摘 要：從活性污泥中得到1株具有很強(qiáng)絮凝活性的貝萊斯芽孢桿菌菌株，以高嶺土懸濁液絮凝沉淀法，通過對(duì)取樣點(diǎn)菌種發(fā)酵液的絮凝效果進(jìn)行篩選，分離得到1株高活性絮凝活性菌株W-5，經(jīng)16S rDNA序列分析，菌株W-5為貝萊斯芽孢桿菌YL2021株．實(shí)驗(yàn)考察了菌株對(duì)水體中氨氮和NO3--N和NO2--N的去除能力，發(fā)現(xiàn)菌株W-5有明顯氨氮去除效果，且對(duì)水體中NO3--N和NO2--N也具有一定的去除作用．后續(xù)工作將繼續(xù)開展W-5的異養(yǎng)硝化－好氧反硝化（HN-AD）研究，旨在開發(fā)一株新型水處理菌種，用于生活污水絮凝和水中氨氮的去除．

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；絮凝劑；氨氮去除；硝化-反硝化

中圖分類號(hào)：X 52" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" 文章編號(hào)：1007-6883（2024）03-0024-07

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2024.03.003

絮凝劑是一類可以使液體中的膠體和懸浮顆粒絮凝成較大的絮凝體并沉淀下來的物質(zhì)，隨著水處理技術(shù)的發(fā)展，絮凝劑在水處理中的應(yīng)用越來越廣泛．目前，絮凝劑的種類主要包括無機(jī)絮凝劑（如鋁鹽類和鐵鹽類無機(jī)絮凝劑），有機(jī)絮凝劑（如聚丙烯酰胺、改性淀粉等），復(fù)合絮凝劑和微生物絮凝劑［1］．微生物絮凝劑是一類由微生物或其分泌物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是一種高效、無毒、可消除二次污染的有機(jī)高分子物質(zhì)．與傳統(tǒng)絮凝劑相比，微生物絮凝劑的二次污染小、安全性高、易被微生物降解、對(duì)環(huán)境友好，應(yīng)用領(lǐng)域比其他絮凝劑寬泛．由于微生物絮凝劑能夠克服無機(jī)絮凝劑和合成有機(jī)絮凝劑的多種缺陷，已成為國(guó)內(nèi)外新型水處理劑的研究熱點(diǎn)，被稱為第3代絮凝劑［2-4］．

在眾多絮凝劑產(chǎn)生菌株中，芽孢桿菌屬菌株以高效、安全、多功能的特點(diǎn)［5-7］．貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的一個(gè)新種，廣泛分布于自然界的水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動(dòng)物腸道等［8］．近年來，國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的報(bào)道越來越多，研究主要集中在促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、抑菌物質(zhì)及其基因簇鑒定、拮抗作用機(jī)制等方面［9-12］．該菌在生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)應(yīng)用等方面具有重要作用．

本研究從一處活性污泥中篩選并分離出一株具有絮凝活性的微生物菌株，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌．本文研究了該株貝萊斯芽孢桿菌的絮凝性能及對(duì)水體氨氮的去除能力，為研發(fā)多菌群聯(lián)合絮凝劑做好理論基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 樣品收集

活性污泥采自廣東省潮州市西湖，采樣點(diǎn)采樣三處，樣品4 ℃冷藏保存．

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨2.0 g，酵母提取物1.0 g，NaCl 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基瓊脂添加量為20.0 g，121℃滅菌20 min．

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基瓊脂添加量為20.0 g，121 ℃滅菌20 min．

基礎(chǔ)無機(jī)（BIM）培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO4 1.0 g．蒸餾水1 000 mL．培養(yǎng)基pH 7.0-7.2．

1.3 菌株的富集、分離和篩選

富集培養(yǎng)：活性污泥按10%配成懸濁液，震蕩30 min，1 000 rpm離心取上清液．按10%接種量接種污泥上清液于LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)24 h．

菌株分離：采用平板劃線分離，挑取培養(yǎng)液于肉湯培養(yǎng)基表面劃線分離，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)．如此反復(fù)多次，直至分離出單菌落．根據(jù)菌落特征選取不同菌落菌種接種至斜面培養(yǎng)基，革蘭氏染色初步檢測(cè)．

菌株的初篩：將純化后的單一菌株分別接種到裝有100 mL肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)的三角瓶中，37 ℃、150 r/min，搖床培養(yǎng)24 h．

1.4 高嶺土懸濁液的制備

本實(shí)驗(yàn)以高嶺土沉降法作為絮凝劑選擇標(biāo)準(zhǔn)［13］．懸濁液配置如下：高嶺土4 g，加入蒸餾水1 L，磁力攪拌30 min，現(xiàn)用現(xiàn)配．助凝劑選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的CaCl2．

1.5 絮凝活性的測(cè)定方法

200 mL燒杯內(nèi)加入配置好的高嶺土懸濁液100 mL，檢測(cè)組加入2 mL菌株發(fā)酵液，200 r/min攪拌3 min，靜置．每10 min定點(diǎn)取樣，測(cè)上清液在550 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算絮凝率．

計(jì)算公式為[μ=（A-B）/A×100%]．

其中，[μ]表示絮凝率，A表示參照上清液的濁度，B表示加入發(fā)酵液絮凝之后上清液的濁度［3］．

1.6 菌株16SrDNA序列分析及鑒定

對(duì)篩選到的菌株委托華大基因公司經(jīng)過提取DNA、PCＲ擴(kuò)增、連接轉(zhuǎn)化等操作，對(duì)所選菌株進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)序，應(yīng)用BLAST程序、NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行搜索、同源性分析、菌株分子生物學(xué)鑒定．

1.7 絮凝菌株對(duì)水體氨氮的去除

水體氨氮，NO3--N和NO2--N的含量檢測(cè)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方案執(zhí)行．氨氮：納氏試劑分光光度法，亞硝酸鹽：N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，硝態(tài)氮：紫外分光光度法［13-15］；菌體生長(zhǎng)量，測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD600）．

絮凝菌株對(duì)水體氨氮的去除采用林而舒等的方法［16］，步驟如下：以BIM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為7.0-7.2，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌株發(fā)酵液1 mL接種至100 mL滅菌后的培養(yǎng)基中，三角瓶置搖床，培養(yǎng)24 h．期間檢測(cè)培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)量（OD600）、水體氨氮、NO3--N和NO2--N的濃度．初始培養(yǎng)條件為NH4+-N（NH4Cl），初始質(zhì)量濃度為100 mg/L，以檸檬酸鈉為碳源（C/N=10），實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和鑒定

經(jīng)固體平板劃線分離，從取樣點(diǎn)活性污泥中得到的單菌落中根據(jù)菌落特征，挑取30株單菌落，編號(hào)為W-1、W-2至W-30．所選菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，以對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝活性為指標(biāo)檢測(cè)其絮凝性能（圖1），發(fā)現(xiàn)其中1株菌對(duì)高嶺土懸濁液有明顯絮凝作用，40 min后其絮凝效果分別可達(dá)95.3%，將該菌命名為W-5做進(jìn)一步檢測(cè)，其菌落表面粗糙、灰白色、不透明．革蘭氏染色初步檢測(cè)該菌株為G+．菌株絮凝性能復(fù)檢后，取菌液送華大基因有限公司進(jìn)行16SrDNA序列分析檢測(cè)．

2.2 16SrDNA序列測(cè)序

菌株W-5，經(jīng)DNA提取、PCＲ擴(kuò)增、連接轉(zhuǎn)化等操作，應(yīng)用BLAST程序、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行同源性分析，進(jìn)行菌株鑒定．結(jié)果表明W-5菌株的16SrDNA序列與貝萊斯芽孢桿菌株YL2021株完全吻合（Description：Bacillus velezensis strain YL2021 chromosome，complete genome．Query Cover： 100%）．貝萊斯芽孢桿菌最早是Ruiz-García等從位于西班牙馬拉加省（Málaga）拖雷德爾馬爾（Torredelmar）地區(qū)的一條名為貝萊斯河流（Vélez）的河口中分離的，因此被命名為貝萊斯芽孢桿菌．

2.3 影響菌體絮凝效率的因素

為更全面了解菌株W-5的絮凝性能，研究了絮凝靜置時(shí)間、絮凝劑投加量、溫度、pH對(duì)其絮凝效果的影響．

2.3.1 靜置時(shí)間對(duì)絮凝效率的影響

加入絮凝劑后，每10 min測(cè)定一次其絮凝效果，發(fā)現(xiàn)菌株W-5在30 min內(nèi)隨靜置時(shí)間增加絮凝效果增強(qiáng)，絮凝效果最高可達(dá)93.2，但隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，40 min后絮凝效果趨于穩(wěn)定，沒有明顯增強(qiáng)（圖2）．因此后續(xù)研究，均選擇絮凝靜置時(shí)間為30 min后檢測(cè)絮凝效果．

2.3.2 絮凝劑投加量對(duì)絮凝效率的影響

在相同絮凝條件下（pH=7.2，［Ca2+］=0.1%，25 ℃），研究了不同絮凝劑的添加量對(duì)絮凝活性的影響（菌液量1%-4%），當(dāng)絮凝菌使用量從1%增至2%，體系絮凝活性均呈明顯上升．當(dāng)絮凝菌添加量大于3%時(shí)，絮凝活性開始下降，且絮凝活性下降幅度與絮凝劑添加量明顯相關(guān)（圖3a）．可能隨著大量絮凝劑的存在，膠體體系粘度增加，不容易發(fā)生絮凝沉淀．

2.3.3 pH對(duì)絮凝活性的影響

采用HCl（0.2 mo/L）和NaOH（0.2 mo/L）將高嶺土絮凝體系分別調(diào)節(jié)為pH=3.0，5.0，7.0以及10.0，其余條件同2.3.1，考察了不同pH對(duì)絮凝菌株絮凝性能的影響（圖3b）．結(jié)果表明絮凝體系pH能明顯影響菌株W-5的絮凝性能，中性條件W-5的絮凝效果最強(qiáng)，偏酸或偏堿均能影響其絮凝性能．且體系pH為10.0時(shí)，助凝劑Ca2+從體系中沉淀出來，也會(huì)對(duì)菌株的絮凝效果造成影響．生物絮凝劑多為大分子物質(zhì)，體系pH的改變影響了絮凝劑及絮凝體系的電荷分布，從而影響了菌株的絮凝性能．

2.3.4 Ca2+對(duì)絮凝活性的影響

一般絮凝實(shí)驗(yàn)中，常用Ca2+（CaCl2）作為助凝劑．為此考察了Ca2+對(duì)W-5菌株絮凝活性的影響．根據(jù)實(shí)驗(yàn)2.3.1和2.3.2，選擇絮凝劑為2%的投加量，其余條件不變，研究Ca2+的量對(duì)W-5菌株絮凝活性的影響．結(jié)果表明：絮凝體系中Ca2+存在有明顯助絮凝作用，但并非Ca2+越多越好，體系中濃度為0.1%即可起到明顯助絮凝作用（圖4a）．

2.3.5 溫度對(duì)絮凝活性的影響

溫度對(duì)W-5的絮凝性能影響明顯，本實(shí)驗(yàn)考察了不同溫度（10 ℃，25 ℃，30 ℃，45 ℃）下絮凝劑的絮凝性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫條件下（10 ℃），絮凝劑的效果往往會(huì)降低，隨溫度升高，絮凝劑的效果隨之加強(qiáng)（圖4b）．在低溫下水的粘度會(huì)增加，使得絮凝劑在水中的擴(kuò)散變慢，懸浮顆粒的聚集過程也會(huì)變慢．因此，在冷水中，可能需要更多的絮凝劑，或者需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到理想的處理效果．高溫可以降低水的粘度，使得絮凝劑在水中擴(kuò)散更快，懸浮顆粒的聚集過程也會(huì)加速．此外，高溫還能促進(jìn)某些化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，從而提高絮凝劑的效果．但需要注意的是，如果溫度過高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，而且會(huì)影響某些絮凝劑的穩(wěn)定性，導(dǎo)致絮凝效果降低．

2.4 不同液體體系的絮凝性能分析

為了進(jìn)一步研究絮凝菌株的絮凝性能，分別比較了菌體/水，菌體/發(fā)酵液和無菌體發(fā)酵液的不同絮凝性能，發(fā)現(xiàn)不同體系絮凝性能有很大的差異，W-5菌株的最佳絮凝性能在菌體/發(fā)酵液體系中，無菌體發(fā)酵液絮凝性能次之，菌體的絮凝性能最低（圖5）．初步分析菌株W-5的絮凝物質(zhì)主要為菌膜，當(dāng)菌膜分布在發(fā)酵液中，發(fā)酵液也具有了一定的絮凝性能．但菌體離心分離后，菌膜與菌體分離，因此菌體表現(xiàn)出較低的絮凝性能．

2.5 絮凝菌株對(duì)水體氨氮的去除研究

絮凝菌株W-5以NH4Cl為單一氮源、檸檬酸鈉為碳源（C/N=10）時(shí)，菌株對(duì)水體氨氮的去除效果如圖6所示，菌株W-5在接種24 h內(nèi)，對(duì)培養(yǎng)基中的氨氮去除效果明顯，至24 h后去除率達(dá)68%，且培養(yǎng)體系中的氨氮濃度與菌體OD600值明顯呈相關(guān)性，菌體越多，培養(yǎng)體系中對(duì)氨氮的處理能力越強(qiáng)，培養(yǎng)體系中剩余的氨氮越少（圖6a）．在相同菌體密度下，對(duì)體系中NO3--N和NO2--N的檢測(cè)中，隨菌株W-5的生長(zhǎng)，其培養(yǎng)體系的NO3--N和NO2--N也不斷下降，發(fā)現(xiàn)菌株W-5對(duì)體系中NO3--N和NO2--N有很強(qiáng)的去除能力（圖6b）．后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)研究W-5菌株水體中各類N的去除能力．

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)篩選到的微生物絮凝菌株W-5具有明顯絮凝能力，助凝劑Ca2+能明顯提高菌株的絮凝性能，菌株最佳絮凝pH為中性環(huán)境，環(huán)境偏酸或偏堿會(huì)影響菌株的絮凝性能．經(jīng)鑒定，菌株為貝萊斯芽孢桿菌YL2021（Bacillus+velezensis YL2021）．另外，考察了菌株對(duì)水體中氨氮、NO3--N和NO2--N的去除能力，發(fā)現(xiàn)菌株W-5均有明顯氨氮去除效果，且對(duì)氨氮、NO3--N和NO2--N的去除能力與體系菌密度相關(guān)．

2016年以來，關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的相關(guān)研究論文、專利呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，該菌在生物防治［17］、藥物研發(fā)［18］、食品發(fā)酵和工業(yè)應(yīng)用［19］等方面具有重要作用［20］，而且該菌在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著的優(yōu)點(diǎn)［21］．2019年，解玉萌等研究了一株芽孢桿菌HC，發(fā)現(xiàn)菌株HC對(duì)無機(jī)氮的去除作用顯著，其對(duì)氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的去除率分別為92.0%、85.9%和25.1％，在養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控中具有一定應(yīng)用潛力［22］．本研究也發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌具有很強(qiáng)的絮凝作用和對(duì)水體氨氮的去除能力．因此，貝萊斯芽孢桿菌應(yīng)用于水處理中，必將有更大的發(fā)展前景，后續(xù)研究將進(jìn)一步研究菌株W-5的硝化和反硝化能力．初步研究表明，菌株W-5對(duì)水體中無機(jī)氮有高效去除能力，其在污水處理和養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值．

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Isolation and Identification of a Strain of Bacillus velezensis and the Study on Its Water Purification Effect

LI Gang，YANG Dong-juan，GUO Shou-jun，LIU Jing-ru，ZHU Xiao-ting，LUO Ya-ting

（College of Life Sciences and Food Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong，521041）

Abstract：A strain of Bacillus velezensis with strong flocculation activity was obtained from activated sludge. The kaolin suspension flocculation precipitation method was used to screen the flocculation effect of the fermentation broth of bacterial strains at the sampling point. Finally，one highly active flocculation activity strain W-5 was isolated. After 16SrDNA sequence analysis，the strain W-5 was identified as Bacillus velezensis strain YL2021. The experiment investigated the removal ability of the strain on ammonia nitrogen，NO3--N，and NO2--N in water，and found that the strain W-5 had a significant ammonia nitrogen removal effect，and that it also had a certain removal effect on NO3--N，and NO2--N in water. The follow-up work will continue to carry out research on heterotrophic nitrification aerobic denitrification（HN-AD）of W-5，aiming to develop a new type of water treatment bacterial strain for flocculation of domestic wastewater and removal of ammonia nitrogen in water.

Key words：Bacillus velezensis；flocculant；ammonia nitrogen removal；nitrification-denitrification

責(zé)任編輯 周春娟