doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.013

收稿日期：2023-12-20

基金項目：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院財政種業(yè)創(chuàng)新研究項目（2023ZYCX011）

作者簡介：吳鵬飛（1991-），男，河北衡水人，博士，助理研究員，主要從事家禽育種研究工作。（E-mail）wu_p_fei@163.com

通訊作者：夏樹立，（E-mail）tjxmsxshl@sina.com

摘要：" 天津猴雞是中國珍貴的裸頸雞遺傳資源，為在全基因組范圍內(nèi)探究其裸頸發(fā)育相關(guān)基因，本研究采集天津猴雞雜交F1代裸頸雞和常羽雞頸部皮膚組織用于轉(zhuǎn)錄組測序。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）結(jié)果顯示，識別到的10個基因模塊中只有藍綠色（turquoise）和藍色（blue）基因模塊與裸頸表型顯著相關(guān)，共計583個基因；GO功能富集分析富集到脂滴組織、甘油三酯儲存負調(diào)控以及肌肉收縮等脂肪和肌肉相關(guān)生物學(xué)過程等條目；KEGG通路分析也富集到多條脂肪代謝相關(guān)通路，包括PPAR信號通路和甘油酯代謝等；蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示ACTN2基因編碼的蛋白質(zhì)的連通性最高，其次是MYL10基因編碼的蛋白質(zhì)，另外，還發(fā)現(xiàn)多個密切參與毛囊發(fā)育的基因，包括SOX9和PPARGC等。本研究結(jié)果將為進一步揭示并完善雞裸頸的形成和發(fā)育奠定基礎(chǔ)，同時對天津猴雞的保護、開發(fā)和利用具有重要意義。

關(guān)鍵詞：" 天津猴雞；裸頸性狀；加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

中圖分類號：" S831.2""" 文獻標識碼：" A"" "文章編號：" 1000-4440（2024）05-0881-09

Exploration of genes related to the naked neck trait in Tianjin-monkey chickens based on WGCNA

WU Pengfei1，2，3，" XIA Shuli1，2，3，" YU Haitao1，2，3，" ZHAO Xianghua1，2，3，" WANG Kang4

（1.Institute of Animal Science and Veterinary， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China;2.Tianjin Key Laboratory of Animal Molecular Breeding and Biotechnology， Tianjin 300381， China;3.Tianjin Engineering Research Center of Animal Healthy Farming， Tianjin 300381， China;4.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract：" Tianjin-monkey chicken is a precious genetic resource of naked neck chicken in China. To identify genes related to the naked neck phenotype at the whole-genome level， we collected neck skin tissue from the hybrid F1 generation of Tianjin-monkey chickens for transcriptome sequencing. The results showed that among the 10 gene modules identified by weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）， only the turquoise and blue modules were significantly associated with the naked neck phenotype， comprising a total of 583 genes. GO enrichment analysis revealed biological process terms related to fat and muscle， including lipid droplet organization， negative regulation of triglyceride storage and muscle contraction. KEGG pathway analysis also identified multiple pathways related to fat metabolism， such as PPAR signaling pathway and glycerolipid metabolism. Protein-protein interaction network analysis revealed that the protein encoded by ACTN2 had the highest connectivity， followed by the protein encoded by MYL10. Furthermore， several genes closely involved in hair follicle development， such as SOX9 and PPARGC， were also found. The results of this study can lay a foundation for further revealing and improving the formation and development of naked neck in chickens. Moreover， it is of great significance for the protection， development， and utilization of Tianjin-monkey chicken.

Key words：" Tianjin-monkey chicken;naked neck trait;weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）

禽肉和禽蛋在市場上廣受消費者歡迎，禽肉富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，并含有少量飽和脂肪酸；禽蛋是最常見的動物蛋白質(zhì)來源之一，除維生素、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)外還含有豐富的抗氧化劑，如葉黃素和玉米黃質(zhì)對眼睛健康大有裨益。過去幾十年家禽產(chǎn)業(yè)在世界范圍內(nèi)獲得快速發(fā)展，然而高密度飼養(yǎng)伴隨著全球氣候變暖以及夏季高溫造成的熱應(yīng)激對家禽養(yǎng)殖的威脅越來越嚴重。雞是恒溫動物，成年個體體溫維持在41～42 ℃，蛋雞最適環(huán)境溫度為19～20 ℃，肉雞最適環(huán)境溫度為18～22 ℃，環(huán)境溫度過高可能會打破雞體內(nèi)產(chǎn)熱和散熱的動態(tài)平衡，導(dǎo)致熱應(yīng)激從而影響家禽的健康和生產(chǎn)性能。裸頸雞主要分布于熱帶地區(qū)，尤其是高溫潮濕氣候地區(qū)，由于羽毛覆蓋率比常羽雞低，裸頸雞具有明顯的抗熱應(yīng)激特性。天津猴雞屬于裸頸雞的一種，屬肉蛋兼用型地方品種，是中國珍貴的裸頸雞遺傳資源。

研究結(jié)果表明，裸頸性狀由裸頸基因Na控制，位于常染色體，不完全顯性遺傳，該基因能減少雞的羽毛覆蓋率（相對于體重），與常羽雞相比裸頸雜合個體（Nana）和純合個體（NaNa）羽毛覆蓋率分別減少20%和40%。Na基因起初被認為位于1號染色體上，之后法國一個研究團隊將其定位于3號染色體長臂的一段區(qū)域內(nèi)，并通過SNP標記縮小該區(qū)域至770 kb，最終，通過檢測該區(qū)域內(nèi)基因的表達量鑒定到BMP12是裸頸發(fā)育的關(guān)鍵基因。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是一類生長因子，在胚胎發(fā)育、成骨、骨骼重塑和骨骼再生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，對毛囊的發(fā)育也起到重要作用，研究人員在對雞和小鼠皮膚的顯微結(jié)構(gòu)模型研究中發(fā)現(xiàn)，BMP家族成員是羽毛基板形成的抑制因子，而Wnt/β-catenin和FGF是其激活因子。

然而，生物體的發(fā)育是復(fù)雜多樣的，裸頸的發(fā)生必然是多基因共同作用的結(jié)果，本研究以裸頸雞天津猴雞為研究對象，采集頸部組織用于轉(zhuǎn)錄組測序，通過WGCNA分析在全基因組范圍內(nèi)尋找與裸頸相關(guān)的基因，以期為天津猴雞的保種、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

本研究將48羽天津猴雞公雞與240羽海蘭褐母雞進行雜交，在F1代中，裸頸雞和常羽雞的個體數(shù)均在300羽左右。300日齡時，在F1代裸頸雞和常羽雞中分別選擇10羽（5羽公雞和5羽母雞），共20羽個體，采集頸部皮膚組織用于轉(zhuǎn)錄組測序分析，試驗具體分4組：組1，雜交F1代常羽公雞（ZYG）；組2，雜交F1代常羽母雞（ZYM）；組3，雜交F1代裸頸公雞（ZWG）；組4：雜交F1代裸頸母雞（ZWM）。

1.2" 試驗方法

利用TRIzol（英杰生命技術(shù)有限公司產(chǎn)品）試劑采用常規(guī)方法提取組織總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計（賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品）鑒定RNA純度并定量；利用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷倫科技有限公司產(chǎn)品）評估RNA完整性；使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）進行轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。最后，委托上海歐易生物技術(shù)有限公司對文庫進行測序分析，使用的測序平臺為llumina Novaseq 6000，最終生成150 bp的雙端read，用于后續(xù)分析。

1.3" 統(tǒng)計分析

利用Fastp軟件對raw read進行處理，去除低質(zhì)量read后獲得clean read。使用HISAT 2軟件將clean read與參考基因組比對，通過HTSeq-count獲得每個基因的read數(shù)，并進行基因表達量（FPKM）計算。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）以測序獲得的所有基因的FPKM表達矩陣文件為基礎(chǔ)，進行表型相關(guān)基因模塊挖掘，采用R軟件中的WGCNA包進行分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" WGCNA篩選裸頸相關(guān)基因模塊

本研究對裸頸雞裸頸部位皮膚組織和常羽雞頸部皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，在20個樣本的原始數(shù)據(jù)中共檢測到16 859個基因，將所有組別中基因表達量變化不明顯（標準偏差≤0.5）的基因剔除，最終剩余1 407個基因用于后續(xù)分析。WGCNA分析可以識別高度相關(guān)性基因所組成的基因簇，最終可根據(jù)基因模塊中核心基因?qū)⒛K與表型進行關(guān)聯(lián)分析。本研究中設(shè)置決定系數(shù)（R 2）＞0.8，軟閾值（β）=20。利用Dynamic Tree Cut方法共識別得到13個模塊，然后將高度相似的基因模塊進行合并最終得到10個基因模塊（圖1），它們分別為黃色（yellow）、棕褐色（tan）、藍綠色（turquoise）、紫色（purple）、黃綠色（greenyellow）、紅色（red）、藍色（blue）、綠色（green）、紫紅色（magenta）和灰色（grey）模塊，分別包含163、36、239、44、38、100、344、105、181和157個基因，其中，灰色模塊中的基因沒有參考意義。

本研究以相關(guān)系數(shù)|r|≥0.3，P＜0.05為條件，共篩選到黃色、藍綠色、紅色和藍色4個與天津猴雞裸頸性狀顯著相關(guān)的基因模塊（圖2），考慮到基因模塊在天津猴雞裸頸公、母雞與常羽公、母雞中的負相關(guān)性，最終選擇藍綠色和藍色模塊中共計583個基因用于后續(xù)分析。

2.2" 藍綠色和藍色基因模塊中基因富集

GO功能分析顯著富集到77條GO條目（Q＜0.05），包括40條生物學(xué)過程（BP，biological process）條目、18條細胞組分（CC，cellular component）條目以及19條分子功能（MF，molecular function）條目，圖3為TOP30 GO條目的可視化結(jié)果。本研究重點關(guān)注BP條目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂滴組織（Lipid droplet organization）、甘油三酯儲存負調(diào)控（Negative regulation of sequestering of triglyceride）、甘油三酯分解代謝過程（Triglyceride catabolic process）、脂質(zhì)沉積（Lipid storage）和甘油三酯生物合成過程（Triglyceride biosynthetic process）等脂肪相關(guān)條目以及肌肉收縮（Muscle contraction）、肌節(jié)組織（Sarcomere organization）、肌原纖維組織（Myofibril assembly）等肌肉相關(guān)生物學(xué)過程條目。

KEGG通路富集分析獲得10條顯著富集的通路（Q＜0.05），其中脂肪代謝相關(guān)通路占比較高，包括PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、甘油酯代謝（Glycerolipid metabolism）和脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis），TOP20通路（圖4）中脂肪細胞因子信號通路（Adipocytokine signaling pathway）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）和甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）等也與脂肪代謝密切相關(guān)。此外，TOP20通路中發(fā)現(xiàn)多條重要的通路如鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）通路、TGF-β信號通路和黏著斑（Focal adhesion）信號通路等。

2.3" 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，藍綠色和藍色2個基因模塊中共528個基因編碼蛋白質(zhì)被String（V12.0）數(shù)據(jù)識別，以度（Degree）表示節(jié)點（基因編碼蛋白質(zhì)）的連通性，度越高節(jié)點連通性越高，越處于核心位置。圖5展示了度評分≥20分的所有蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)互作圖，結(jié)果顯示ACTN2基因編碼蛋白質(zhì)的連通性最高，其次是MYL10基因編碼蛋白質(zhì)，此外，發(fā)現(xiàn)多條與肌肉相關(guān)的基因編碼蛋白質(zhì)包括肌球蛋白輕鏈和重鏈的眾多家族成員，以及多條與毛囊發(fā)育密切相關(guān)的基因編碼蛋白質(zhì)，包括SOX9和PPARGC等基因編碼蛋白質(zhì)。

3" 討論

禽類的皮膚主要包括表皮、真皮和皮下組織3部分，毛囊由表皮和真皮的共同作用形成：毛囊發(fā)育初期由間充質(zhì)細胞相互凝集并分化為富有彈性的真皮層，緊接著表皮在真皮層誘導(dǎo)信號作用下開始伸長和集結(jié)，使得表皮逐漸變厚，形成羽毛基板，并促使真皮發(fā)育成真皮乳頭（毛乳頭）。與此同時，在羽毛基板的作用下，表皮細胞再次發(fā)生凝集，表皮隆起形成羽芽，即為初級毛囊。羽毛由毛囊發(fā)育形成，是角質(zhì)化的復(fù)雜表皮附屬物，具有層次分明的分支結(jié)構(gòu)，起到保溫、隔熱、求偶、信息傳遞等作用。毛囊的形成和羽毛發(fā)育涉及到眾多生物過程以及調(diào)控分子，包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子以及Wnt/β-catenin信號通路、TGF-β信號通路和BMP信號通路等。

本研究采集雜交F1代裸頸天津猴雞以及雜交F1代常羽天津猴雞頸部皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)合WGCNA分析以期在全基因組范圍內(nèi)挖掘與天津猴雞裸頸發(fā)育相關(guān)的基因。結(jié)果共篩選到1 407個基因，并進行基因模塊構(gòu)建，同時將表型與基因模塊關(guān)聯(lián)分析，最終篩選到藍綠色和藍色2個基因模塊中共計583個基因與裸頸表型呈顯著相關(guān)。

對藍綠色和藍色2個基因模塊中基因進行GO功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多條與脂肪相關(guān)的顯著富集BP條目。皮下組織是皮膚的最底層，主要由脂肪組織和結(jié)締組織構(gòu)成，連接真皮和肌肉。研究發(fā)現(xiàn)，包圍毛囊的脂肪組織在毛囊生長期增加，而在毛囊休止期減少，這表明皮下脂肪細胞在延長毛囊生長期方面起著關(guān)鍵作用；此外，皮下脂肪富含多種干細胞，它們分泌的各種生長因子已被證實可以促進毛發(fā)生長，包括VEGF、HGF、IGF-1、PDGF、KGF以及FGF-1和FGF-2等。肌肉是皮下脂肪緊密相連的組織，家禽頸部皮下肌肉不僅可以提供支撐和穩(wěn)定的作用，還是幫助保護頭部和頸部的重要結(jié)構(gòu)，隔離和保護頸部的血管和神經(jīng)，此外，頸部肌肉的運動可以增加血液流動和營養(yǎng)供應(yīng)，有助于羽毛的形成和生長；毛囊周圍存在小帶狀的平滑肌，又稱豎毛?。ˋrrector pili muscle），它們與毛囊干細胞區(qū)域之間存在著動態(tài)的相互作用，有助于促進皮膚再生過程中的毛囊生長和組織重建，本研究發(fā)現(xiàn)多條顯著富集的肌肉相關(guān)BP條目可能與其相關(guān)。

KEGG通路富集分析獲得10條顯著富集的通路，其中甘油酯代謝、脂肪酸生物合成可能與皮下脂肪發(fā)育相關(guān)，此外，TOP20通路中還發(fā)現(xiàn)PPAR信號通路、脂肪細胞因子信號通路、脂肪酸降解和甘油磷脂代謝等脂肪相關(guān)通路。家禽皮下脂肪主要由3種成分組成：甘油三酯、脂肪酸和膽固醇。甘油三酯占據(jù)了大部分的皮下脂肪組織，由甘油和3個脂肪酸分子結(jié)合而成，是能量的主要儲存形式；脂肪酸是家禽皮下脂肪的另一個重要成分，分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸；膽固醇是一種脂類物質(zhì)，也是家禽皮下脂肪的組成部分之一。

此外，研究發(fā)現(xiàn)鈣信號通路與毛囊發(fā)育之間存在密切關(guān)系，通路中的一些關(guān)鍵成員，如鈣調(diào)素和鈣離子通道蛋白可以影響毛囊細胞的功能和生長，它們通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，影響毛囊細胞的代謝活性和信號傳導(dǎo)，從而影響毛囊的發(fā)育和生長。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路是一種重要的信號傳導(dǎo)通路，研究結(jié)果表明通路中的神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺等可能通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)毛囊干細胞的增殖和分化，影響毛囊周期性生長的不同階段。TGF-β可通過調(diào)控毛囊干細胞的增殖、分化和存活，影響毛囊的生長周期和再生能力，此外，TGF-β信號通路還參與調(diào)控毛囊的周期性轉(zhuǎn)變，包括毛囊的生長期、退行期和休止期的轉(zhuǎn)換。黏著斑通路是細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，可通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)與細胞內(nèi)骨架的相互作用，影響毛囊干細胞的增殖和分化，從而影響毛囊的發(fā)育和再生。

蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作發(fā)現(xiàn)ACTN2基因編碼蛋白質(zhì)的連通性最高，位于藍綠色基因模塊，并在裸頸皮膚中高表達，該基因編碼的蛋白質(zhì)參與細胞骨架和肌肉的收縮，目前，雖沒有直接研究結(jié)果表明ACTN2參與毛囊發(fā)育，但在衰老性脫羽中發(fā)現(xiàn)該基因的表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢；其次，MYL10基因編碼蛋白質(zhì)的連通性最高，也位于藍綠色基因模塊，該基因編碼的蛋白質(zhì)是肌球蛋白輕鏈的家族成員之一，Adam等 研究發(fā)現(xiàn)MYL10基因通過參與Wnt信號通路和LEF1相互作用，最終調(diào)控毛囊干細胞的命運和毛囊發(fā)育過程。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中還發(fā)現(xiàn)位于藍色基因模塊中的MYL4、MYL6、MYL9和位于藍綠色模塊中的MYL3、MYL12A等多個同家族成員，推測其可能也參與毛囊的發(fā)育進程；此外，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中還發(fā)現(xiàn)多條肌球蛋白重鏈基因家族成員（MYH11、MYH15、MYH1B、MYH1G、MYH7、MYH7B），它們編碼的蛋白質(zhì)與肌球蛋白輕鏈共同組成了肌肉中的主要成分肌球蛋白，同時肌肉與毛囊發(fā)育相關(guān)，因此，推測上述基因也與毛囊發(fā)育相關(guān)。

毛囊周期性生長是由靜止毛囊底部干細胞推動的，Kadaja等通過條件性靶向成年小鼠毛囊干細胞中的SOX9基因，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)γ腋杉毎木S持至關(guān)重要，同時能抑制毛囊干細胞向表皮細胞分化；另一項研究在一家患有多毛癥的家族中發(fā)現(xiàn)SOX9基因上游的拷貝數(shù)變異顯著降低了毛囊中該基因的表達，表明該基因與毛囊發(fā)育密切相關(guān)；Ho等研究發(fā)現(xiàn)PPARGC基因亞型PPARGC1α在男性雄激素性脫發(fā)患者的毛囊中表達逐漸增加，且該基因在小鼠的毛發(fā)周期中呈現(xiàn)表達動態(tài)變化，進一步試驗結(jié)果表明，PPARGC1α的激活可以減少人類毛囊皮層細胞和上皮角質(zhì)細胞的增殖，從而影響毛發(fā)的生長和發(fā)育。

4" 結(jié)論

本研究通過對天津猴雞雜交F1代裸頸雞和常羽雞頸部皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合WGCNA分析發(fā)現(xiàn)多條重要的BP條目以及KEGG通路，包括脂滴組織、甘油三酯儲存負調(diào)控、甘油三酯分解代謝、肌肉收縮和肌節(jié)組織以及PPAR信號通路、鈣信號通路和TGF-β信號通路，同時，蛋白質(zhì)互作發(fā)現(xiàn)了ACTN2、MYL10、SOX9和PPARGC等重要基因，本研究結(jié)果將為天津猴雞的保護、開發(fā)和利用提供一定參考作用。

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（責任編輯：黃克玲）