摘要：目的 預(yù)測分析83株銅綠假單胞菌中前噬菌體攜帶情況和分布特征，以及鑒定前噬菌體編碼的抗生素耐藥基因和毒力因子。方法 采用Phaster在線工具對菌株基因組序列進(jìn)行前噬菌體預(yù)測，采用Cadr數(shù)據(jù)庫和Vfdb數(shù)據(jù)庫進(jìn)行耐藥基因和毒力基因注釋分析。結(jié)果 83株銅綠假單胞菌中共檢測出601條前噬菌體序列，其中完整型304條，不完整型161條，可疑型136條，平均每株銅綠假單胞菌中至少存在3條完整的前噬菌體。平均每株銅綠假單胞菌中攜帶的所有前噬菌體占其基因組長度比例約為2%～4%。61條前噬菌體預(yù)測到125個(gè)耐藥基因，分別來自23個(gè)不同家族，產(chǎn)生7種耐藥機(jī)制。356條前噬菌體共編碼545個(gè)毒力基因，歸類為119種毒力基因，編碼78種相關(guān)毒力因子，平均每個(gè)前噬菌體攜帶1～2個(gè)毒力因子編碼基因，少數(shù)前噬菌體攜帶3條及以上。毒力因子的宿主來源除了銅綠假單胞菌外，百日咳桿菌、微黃分枝桿菌、鳥分枝桿菌及其亞種、肺炎克雷伯菌及其亞種也占有較高來源比例。結(jié)論 前噬菌體在銅綠假單胞菌中分布廣泛且攜帶多種耐藥和毒力基因，對銅綠假單胞菌耐藥性獲得、傳播和致病性演變具有重要影響。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌；前噬菌體；基因組學(xué)；溶原性；耐藥基因；毒力基因

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）04-0239-09

Bioinformatic Analysis of Prophages Carried by Pseudomonas aeruginosa

Yang Shu1，" "Guo Chen-xi1，" "Su Hao-chen1，" "Niu Han1，" "Wang Kai-xiang1，" "Wang Li-li1，

Xu Yong-ping1，" "Wang Heng2，Tan De-meng3，Xie Qiong2，Li Xiao-yu1

（1 MOE Key Laboratory of Bio-Intelligent Manufacturing， School of Bioengineering，

Dalian University of Technology， Dalian 116024；

2 China Astronaut Research and Training Center，" "Beijing" "100094;

3 Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University，" "Shanghainbsp; "201508）

Abstract： Objective To determine the virulence factors and antibiotic resistance genes encoded by prophage， as well as to predict and assess the prophage carrier and distribution properties in 83 strains of Pseudomonas aeruginosa. Methods Phaster network database was used to compare and predict phage gene sequences， Cadr database and Vfdb database were used to compare drug resistance genes and virulence genes， respectively. Results A total of 601 prophage sequences were detected in 83 strains of Pseudomonas aeruginosa， of which 304 were intact， 161 were incomplete and 136 were questionable. On average， there were at least 3 complete prophage sequences in each strain of Pseudomonas aeruginosa. On average， the proportion of all prophages carried by each Pseudomonas aeruginosa strain in its genome is about 2% to 4%. Sixty-one prophages predicted 125 resistance genes， each from 23 different families， resulting in seven resistance mechanisms. 356 prophages encode a total of 545 virulence genes， which are classified as 119 virulence genes encoding 78 related virulence factors. Each prophage typically carries one to two virulence factors， although some prophages carry three or more. Apart from Pseudomonas aeruginosa， other host sources of virulence factors included Bacillus pertussis， Mycobacterium flavum， Mycobacterium avium， and its subspecies， as well as Klebsiella pneumoniae and its subspecies. Conclusion Prophages are widely distributed in Pseudomonas aeruginosa and carry drug resistance and virulence genes， which have asignificant impact on the acquisition， transmission， and pathogenicity evolution of resistance in Pseudomonas aeruginosa.

Key words： Pseudomonas aeruginosa; prophage; genomics; lysogeny; drug resistance gene; virulence gene

銅綠假單胞菌是一種常見的革蘭陰性致病菌，能在免疫功能受損的患者中引起急性或者慢性感染[1]，常見疾病包括：慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、創(chuàng)傷、燒傷、癌癥、敗血癥以及呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎[2]。生物被膜存在的狀況下，銅綠假單胞菌能適應(yīng)更多極端惡劣的環(huán)境，附著于不同表面以及醫(yī)療器械上[3]。研究表明，隨著全球范圍內(nèi)抗生素的不斷濫用，銅綠假單胞菌對一系列抗生素表現(xiàn)出高度耐藥性，如青霉素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類藥物等，從而導(dǎo)致顯著發(fā)病率和死亡率[4]。根據(jù)2023年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（http：//www.chinets.com）的數(shù)據(jù)顯示，臨床分離菌株共201 740株，其中，銅綠假單胞菌是位于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及鮑曼不動(dòng)桿菌后的第五大醫(yī)院感染病原菌[3-5]。

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，可分為溶原性和裂解性噬菌體[6]。前噬菌體是溶原性噬菌體整合到宿主菌的染色體上，或者以質(zhì)粒形式存在的噬菌體基因組，能隨宿主菌的復(fù)制而復(fù)制[7]。研究表明，前噬菌體能夠?qū)?xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移、進(jìn)化、競爭性和適應(yīng)性等產(chǎn)生重要影響[7-10]。其中，前噬菌體攜帶的毒力因子（Virulent factor，VFs）能參與編碼細(xì)菌毒性、增強(qiáng)黏附、侵襲和躲避宿主防御等，如71株多重耐藥的大腸埃希菌的前噬菌體被發(fā)現(xiàn)攜帶6種不同毒力基因[11]，金黃色葡萄球菌的前噬菌體PS42－D和ФN31能編碼腸毒素[12-13]，霍亂弧菌的前噬菌體CTXФ能編碼霍亂毒素[14]，銅綠假單胞菌的前噬菌體Pf4能促進(jìn)形成晶液狀的生物被膜，從而提高其黏附力和抗逆性[15]。除此之外，前噬菌體還參與其“轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“轉(zhuǎn)化”，從而使抗生素耐藥基因（Antibiotics resistance genes，ARGs）進(jìn)行水平傳播[16]，如鏈球菌通過前噬菌體獲得氯霉素、林可霉素和紅霉素等抗生素耐藥性[17-18]，炭疽芽孢桿菌通過噬菌體Wβ獲得磷霉素耐藥性[19]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，前噬菌體被證實(shí)作為一種移動(dòng)遺傳元件調(diào)控不同類型的抗性基因[8，20]，而宿主菌通過這種方式獲得耐藥性的現(xiàn)象已經(jīng)成為世界各地越發(fā)關(guān)注的問題。

目前，關(guān)于銅綠假單胞菌的前噬菌體分布情況的研究報(bào)道較少。Johnson等[21]報(bào)道從人體和其他環(huán)境中分離的5 383株銅綠中預(yù)測出6 852個(gè)前噬菌體，其中46.9%沒有顯著的序列相似性，存在廣泛的多樣性。此外，Knezevic等[22]發(fā)現(xiàn)241株銅綠假單胞菌中約60%含有噬菌體Pf1遺傳因子，具有流行性。關(guān)于銅綠假單胞菌的前噬菌體研究，大部分集中在對細(xì)菌表型、致病性和競爭性的影響上。例如，Davies等[23]發(fā)現(xiàn)與囊性纖維化感染有關(guān)的銅綠假單胞菌的利物浦流行株，含有5個(gè)前噬菌體（LES f2～ f6），這大大提高了菌株的侵襲性及肺部感染的競爭優(yōu)勢，銅綠假單胞菌的Pf類噬菌體可以促進(jìn)細(xì)菌生物被膜形成[24]。本文主要以銅綠假單胞菌的前噬菌體為研究對象，預(yù)測三種類型前噬菌體以及其中ARGs與VFs的分布情況，了解其可能引起的耐藥表型、耐藥機(jī)制和毒力基因的宿主來源。

1 材料和方法

1.1 銅綠假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫

83株銅綠假單胞菌的全基因組數(shù)據(jù)，均下載于NCBI官網(wǎng)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#！/prokaryotes/），最后訪問時(shí)間為2023年10月18日。

1.2 菌株分布情況統(tǒng)計(jì)

將83株銅綠假單胞菌的分離國家、樣本來源、宿主疾病等分布信息通過Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用軟件Origin 2021進(jìn)行繪圖。

1.3 前噬菌體預(yù)測

使用Phaster（https：//phaster.ca/）對83株銅綠假單胞菌序列進(jìn)行前噬菌體預(yù)測，定位前噬菌體存在位點(diǎn)并保存其序列特征[基因組大小、基因組中GC（鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率）含量、完整性]，下載預(yù)測結(jié)果以便后續(xù)分析。Phaster對前噬菌體的預(yù)測分為三種：完整型（預(yù)測得分＞90），可疑型（預(yù)測得分=70～90），不完整型（預(yù)測得分＜70）。

1.4 前噬菌體中ARGs的預(yù)測

整理Phaster預(yù)測得到的前噬菌體序列，分別上傳單個(gè)前噬菌體文件（fasta格式），使用抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫Card（https：//card.mcmaster.ca/）對前噬菌體攜帶的ARGs進(jìn)行預(yù)測。

1.5 前噬菌體中VFs的預(yù)測

使用毒力因子數(shù)據(jù)庫（http：//www.mgc.ac.cn/VFs/）中兩個(gè)核心數(shù)據(jù)庫的SetA和SetB，提交單個(gè)噬菌體文件（Fasta格式），通過Blastn預(yù)測可能攜帶的VFs。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株分布特征

通過圖1A可知，83株銅綠假單胞菌樣本的主要國家來源為美國、中國、英國、法國以及韓國，占比分別為21.69%（18/83）、19.28%（16/83）、9.64%（8/83）、8.43%（7/83）和7.23%（6/83）。83株樣本菌分別來自不同地區(qū)環(huán)境以及患者體內(nèi)，其樣本來源類型如圖1B所示，主要來源為痰液、血液和尿液，占比分別為33.73%（28/83）、14.45%（12/83）和14.45%（12/83）。圖1C為菌株分離時(shí)的宿主所患的疾病種類，主要為囊性纖維化以及肺炎，占比分別為20.48 %和18.07 %。

2.2 銅綠假單胞菌的基因組特征

通過圖2可知，83株銅綠假單胞菌的基因組大小范圍為6.0～7.6 Mb，多數(shù)分布在6.8～7.0 Mb之間，GC含量范圍為65.2%～66.6%，多數(shù)含量為66.0%～66.2%。

2.3 前噬菌體的預(yù)測

通過Phaster，在線預(yù)測83株銅綠假單胞菌中前噬菌體，對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析，如圖3A所示，共預(yù)測到601條前噬菌體序列，其中完整型304條，不完整型161條，可疑型136條，由圖3B可知，平均單個(gè)銅綠假單胞菌中含有前噬菌體總量約為7～8條，其中完整型4條，不完整型和可疑型分別為2條。

2.4 前噬菌體的基因組特征

對預(yù)測所得前噬菌體進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示，銅綠假單胞菌的總前噬菌體的基因組大小范圍為5.5～111.6 kb，GC主要含量為61.87%～64.14%，（圖4A，4B）。完整型基因組大小主要為42.0～54.0 kb，GC的主要含量為61.75%～64.08%（圖4C，4D），不完整型基因組大小較小，范圍主要為13.25～18.75 kb，GC含量主要為59.0%～61.0%（圖4E，4F），可疑型基因組大小主要分布在13.13～18.54 kb，GC含量為64.68%～65.61%（圖4G，4H）。此外，每株銅綠假單胞菌的總前噬菌體占其宿主基因組的百分比約為2.5%～3.5%（圖5）。

2.5 ARGs的預(yù)測結(jié)果

Card數(shù)據(jù)庫是抗性基因及其產(chǎn)物和相關(guān)表型的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫。通過預(yù)測可得，共有61條前噬菌體攜帶125個(gè)ARGs。其中，完整型攜帶31個(gè)，不完整型和可疑型分別攜帶20個(gè)和10個(gè)。根據(jù)產(chǎn)生耐藥性的藥物進(jìn)行分類，包括消毒劑和防腐劑，可以分為16種耐藥表型，主要以氨基糖苷類（31/61）、磺胺類（27/61）、氟喹諾酮類（20/61）以及大環(huán)內(nèi)酯類（17/61）、青霉烷類（17/61）抗生素為主。此外，有11株銅綠都表現(xiàn)出高度耐藥性，能對13種藥物包括消毒劑和防腐劑產(chǎn)生抗性（圖6A）?？股啬退幓虻募易鍋碓慈鐖D6B所示，分別來自23個(gè)不同家族，其中以耐磺胺類抗生素、耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化（RND）和主要催化劑超家族（MFS）抗生素外排泵、氨基糖苷N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶5個(gè)家族為主。圖6C是產(chǎn)生耐藥性的作用機(jī)制，包括抗生素失活（36%），抗生素靶點(diǎn)替代（26.4%），抗生素外排（18.4%），抗生素外排和抗生素滲透性降低（16%），抗生素靶點(diǎn)保護(hù)（1.6%），抗生素靶點(diǎn)改變（0.8%），抗生素靶點(diǎn)改變和抗生素失活（0.8%），共七大類。

2.6 VFs的預(yù)測結(jié)果

毒力因子數(shù)據(jù)庫Vfdb用于了解有關(guān)細(xì)菌病原體主要毒力因子的組成、結(jié)構(gòu)、功能、致病機(jī)理、毒力島、序列和基因組信息等內(nèi)容。通過預(yù)測可知，共有356條前噬菌體攜帶VFs，占總噬菌體數(shù)的59%，其中，完整型中攜帶VFs的數(shù)量最多，占完整型的63%。不完整型中攜帶VFS數(shù)量最少，占其總數(shù)50%，而可疑型中攜帶VFs數(shù)量占其總數(shù)61%（圖7A）?？偟那笆删w平均攜帶VFs大約1～2種，少數(shù)前噬菌體中攜帶3種及3種以上的VFs（圖7B）。不同類型前噬菌體中，完整型和不完整型平均攜帶1.5種VFs，而可疑型較少，平均攜帶1種VFs（圖7C）。

如圖8所示，前噬菌體攜帶編碼的毒力基因，歸類為119種，編碼78種相關(guān)VFs，主要為色氨酸合成（78/545）、鞭毛（54/545）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（38/545）以及Ⅳ型菌毛（30/545）等。

圖9是預(yù)測所得不同VFs的宿主來源的結(jié)構(gòu)比例，除來自相同菌屬的銅綠假單胞菌（153/545）、熒光假單胞菌（28/545）外，微黃分枝桿菌（75/545）、百日咳桿菌（64/545）、鳥分枝桿菌及其亞種（22/545）、沙門氏氣單胞菌亞種（18/545）等也占有較大比例，表明前噬菌體可以作為可移動(dòng)載體，實(shí)現(xiàn)不同細(xì)菌間的毒力因子轉(zhuǎn)移，在致病性演變過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

細(xì)菌基因組上的前噬菌體數(shù)量具有高度可變性，這與細(xì)菌本身基因組大小有關(guān)，較小的細(xì)菌基因組上存在的前噬菌體較少，而一些細(xì)菌基因組上可以容納十幾個(gè)前噬菌體[25]。在銅綠假單胞菌的細(xì)菌性病原體中具有較大的基因組，平均大小為6.6 Mb[26]。本研究中，83株銅綠假單胞菌的基因組大小在6.0～7.6 Mb間，均攜帶前噬菌體，平均每株攜帶至少7條，完整型的前噬菌體約占總數(shù)的一半，這表明銅綠假單胞菌中前噬菌體分布廣泛，這與Johnson等[21]的結(jié)論相同。帶有噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶原性細(xì)菌，而不同菌屬的溶原性細(xì)菌占比不同，如，大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌中溶原性細(xì)菌的占比為100%[27-29]，其中大腸埃希菌平均攜帶8.2條前噬菌體。鮑曼不動(dòng)桿菌中溶原性細(xì)菌占比為99.5%，其攜帶前噬菌體數(shù)量為4條[30]。變異鏈球菌中溶原性細(xì)菌占比為13.45%，平均攜帶前噬菌體數(shù)量為2.67條[31]。研究表明，前噬菌體最多可占宿主基因組的20%左右[21]，本研究中銅綠假單胞菌中攜帶的前噬菌體約占其基因組的0.54%～9.89%，低于埃希菌屬、鏈球菌屬、螺旋體屬（10%～20%）[32-33]，這可能與選取樣本的基因完整度以及樣本數(shù)量有關(guān)。

ARGs的獲得以水平基因轉(zhuǎn)移為主要方式。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類ARGs在銅綠假單胞菌中廣泛分布[34-35]，相關(guān)抗生素耐藥基因包括：外膜通道蛋白OprD基因、氨基糖苷類修飾酶基因、β-內(nèi)酰胺酶編碼基因、16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵系統(tǒng)調(diào)控基因等[36]。本研究中約73.5 %銅綠假單胞菌的前噬菌體攜帶ARGs，耐藥表型可以分為16種，主要以氨基糖苷類（31/61）、磺胺類（27/61）、氟喹諾酮類（20/61）抗生素為主，與銅綠假單胞菌的抗生素耐藥類型基本相符。

銅綠假單胞菌是ESKAPE（由屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬六大超級細(xì)菌的拉丁學(xué)名首字母組成）病原體之一，對目前用于治療的幾種抗生素，均表現(xiàn)出特有的低敏感性，其耐藥機(jī)制可以分為內(nèi)在性、獲得性以及適應(yīng)性[34]。內(nèi)在耐藥性包括外膜通透性降低、外排泵的表達(dá)和抗生素滅活酶的產(chǎn)生等，獲得抗性則通過水平基因轉(zhuǎn)移或突變來實(shí)現(xiàn)，適應(yīng)耐藥性主要和肺部定植時(shí)生物被膜的形成有關(guān)[34-36]。本研究中對其攜帶的ARGs產(chǎn)生的耐藥機(jī)制進(jìn)行分析，結(jié)果顯示耐藥機(jī)制共七大類，其中，以抗生素失活、抗生素靶點(diǎn)替代為主，與報(bào)道過的銅綠假單胞菌的主要抗生素耐藥機(jī)制基本相符，提示前噬菌體在銅綠假單胞菌對ARGs獲得及傳播中發(fā)揮巨大作用。

銅綠假單胞菌主要的VFs包括：Ⅳ型菌毛、鞭毛、脂多糖、藻酸鹽、熒光性鐵載體和非熒光性鐵載體，以及六種分泌系統(tǒng)，涉及運(yùn)動(dòng)性、黏附性、營養(yǎng)獲取和毒素釋放[37]，而這些VFs大都可以在前噬菌體中被預(yù)測發(fā)現(xiàn)。本研究中59%的前噬菌體攜帶VFs，編碼78種毒力因子，主要為色氨酸合成（78/545）、鞭毛（54/545）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（38/545）等。分析毒力因子的宿主來源，發(fā)現(xiàn)除了相同菌屬外，微黃分枝桿菌（75/545）、百日咳桿菌（64/545）、鳥分枝桿菌及其亞種（22/545）等也在宿主來源中占有較大比例，所以不同環(huán)境條件下，銅綠假單胞菌致病性演變及遺傳進(jìn)化與前噬菌體的分布有關(guān)。

4 結(jié)論與展望

83株銅綠假單胞菌普遍攜帶前噬菌體，前噬菌體占其基因組比例約為2.5%～3.5%，并且大部分前噬菌體攜帶ARGs，產(chǎn)生的耐藥表型主要以氨基糖苷類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為主。59%的前噬菌體攜帶共78種相關(guān)VFs，且多在銅綠假單胞菌毒力性中有過報(bào)道，與目前提出的前噬菌體與其宿主細(xì)菌共同進(jìn)化的結(jié)論相同。在目前臨床治療中，多重耐藥菌的出現(xiàn)，使得新型治療方法不斷開展應(yīng)用，其中，篩選噬菌體疫苗以及人工改造噬菌體被視為抗生素的最好替代品，但在治療過程中仍有大量問題有待解決，隨著噬菌體與宿主的相互作用等方面加深研究，噬菌體在耐藥菌感染防治中會(huì)更加完善化。

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