doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.001

收稿日期：2024-01-23

基金項目：江蘇省“333”高層次人才培養(yǎng)項目；蘇州市科技計劃項目（SNG2022012）；江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所院基金項目（21008）

作者簡介：于雅潔（1995-），女，山東威海人，碩士研究生，研究實習員，主要從事水稻遺傳育種的研究。（E-mail）781911361@qq.com

通訊作者：袁彩勇，（E-mail）hysdycy@163.com

摘要：" 為分析稻瘟病抗性基因Pi2、Pita、Pib在江蘇太湖地區(qū)粳稻稻瘟病抗性育種中的作用，利用五引物擴增受阻突變體系（PARMS）檢測技術，檢測水稻稻瘟病抗性基因Pi2、Pita、Pib在江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所篩選培育的799份高世代穩(wěn)定試驗材料中的分布情況，并結合穗頸瘟人工接種鑒定結果分析基因型與抗性的關系。結果表明，在799份供試水稻品種中，以抗性基因 Pib的分布頻率最高，抗性基因 Pita的分布頻率也相對較高，抗性基因 Pi2分布頻率較低，多數(shù)材料攜帶2個抗性基因；在抗性基因組合中，Pita+Pib組合檢出率較高，為44.81%（358/799）。田間抗病性鑒定結果表明，當供試材料中只存在單一抗病基因時，中抗級別以上材料占比為33.60%（86/256），當供試材料中存在復合基因型時，中抗級別以上材料占比為61.02%（299/490），表明抗性基因共存可以有效增強植株對稻瘟病的抗性。本研究結果為江蘇太湖地區(qū)粳稻稻瘟病抗性基因聚合育種的選擇提供了理論支持。

關鍵詞：" 稻瘟??；PARMS技術；抗性基因；抗病育種

中圖分類號：" S511;S435.111.4+1""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0769-08

Distribution and resistant effects of blast resistant genes （Pi2， Pita， Pib） in japonica rice in Taihu area of Jiangsu province

YU Yajie，" CAO Penghui，" SONG Yunsheng，" CHEN Fei，" QIAO Zhongying，nbsp; DONG Minghui，" ZHU Yongliang，" XIE Yulin，" YUAN Caiyong

（Jiangsu Taihu Area Institute of Agricultural Sciences， Suzhou 215104， China）

Abstract：" "In order to analyze the role of rice blast resistance genes Pi2， Pita and Pib in japonica rice blast resistance breeding in areas of Taihu area of Jiangsu province， penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS） detecting technology was used to detect the distribution of rice blast resistance genes Pi2， Pita and Pib in 799 high generation stable test materials screened and bred by Jiangsu Taihu Area Institute of Agricultural Sciences， and to analyze the relationship between genotype and resistance in combination with the results of artificial inoculation and identification of seedling blast and neck panicle blast. The results showed that among the 799 test materials， most of them carried two resistance genes，the distribution frequency of resistance gene Pib was the highest， the distribution frequency of resistance gene Pita was high， and the distribution frequency of resistance gene Pi2 was low. In the resistance gene combination， the detection rate of Pita+Pib combination was relatively high， which was 44.81% （358/799）. The results of field disease resistance identification showed that when there was only one single disease resistance gene in the test materials， materials with medium resistance or above accounted for 33.60% （86/256）. When there were composite genotypes in the test materials， materials with medium resistance or above accounted for 61.02% （299/490）， indicating that the coexistence of resistance genes could effectively enhance the resistance to rice blast. The results provide theoretical support for the selection of japonica rice blast resistance gene polymerization breeding in the Taihu region of Jiangsu province.

Key words：" rice blast;penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS） technology;resistance genes;disease-resistance breeding

水稻（Oryza sativa L.）作為全球主要糧食作物之一，對人類社會的生存和發(fā)展具有不可替代的重要性，全球約有一半的人口將稻米作為主食。在中國，水稻在維護糧食安全與保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)十分重要的地位，其產(chǎn)量在全球范圍內(nèi)也遙遙領先。作為第一大糧食作物，2022年江蘇省水稻的種植面積達到了2.20×106 hm2以上。然而，水稻在其生長發(fā)育過程中面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最為關鍵的是各種病原菌的侵染，特別是稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzea）引起的稻瘟病。稻瘟病，也被稱為稻熱病，是一種嚴重的真菌類病害，它不僅嚴重威脅著水稻產(chǎn)量，導致水稻年均產(chǎn)量損失20%～30%，在疫情嚴重的年份甚至可達50%以上，重病田顆粒無收，被稱為水稻的“癌癥”。同時，稻瘟病的發(fā)生還嚴重影響稻米品質(zhì)，它通過改變稻米的直鏈淀粉及蛋白質(zhì)等的含量使大米食味品質(zhì)造成一定的降低。

面對稻瘟病的威脅，科學家們一直致力于尋找有效的控制策略。利用抗病基因培育和推廣抗病品種是控制稻瘟病最為經(jīng)濟有效和綠色安全的防治手段?？沟疚敛』虻难芯孔畛跏怯扇毡緦W者于20世紀60年代中期展開的，日本學者通過研究鑒定出8個抗性位點上的14個抗病基因。在中國，稻瘟病病菌主要分為8個亞群和50余個生理小種，這些生理小種之間存在顯著的遺傳差異。迄今，已有100多個稻瘟病主效抗性基因被鑒定，同時鑒定出34個部分抗性基因。現(xiàn)階段，28個主效抗性基因（Pit、Pish、Pi37、Pi64、Pib、Pid2、Pid3、Pi25、Pi2、Pi9、Pizt、Pi50、Pigm、Pizh、Pi36、Pi5、Pii、Pia、Pi-CO39、Pi1、Pi54、Pi54rh、Pikm、Pikp、Pik、Pike、Pita和Ptr）及5個部分抗性基因（Pi21、Pi35、Pi63、Pb1和Pid3-I1）被成功克隆。其中，Pib基因來源于水稻品種BL1，該基因位于水稻第2號染色體長臂近末端的區(qū)域。作為第1個通過圖位克隆得到的稻瘟病抗性基因，Pib編碼1個由1 251個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，對日本大多數(shù)稻瘟病病菌小種均可以產(chǎn)生抗性；作為主效抗稻瘟病基因，Pi-ta基因被首次克隆于供體品種Yashiro-mochi中，該基因位于細胞質(zhì)膜上，水稻第12號染色體靠近著絲點的區(qū)域，限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記RG241和RZ397之間，編碼1個長度為928個氨基酸的細胞質(zhì)膜受體蛋白質(zhì)，與無毒基因產(chǎn)物AVR-Pita直接互作；Pi-2基因來自哥倫比亞秈稻品種5173，初步定位結果顯示，它定位在6號染色體分子標記RG64和RZ612之間，遺傳距離分別是2.1 cM和7.2 cM，精細定位結果顯示，它定位在分子標記RG64和AP22之間，遺傳距離分別為0.9 cM和1.2 cM，該基因編碼1個NBS-LRR類蛋白，其抗譜廣，對中國收集的792個稻瘟病病菌小種中的絕大多數(shù)都表現(xiàn)出抗性。以上抗性基因的發(fā)現(xiàn)和克隆對于理解水稻的抗病機理以及育種工作具有重要的意義。

本研究采用的五引物擴增受阻突變體系（PARMS）檢測技術一般用于單核苷酸多態(tài)性聚合酶鏈式反應（SNP PCR）分析，屬于第3代分子標記。與傳統(tǒng)分子檢測技術相比，PARMS在進行SNP等位基因基因型檢測方面具有高準確性和低成本的顯著優(yōu)勢，因而在近年來的農(nóng)學研究中得到了廣泛應用。

本研究擬以稻瘟病抗性基因Pi2、Pita和Pib為主要研究對象，通過對江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所篩選培育的799份高世代材料進行PARMS檢測，結合田間穗頸瘟自然鑒定、誘發(fā)鑒定及抗病性評估，全面評估以上抗性基因在抵御稻瘟病方面的效應，并為江蘇太湖地區(qū)的水稻抗病品種選育提供科學依據(jù)和新思路。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

本研究團隊前期引進了優(yōu)異抗稻瘟病種質(zhì)資源128份，經(jīng)過初步抗性鑒定結合基因檢測，篩選出中等抗病性的種質(zhì)資源35份，作為主要抗性親本。隨后以這些親本與優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)水稻新種質(zhì)或中間材料進行配組篩選，形成799份高代試驗材料。

供試稻瘟病病菌菌株為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供的5個代表性菌株，編號為2021-3、2021-43、2021-71、2021-150和2021-497。

1.2" 供試水稻材料穗頸瘟抗性的鑒定

穗頸瘟田間抗性的鑒定采用病區(qū)自然誘發(fā)法，鑒定圃設在江蘇省常州市金壇試驗基地（31°40′16.29″N，119°21′47.79″E），該地區(qū)日照充足、雨量充沛，屬北亞熱帶季風性濕潤氣候，利于稻瘟病的發(fā)生。每個供試品種種植4行，每行5株，株行距為20 cm×20 cm。將供試材料與稻瘟病誘發(fā)品種蘇御糯交錯種植以增強病菌的自然侵染力。隨后在水稻生長期間觀察并記錄成熟期穗頸瘟發(fā)病情況，抗性鑒定標準參照國際水稻研究所的分級標準 。在水稻生長的全生育期內(nèi)不對病害進行防治，生長過程中的蟲害防治和肥水管理按照大田常規(guī)生產(chǎn)操作。

1.3" 水稻葉片DNA的提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取 DNA。具體操作步驟如下：取植株葉片樣品剪碎放入2 ml EP管中，加入2粒鋼珠和100 μl CTAB溶液，用植物破碎儀高速振蕩5 min將葉片打碎；向其中加入400 μl CTAB溶液，上下翻轉幾次使其混合均勻，隨后將EP管放入65 ℃水浴鍋中，每15 min翻轉1次，水浴時長1 h；取出EP管，放在離心機中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至新的EP管中；向EP管中加入500 μl三氯甲烷與異戊醇混合液（24∶1，體積比）并劇烈振蕩，隨后置于離心機中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至新的離心管中，重復上述操作；吸取上清液，加入2倍體積的異丙醇，-20 ℃靜置30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸去上清液。此時遺留下來的沉淀即為目的DNA，加入500 μl乙醇進行吹打，隨后放入離心機中4 ℃、12 000 r/min離心后烘干，加入滅菌水溶解，并放入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4" PARMS引物與PCR擴增體系

試驗所需引物由武漢景肽生物科技有限公司合成，詳細的標記引物序列見表1。PCR擴增反應體系為10.00 μl，其中包括5.00 μl 2×PARMS master mix（包含2條通用熒光引物），0.15 μl 10 μmol/L Allele-T標記引物，0.15 μl 10 μmol/L Allele-C標記引物，0.40 μl 10 μmol/L通用引物，1.00 μl模板DNA（10～100 ng），3.30 μl的ddH2O。PCR反應程序為：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65 ℃（每循環(huán)降低0.8 ℃） 1 min，共10個循環(huán)；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，共32個循環(huán)。

1.5" 基因分型的鑒定

PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶標儀讀取掃描FAM（6-羧基熒光素）、HEX（六氯-6-甲基熒光素）和ROX（6-羥基黃曲霉素B）信號，PARMS SNP熒光信號和分型原理如圖1所示。隨后利用在線軟件Snpdecoder（http：//www.snpway.com/snpdecoder/）解析轉換熒光信號，將熒光信號生成清晰直觀的分型圖，并根據(jù)不同顏色，輸出基因型結果。

1.6" 統(tǒng)計分析

采用辦公軟件WPS進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，對獲得的數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計分析。利用 SPSS statistics 26軟件進行單基因邏輯回歸分析，獲得各基因與抗性間的回歸系數(shù)（B）、顯著性檢驗的P值及優(yōu)勢比 （OR）。

2" 結果與分析

2.1" 抗稻瘟病基因的分布特征檢測

本研究對799份高世代穩(wěn)定試驗材料進行了PARMS檢測，F(xiàn)AM和 HEX報告熒光信號的散點圖如圖2所示，圖中1個點代表1份水稻材料，其中綠色點代表HEX熒光信號檢出數(shù)，對應感病純合基因；藍色點代表FAM熒光信號檢出數(shù)，對應抗病純合基因。隨后對稻瘟病抗性基因Pi2、Pita、Pib展開分布頻率分析。

圖中每個點代表1份水稻材料，其中綠點及藍點分別代表HEX（六氯-6-甲基熒光素）及FAM（6-羧基熒光素）熒光信號檢出數(shù)。

由圖3可知，抗性基因Pib在試驗材料中的分布頻率最高，檢出率達到88.86%（710/799），暗示其在區(qū)域內(nèi)的材料中分布廣泛。Pita抗性基因的檢出率為57.45%（459/799），Pi2抗性基因的檢出率則相對較低，僅為16.90%（135/799），表明不同基因在供試材料中的分布存在差異。

進一步的分析結果顯示，在這些材料中，單獨攜帶 Pi2、Pita、Pib基因的材料分別占0.38%（3/799）、3.63%（29/799）、28.04%（224/799），即僅攜帶1個抗性基因的材料占32.04%（256/799）。在基因組合方面，同時攜帶2種抗病基因的材料，如Pi2+Pib、Pi2+Pita、Pita+Pib的檢出率分別為7.51%（60/799）、0.50%（4/799）、44.81%（358/799），共占52.82%（422/799），同時攜帶Pita和Pib基因的材料的高檢出率表明這2個基因可能在抗性提升上具有協(xié)同效應。同時攜帶Pi2、Pita、Pib 3個基因的材料占8.51%（68/799），而完全不含這3個基因的材料則占6.63%（53/799）。

2.2" 抗稻瘟病基因?qū)λ腩i瘟抗性的貢獻

通過邏輯回歸法分析各基因?qū)λ腩i瘟抗性的貢獻。由圖4可知，Pita與穗頸瘟抗性間的回歸系數(shù)（B）為1.12，達到極顯著水平（Plt;0.01），Pi2與穗頸瘟抗性間的B為0.74，同樣達到極顯著水平（Plt;0.01），表明Pita和Pi2對供試材料的抗性有極顯著的貢獻；Pib與穗頸瘟抗性間的B為0.64，達到顯著水平（Plt;0.05）。Pita、Pi2、Pib的優(yōu)勢比 （OR） 分別為3.05、2.09、1.90，表明攜帶Pita、Pi2、Pib基因?qū)Φ疚敛】剐缘呢暙I分別是不攜帶Pita、Pi2、Pib基因的3.05倍、2.09倍、1.90倍。

2.3" 供試品種穗頸瘟抗性分析

對799份水稻材料田間誘發(fā)穗頸瘟發(fā)病情況展開分析，結果如圖5所示，抗性達到1級（抗）的材料有151份，抗性達到3級（中抗）的材料有244份，抗性達到5級（中感）的材料有147份，抗性達到7級（感）材料的有257份，暫未從供試材料中發(fā)現(xiàn)抗性達到0級（高抗）或9級（高感）的材料。由此表明，供試材料中存在不同程度的抗性反應。799份材料中，抗性達中抗及以上（≤3級）的品種占比為49.44%（395/799）；感?。ā?級）的品種占比為50.56%（404/799）。以上結果表明供試材料整體抗性較好。

2.4" 抗稻瘟病基因與對穗頸瘟抗性的關聯(lián)性分析

在供試材料中，不同抗病基因及其組合在抗病性表現(xiàn)上呈現(xiàn)明顯差異?？剐曰蜷g的聚合疊加效應如表2及圖6所示，僅含有單一抗病基因的256份材料平均抗病等級為4.94級，其中中抗及以上級別以上的材料占比為33.60%（86/256），表明單一基因的抗性效果相對有限。相比之下，含有2個抗病基因（Pi2+Pib、Pi2+Pita和Pita+Pib）的422份材料平均抗病等級為3.81級，中抗及以上級別的材料占比達到59.24%（250/422），這一結果說明基因組合在增強抗病性方面的重要性。特別是Pita+Pib組合，中抗及以上級別以上的材料檢出率達到51.18%（216/422），該結果可能表明這2個基因在協(xié)同提高抗病性方面具有潛力。當材料中存在3種抗病基因（Pi2+Pita+Pib）時平均抗病等級為3.38級，中抗及以上級別的占比大幅度提升至72.06%（49/68），表明多重抗病基因的協(xié)同作用在提高稻瘟病抗性方面的效果更好。此外，即使在不攜帶任何一種檢測基因的材料中，仍有18.87%（10/53）的材料表現(xiàn)出對穗頸瘟的抗性，這53份材料的平均抗病等級為5.98級，暗示這些材料中可能存在其他未知的抗病基因或抗病機制。

3" 討論

水稻稻瘟病抗性作為典型的質(zhì)量-數(shù)量性狀，既受基因控制又受多種環(huán)境因素的影響。稻瘟病的發(fā)生對水稻的增產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)都會產(chǎn)生很大的威脅。同時，對稻瘟病的抗性是否過關也是江蘇省水稻新品種審定中關鍵的衡量指標。由于稻瘟病病菌具有復雜性與多樣性，因此現(xiàn)階段種植抗病品種依舊是最經(jīng)濟有效且環(huán)保的防治稻瘟病的手段。通過對江蘇粳稻稻區(qū)稻瘟病抗性基因進行鑒定及對田間抗性進行分析，可以有效掌握稻瘟病抗性基因的潛在價值，提高水稻育種效率。采用傳統(tǒng)育種手段篩選抗病品種，不僅選擇效率低且耗時耗力。利用PARMS技術進行分子標記輔助選擇育種，不僅可以大大提升選擇效率，而且可以有效提升選擇的準確率，因此該手段近年來在農(nóng)學遺傳育種研究中得到了較為廣泛的應用。卿冬進等利用PARMS技術建立Pigm基因的熒光分子標記，并以此標記進行稻瘟病檢測，結合田間表型驗證了該方法構建的分子標記具有較強的可靠性。劉軍化等利用PARMS技術檢測9個抗稻瘟病基因（Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m）在87份水稻材料中的分布情況，探究稻瘟病抗性基因抗性效率，發(fā)現(xiàn)87份材料中有10份材料僅含有單基因，多數(shù)材料至少含有2個聚合基因，其中以Pi5基因分布最廣。吳子帥等利用PARMS技術檢測14個稻瘟病抗性基因在121份常規(guī)秈稻品種中的分布情況，并借此分析基因型和抗性的關系。

王小秋等對14個稻瘟病抗性基因在江蘇省近年育成的195個粳稻新品種/品系中的分布展開分析，發(fā)現(xiàn)Pib、Pita和Pikh基因在供試品種中的分布頻率較高，其分布頻率均保持在45.00%以上，以上3個基因中又以Pib基因分布最廣，檢出率高達72.00%；陳濤等通過對40個品種和665個新品系的抗性基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)被檢樣品中廣泛存在Pi-ta與Pi-b基因，其中Pi-b基因檢出率高于Pi-ta基因；范方軍等利用Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54的功能標記對江蘇省遲熟中粳稻預試64份品系進行稻瘟病抗性檢測，發(fā)現(xiàn)抗病基因Pi-b檢出率高達76.56%（49/64）。本研究利用PARMS技術，有針對性地檢測江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所篩選培育的799份高代材料中Pi2、Pita、Pib抗性基因的分布情況，研究結果表明，799份高代材料中攜帶 Pita及Pib抗病基因的材料占比均超過50.00%，其中以Pib抗性基因在樣本中的檢出率最高（88.86%），說明Pita及Pib基因廣泛存在于供試材料中，其中以Pib抗病基因的應用最廣，與前人研究結果一致，表明Pib基因可能是太湖稻區(qū)主要的稻瘟病抗病基因。

范方軍等通過對Pi-b、Pi-ta、Pikm、Pi54 4個水稻抗病基因組合進行研究，發(fā)現(xiàn)在含有2個抗病基因的組合中，Pi-ta+Pi-b的檢出率相對較高，在64份材料中有7份；戴小軍等通過對70個水稻品種中的4個稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi9、Pikm進行檢測，發(fā)現(xiàn)相對于其他抗性基因組合，Pi-ta+Pi-b抗病基因組合檢出率最高。本研究發(fā)現(xiàn)，在含有2個抗病基因的組合中，Pita+Pib抗性基因組合檢出率高達44.81%，說明供試材料中Pita與Pib基因聚合作用較強，這與范方軍等、戴小軍等的研究結果一致，表明這2個基因在協(xié)同提高抗病性方面可能存在較大潛力。

本研究針對基因型與田間抗病性表現(xiàn)進行了分析，分析結果表明，799份檢測材料中，中抗級別及以上材料占49.44%（395/799），當檢測材料中同時存在基因Pita與Pib時，水稻材料對穗頸瘟的抗性表現(xiàn)出更強的抗性，反映這2種基因在防治稻瘟病上的潛在協(xié)同作用；當同時存在基因Pi2與Pita時，中抗級別以上材料有3份，占75.00%（3/4），但由于樣本數(shù)量較少，無法證明其是否具有普遍規(guī)律。此外，含有抗性基因的供試材料中，隨著抗性基因數(shù)量的增多，中抗級別及以上材料的檢出率逐漸提高，其中三基因型（Pi2+Pita+Pib）的抗性級別相對最高，暗示與單一基因型相比，多抗性基因共存使水稻對稻瘟病抵抗力顯著增強。除此之外，存在即使不攜帶Pi2、Pita、Pib基因的材料仍對穗頸瘟具有抗性的情況，說明在供試品種中存在其他稻瘟病抗性基因，其抗病效率需要進一步分析。研究結果表明，即使材料中存在相同的抗病基因，但表現(xiàn)出的稻瘟病抗病等級仍不同，這可能是由于除檢測的3個抗病基因之外，材料中攜帶其他抗病基因，針對此現(xiàn)象，后續(xù)還需要針對其他抗病基因展開研究。

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（責任編輯：陳海霞）