存在差異，臨床上應(yīng)根據(jù)本地區(qū)實(shí)際情況合理調(diào)整抗生素的使用．

另外，沙門(mén)氏菌的多重耐藥性日益嚴(yán)重．在55株沙門(mén)氏菌中，40株為耐多藥菌株，占72.72%，高于2016年-2020年遼寧省沙門(mén)氏菌多重耐藥率（48.90%）［24］以及2019年-2020年南京市沙門(mén)氏菌多重耐藥率（64.2%）［9］，且本市沙門(mén)氏菌耐藥譜呈現(xiàn)多樣化，提示耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中耐5種及以上抗生素的有18株，占32.73%，這意味著一旦出現(xiàn)沙門(mén)氏菌多重耐藥菌引起的疾病爆發(fā)，將難以選擇有效抗生素治療，值得關(guān)注．

PFGE在分子水平上分析菌株之間的關(guān)系，可以監(jiān)測(cè)、追蹤和識(shí)別菌株［25-26］．由于其高重復(fù)性和可靠性，它被認(rèn)為是細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”［27-29］．使用PFGE，可以建立沙門(mén)氏菌數(shù)據(jù)庫(kù)，以快速追蹤食源性疾病爆發(fā)的源頭，防止疾病傳播，并澄清不同地區(qū)和年份沙門(mén)氏菌之間的遺傳關(guān)系，評(píng)估沙門(mén)氏菌的流行病學(xué)特征．本文對(duì)48株沙門(mén)氏菌進(jìn)行PFGE分子分型，共分成了47個(gè)不同的帶型，提示該地的沙門(mén)氏菌基因非常復(fù)雜，和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的研究也基本一致［8，21，30］．同一血清型別的沙門(mén)氏菌有多個(gè)PFGE型別，表現(xiàn)為較大的遺傳多樣性，說(shuō)明鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有廣泛的來(lái)源，表明潮州市沙門(mén)氏菌總體呈散發(fā)多態(tài)性，沒(méi)有形成大規(guī)模的流行．值得注意的是，血清型不同的沙門(mén)氏菌也會(huì)出現(xiàn)類似的圖譜．這與顏淑嫵等［30-31］的研究相類似，其原因可能是菌株在不同宿主和環(huán)境之間的轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生了基因轉(zhuǎn)移、插入或丟失．因此，下一步應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測(cè)范圍，不斷建立和完善潮州市沙門(mén)氏菌PFGE分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，為流行病學(xué)溯源和防控預(yù)警提供依據(jù)．

4 結(jié) 論

本研究分析了廣東省潮州地區(qū)患者腹瀉標(biāo)本中沙門(mén)氏菌菌株的特征．潮州市沙門(mén)氏菌的血清型多樣化，耐藥性較為嚴(yán)重，耐多藥菌株普遍，PFGE帶型呈高度多態(tài)性．本研究的數(shù)據(jù)將有助于對(duì)本地沙門(mén)氏菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為防控沙門(mén)氏菌提供參考依據(jù)．

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Drug Resistance and Molecular Typing of Clinical Salmonella in Chaozhou City

HUANG Jia-tong1，WEI Si-qi1，LIN Li-yun1，LIN Min1，WEN Jin-zhou2*

（1. College of Life Sciences and Food Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong，521041; 2. Chaozhou Center for Disease Control and Prevention，Chaozhou，Guangdong，521041）

Abstract：In order to study the serotype distribution，drug resistance profile and molecular typing characteristics of Salmonella causing diarrhea in clinical patients in Chaozhou City，Guangdong Province，this study was conducted on 55 strains of Salmonella isolated from patients with diarrhea in designated monitoring hospitals in Chaozhou City，Guangdong Province，in 2021，and serotypes were identified by serum agglutination method，susceptibility to 17 antibiotics was detected by micro-broth dilution method，and molecular typing was performed on the strains by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）. The results showed that among the 55 Salmonella strains，the major serotype was Salmonella typhimurium，accounting for 41.82%，followed by Salmonella schleissheim and Salmonella wagenia，both accounting for 10.91%. Drug susceptibility testing showed that the strain had the highest resistance to ampicillin/sulbactam at 80.00%，followed by tetracycline，chloramphenicol and sulfamethoxazole at 76.36%，50.91% and 49.09%，respectively. Among the 55 Salmonella strains，48 Salmonella strains were treated with XbaⅠ endonuclease to obtain molecular typing results. They produced a total of 47 PFGE banding patterns，showing a high degree of polymorphism，with no obvious dominant PFGE banding pattern. The results of this study suggest that the serotypes of Salmonella causing diarrhea are dominated by Salmonella typhimurium，and the scattered distribution of PFGE molecular typing suggests that Salmonella in Chaozhou City is generally polymorphic，and there is no large-scale epidemic. It is worth noting that there is a high level of antibiotic resistance and multidrug resistance，and attention should be paid to continuous monitoring of drug resistance and pathogenesis.

Key words：Salmonella；Chaozhou City；serotype；drug susceptibility；pulsed field gel electrophoresis（PFGE）

責(zé)任編輯 周春娟