摘要：當(dāng)前抗菌藥物面臨日趨嚴(yán)重的抗生素耐藥性問(wèn)題，亟需新結(jié)構(gòu)或新作用機(jī)制的抗菌藥?？咕囊蚱渚哂袕V譜抗菌活性和獨(dú)特的殺菌機(jī)制，被認(rèn)為是對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌的潛在治療藥物，有很好的發(fā)展前景。但是，抗菌肽存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被蛋白酶水解等缺點(diǎn)，為抗菌肽的臨床轉(zhuǎn)化帶來(lái)了阻礙。提高多肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以使用非天然氨基酸修飾、環(huán)化等方法，近年來(lái)一種被稱為訂書(shū)修飾的特殊環(huán)化方法受到廣泛關(guān)注，包括使用全碳?xì)滏湣⑷蚧蛘吡虼兼湗颦h(huán)釘子等。訂書(shū)結(jié)構(gòu)的引入可以提高抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，尤其是α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)抗菌肽的活性，還可以抵抗蛋白酶水解，但也存在提高溶血毒副作用的可能。本文介紹了訂書(shū)肽的結(jié)構(gòu)、合成以及研究中的訂書(shū)抗菌肽，并討論了影響其活性的主要因素，以期為新型抗耐藥菌藥物研發(fā)提供幫助。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；訂書(shū)肽；環(huán)化修飾；穩(wěn)定性；結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：R978.1" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號(hào)：1001-8751（2024）04-0217-09

Research Progress on Stapled Antimicrobial Peptides

Mo Qin-zi1，" "Zheng" Heng2

（1 School of Basic Medical Sciences， Guangxi Medical University，" " Nanning" " 530199;

2 College of Life Science and Technology， China Pharmaceutical University，" " Nanjing" "210009）

Abstract：Current antimicrobial chemotherapy faces a significant threat from antibiotic resistance， and novel antimicrobial medication architectures or modes of action are desperately needed." Antimicrobial peptides， due to their broad-spectrum antimicrobial activity and unique bactericidal mechanisms， are considered potential therapeutic agents against multidrug-resistant bacteria with good development prospects. However， antimicrobial peptides have disadvantages such as structural instability and susceptibility to proteolytic degradation， which hinder the clinical translation of these peptides. Improving the structural stability of peptides can be achieved by various methods， such as non-natural amino acid modifications and cyclization. In recent years， a particular cyclization method called stapling modification has gained significant attention. This method involves the use of all carbon-hydrogen， triazole or thioether based staples. The addition of stapling structures can enhance antimicrobial activity， improve the stability of antimicrobial peptide structures， especially α-helical structures， and resist proteolytic degradation. However， it may also increase hemolytic side effects. This review introduces the structure， and synthesis of stapled peptides." In an effort to support the creation of novel antimicrobial medications against resistant bacteria， we present instances of stapled antimicrobial peptides in research and go over the key variables affecting their efficacy..

Key words： antimicrobial peptides；stapled peptides；cyclization modifications；stability；structure

抗生素的臨床使用對(duì)治療細(xì)菌感染、降低死亡率、延長(zhǎng)人類壽命起到了重要作用，然而細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)使得抗生素的抗菌效力不斷下降，抗生素耐藥性（Anti-microbial resistance，AMR）問(wèn)題已成為全球十大健康威脅之一[1]，據(jù)估計(jì)，2019年全球有495萬(wàn)人的死亡與AMR有關(guān)，其中有127萬(wàn)是直接由AMR導(dǎo)致的死亡[2]。解決抗生素耐藥性的一個(gè)直接策略是尋找具有新型作用機(jī)制的抗菌化合物，并且盡可能不易產(chǎn)生耐藥性。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一類天然的宿主防御短肽，由生物體的固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，具有廣譜的抗菌活性[3-4]，其作用機(jī)制包括破壞細(xì)胞膜、抑制DNA或蛋白質(zhì)合成等，與常規(guī)的抗生素相比，由于作用機(jī)制類型繁多，微生物難以對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥性[5]，在抗耐藥菌領(lǐng)域的研發(fā)日益受到關(guān)注。

目前雖然已鑒定、設(shè)計(jì)和合成許多高活性抗菌肽，如在我們構(gòu)建的DRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄2萬(wàn)多條AMPs[6]，但是進(jìn)入臨床的抗菌肽仍較少，且大多是外用消炎抗菌[7]。這主要是因?yàn)樘烊话被峤M成的抗菌肽易被蛋白酶降解、體內(nèi)穩(wěn)定性低、在血清和高鹽濃度中易失活[7]，而含非天然氨基酸的抗菌肽制備工藝復(fù)雜，限制了其研究和應(yīng)用。此外，抗菌肽還可能具有非特異性的溶膜作用，產(chǎn)生溶血和細(xì)胞毒性等，為此需要研發(fā)新的改造手段，以期提高抗菌肽穩(wěn)定性、降低毒性，促其臨床轉(zhuǎn)化。

訂書(shū)肽是一種特殊的環(huán)化修飾結(jié)構(gòu)肽，最初是在研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（Protein–protein interactions，PPI）時(shí)被引入。很多PPI是以二級(jí)結(jié)構(gòu)為支撐骨架的亞結(jié)構(gòu)形成，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)是最為普遍的作用片段[8]，這些 α-螺旋肽的平均長(zhǎng)度較短，可單獨(dú)合成PPI界面上的α-螺旋肽，并有望得到能與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的活性多肽藥物。但是參與PPI的 α-螺旋長(zhǎng)度較短，通常在8～12個(gè)氨基酸殘基，直接截取合成該片段難以保持穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)[9]。2000年，Verdine等報(bào)道了一種穩(wěn)定多肽α-螺旋結(jié)構(gòu)的方法[10]，根據(jù)α-螺旋主鏈 i、i+4、i+7等位點(diǎn)上側(cè)鏈處于同側(cè)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 如果將i和 i+4、i+7 之間側(cè)鏈用連接分子橋接成環(huán)狀，則可以穩(wěn)定 α-螺旋構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)類似用訂書(shū)釘將α-螺旋結(jié)構(gòu)固定，故被稱為訂書(shū)肽 （Stapled peptide）[9]。訂書(shū)肽這一特殊結(jié)構(gòu)使多肽可通過(guò)細(xì)胞膜，難被蛋白酶水解，在生物體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，被應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、抗病毒及細(xì)胞信號(hào)通路等研究領(lǐng)域。本文將著重介紹訂書(shū)肽在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用，以期為新型抗耐藥菌藥物研發(fā)提供幫助。

1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

1.1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)

從結(jié)構(gòu)上看，抗菌肽通常有四種類型：α-螺旋，β-折疊，αβ混合和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。目前研究較為廣泛的是α-螺旋結(jié)構(gòu)[11]，該類抗菌肽能與各種類型的膜相互作用，具有廣譜的抗微生物活性。通常α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽由不超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基組成，含兩親性的分子結(jié)構(gòu)，序列中疏水性殘基區(qū)域通常大于30%，凈電荷一般在+2至+10之間，這些特性有助于陽(yáng)離子抗菌肽與陰離子的細(xì)菌細(xì)胞膜相互結(jié)合。目前已有一些抗菌肽處于臨床試驗(yàn)期，如Pexiganan，Maginin的類似物，Omiganan和Indolicidin類似物等[12]。

1.2 抗菌肽的作用機(jī)制

抗菌肽的作用機(jī)制和其序列及結(jié)構(gòu)有關(guān)，通?？梢苑譃槟ぐ邢蜃饔煤头悄ぐ邢蜃饔?。膜靶向作用指抗菌肽通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄露而殺死細(xì)菌[13]。這是抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的主要方式，具體還可以分成三種主要的機(jī)制模型，即桶壁模型，環(huán)孔模型和地毯模型。所謂桶壁模型，就是抗菌肽分子垂直插入細(xì)菌細(xì)胞膜的雙分子層，當(dāng)多肽數(shù)量達(dá)到一定閾值時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致跨膜孔洞的形成，典型的如Alamethicin抗菌肽的破膜機(jī)制[14]。環(huán)孔模型是指抗菌肽分子插入細(xì)菌細(xì)胞膜后，抗菌肽的親水部分與細(xì)胞膜磷脂的極性部分相互作用，不斷地誘導(dǎo)磷脂單層彎曲，形成一個(gè)由多肽和磷脂頭部基團(tuán)排列的孔，具有這種破壞機(jī)制最常見(jiàn)的抗菌肽是MagininⅡ和Lacticin Q[15-16]。而在地毯模型中抗菌肽的多肽分子會(huì)聚集在膜表面，以類似地毯的形式覆蓋它，引起雙分子層張力，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞和膠束形成[17]。

在非膜靶向作用機(jī)制中，抗菌肽的作用不改變膜的完整性，而是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者抑制細(xì)胞壁、核酸和蛋白質(zhì)的合成來(lái)發(fā)揮抗菌作用[18]；或者通過(guò)誘導(dǎo)宿主免疫防御機(jī)制，如誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子或促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到感染部位等發(fā)揮抗菌作用[19]。

1.3 抗菌肽臨床轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題

雖然抗菌肽具有與傳統(tǒng)抗生素不同的多種作用機(jī)制，不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，在抗多重耐藥菌領(lǐng)域是極具潛力的候選藥物，但是抗菌肽的臨床應(yīng)用仍存在極大挑戰(zhàn)。首先，由于天然氨基酸組成的抗菌肽對(duì)于肽酶具有高靈敏性，其生物利用率較低，當(dāng)抗菌肽進(jìn)入到體內(nèi)，往往會(huì)被各種肽酶降解從而無(wú)法發(fā)揮其抗菌作用[20]。其次，一些抗菌肽具有較高的溶血活性，細(xì)胞選擇性差，可能會(huì)同時(shí)作用于細(xì)菌細(xì)胞和宿主細(xì)胞而產(chǎn)生毒副作用[21]。第三，大多數(shù)天然抗菌肽的抗菌活性小于抗生素，并且與傳統(tǒng)的小分子抗菌藥物相比，生產(chǎn)成本較高。此外，抗菌肽結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性使得其易受外在環(huán)境（例如鹽和血清）影響，如一些抗菌肽局部用藥時(shí)，其在體內(nèi)處于解螺旋狀態(tài)而使得抗菌活性大大降低，因此其體內(nèi)抗菌活性可能會(huì)與體外活性有相當(dāng)程度的變化，使得對(duì)于抗菌肽在臨床階段的活性預(yù)測(cè)變得極為困難[22]。因此，需要設(shè)計(jì)篩選新型抗菌肽，提升其體內(nèi)外穩(wěn)定性，降低潛在的毒副作用，促其臨床應(yīng)用。

2 訂書(shū)肽的結(jié)構(gòu)

為提高抗菌肽穩(wěn)定性，可采用的方法包括末端乙酰化或酰胺化、分子內(nèi)二硫鍵、D型氨基酸替換、首尾鏈接成環(huán)[23]以及側(cè)鏈烯烴環(huán)化（訂書(shū)肽）[9] 等。其中，烯烴環(huán)化修飾是近年來(lái)日益受到關(guān)注的改造方法，它可以穩(wěn)定多肽尤其是α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并可提高對(duì)肽酶或蛋白酶的穩(wěn)定性。由于這種鏈接結(jié)構(gòu)像是在多肽側(cè)鏈打入一個(gè)訂書(shū)釘，因此類似修飾方式形成的多肽也被稱為訂書(shū)肽，位于訂書(shū)肽上的成環(huán)結(jié)構(gòu)便稱作釘子（或訂書(shū)釘）。

2.1 訂書(shū)側(cè)鏈修飾的位置

理論上，釘子的連接必須要位于螺旋同一表面的兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈之間，在這種情況下的釘子修飾可以起到穩(wěn)定α-螺旋多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用；因此，考慮到一個(gè)完整的螺旋含有3.6個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)兩個(gè)殘基的釘子總是出現(xiàn)在螺旋的同一側(cè)，那么釘子的位置通常會(huì)位于（i，i+3）、（i，i+4）、（i，i+7） 和 （i，i+11） （圖1A-C）。如果多肽的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可以引入兩個(gè)或以上的釘子進(jìn)行修飾，或者以一個(gè)共用殘基的方式形成雙重訂書(shū)橋（圖1D），從而可以大幅度地提高α-螺旋穩(wěn)定性[24]。這種雙重連接結(jié)構(gòu)類似于用線縫合的形式，因此也稱為縫合肽（Stitched peptides）[25]。

2.2 釘子類型

自從2000年Verdine使用烯烴作為側(cè)鏈連接橋，獲得的訂書(shū)肽具有穩(wěn)定性高，可穿過(guò)細(xì)胞膜等特點(diǎn)，在化學(xué)性質(zhì)及生物活性方面優(yōu)于其他環(huán)化結(jié)構(gòu)，以烯烴為代表的全碳?xì)滏湥ˋll hydrocarbon stapling）連接橋就成為了訂書(shū)肽最主要的釘子類型，除了這一類型外，其他常用的釘子類型還有二硫鍵鏈接[26]、巰基[27]、三唑[28]和偶氮苯[29]等。在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的DRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了181條訂書(shū)抗菌肽，采用全碳?xì)滏溼斪宇愋偷挠啎?shū)抗菌肽占89.5%，其他類型的占10.5%。而在訂書(shū)位點(diǎn)間隔上，（i， i+4）和（i， i+7）是最常見(jiàn)的間隔模式，代表對(duì)肽鏈中一個(gè)螺旋和兩個(gè)螺旋的同側(cè)位點(diǎn)進(jìn)行橋接，所占比重分別為82.4%和16.5%，其他類型僅占1.1%[6]。

3 訂書(shū)肽的合成

3.1 烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解（RCM）反應(yīng)

1998年Grubbs將烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解（RCM）反應(yīng)引入多肽共價(jià)鍵環(huán)化，在合成多肽后通過(guò)對(duì)肽鏈i和i+4位的絲氨酸進(jìn)行側(cè)鏈烯丙基醚化，再通過(guò)烯烴復(fù)分解反應(yīng)得到環(huán)烯基橋穩(wěn)定的α-螺旋肽[30]。Verdine 及其團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上，使用末端具烯烴側(cè)鏈的非天然氨基酸替換訂子位置的氨基酸殘基，并通過(guò)烯烴復(fù)分解反應(yīng)形成環(huán)烯橋。該方法可以在標(biāo)準(zhǔn)固相多肽合成過(guò)程中，在樹(shù)脂結(jié)合肽上通過(guò)釕催化，將一個(gè)Cα-烯基氨基酸與另一個(gè)結(jié)合形成短鏈。如圖2所示，先將i和i+4 位置的兩個(gè)氨基酸先替換為 （S）-戊烯基丙氨酸（S-pentenyl alanine，S5），然后在釕催化下通過(guò)RCM反應(yīng)生成全碳?xì)滏溣啎?shū)肽[9]。Cα的構(gòu)型和短釘?shù)拈L(zhǎng)度會(huì)影響多肽穩(wěn)定性和生物活性，通常Sn或Rn表示Cα的構(gòu)型和非天然氨基酸側(cè)鏈長(zhǎng)度。研究表明，對(duì)于i， i+3類釘子，最佳立體化學(xué)為（R， S），釘子的最佳長(zhǎng)度為6個(gè)碳或8個(gè)碳，通常為（R3+S5）和（R5+S5）；對(duì)于i， i+4類釘子，最佳的立體化學(xué)和連接體長(zhǎng)度為（S5+S5）；對(duì)于i， i+7類釘子是（R8+S5或R5+S8）[31]。除了單釘子外，雙釘子也有所應(yīng)用，通常用來(lái)修飾較長(zhǎng)的肽，它們?cè)谏锘钚苑矫姹葐吾敱憩F(xiàn)得更好。

3.2 三唑橋環(huán)

三唑橋環(huán)方法利用點(diǎn)擊化學(xué)（Click chemistry） 中的Huisgen-1，3 偶極環(huán)加成反應(yīng)，在釘子位置分別引入α-末端具有炔基和疊氮基的非天然氨基酸，然后在 CuSO4與抗壞血酸的催化下發(fā)生Click反應(yīng)，炔基與疊氮基形成三唑橋環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3）[32]。與RCM反應(yīng)引入的烯烴環(huán)相比，該方法所用的銅催化劑遠(yuǎn)比釕催化價(jià)格便宜，且毒性較低，但是這一方法在提高多肽酶解穩(wěn)定性及α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面還需深入研究[7]。

3.3 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)

利用巰基—烯點(diǎn)擊反應(yīng)，在室溫，365 nm光照下，可以將不同長(zhǎng)度的二烯與肽鏈上的巰基縮合構(gòu)建硫代橋環(huán)（圖4）。這一方法先將多肽鏈上釘子位點(diǎn)氨基酸替換成半胱氨酸，然后使用合適長(zhǎng)度的二烯進(jìn)行環(huán)合，具有反應(yīng)條件溫和，其他官能團(tuán)不發(fā)生反應(yīng)，可以在側(cè)鏈氨基酸未經(jīng)保護(hù)的狀態(tài)下引入硫代環(huán)橋，不需要使用金屬催化劑等優(yōu)點(diǎn)[33]。但是使用該方法母肽序列中不能含半胱氨酸，或者需要預(yù)先替換為其他氨基酸殘基，另外生成的硫代橋環(huán)訂書(shū)肽的穩(wěn)定性和毒副作用等還需要進(jìn)一步深入研究。

4 訂書(shū)抗菌肽的研究

訂書(shū)肽通過(guò)側(cè)鏈環(huán)化的方法，提高了α-螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性和代謝穩(wěn)定性，在研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用界面，開(kāi)發(fā)靶向蛋白質(zhì)的多肽藥物等方向提供了新的思路。同時(shí)，由于大部分作用于細(xì)胞膜的抗菌肽具有兩親結(jié)構(gòu)，其α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性直接影響其抗菌活性，引入訂書(shū)結(jié)構(gòu)后可增強(qiáng)抗菌活性和穩(wěn)定性，因此，在抗菌、抗腫瘤、抗病毒等領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景。表1列舉了近年來(lái)報(bào)道的訂書(shū)抗菌肽。

Mourtada等[34]基于Magainin Ⅱ設(shè)計(jì)了新型訂書(shū)肽Mag（i+4）1，15 （A9K， B21A， N22K， S23K）（圖5A），體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，該訂書(shū)肽與母肽Magainin Ⅱ相比，對(duì)大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性增加，且無(wú)溶血和細(xì)胞毒性。在小鼠腹膜炎敗血癥模型中，對(duì)耐黏菌素的鮑曼不動(dòng)桿菌感染顯示出顯著療效，每天靜脈團(tuán)注（Intravenous bolus injection）兩次5 mg/kg訂書(shū)肽，24 h小鼠存活率達(dá)75%，而Magainin Ⅱ給藥組死亡75%，溶劑對(duì)照組小鼠在12 h內(nèi)全部死亡。治療組未觀測(cè)到溶血及腎毒性等副作用，顯示出潛在的臨床應(yīng)用前景。

Yeh等[35]報(bào)道了基于Tilapia piscidin 4 （TP4）的訂書(shū)肽設(shè)計(jì)，通過(guò)改變訂書(shū)殘基位置和數(shù)量，比較了4種不同訂書(shū)肽的體外抗菌活性，其中TP4-3（圖5B）對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的活性與母肽TP4相當(dāng)，但是在人血清中穩(wěn)定性比母肽大幅度增加。在多微生物敗血癥的盲腸結(jié)扎和穿刺（CLP）小鼠模型中，TP4-3改善了存活率（d7時(shí)為87.5%）。此外，與僅使用美羅培南（Meropenem）相比，TP4-3聯(lián)合使用提高了美羅培南治療多微生物敗血癥的療效（d7時(shí)100%存活），而單獨(dú)使用美羅培南的存活率在d7時(shí)為37.5%。

Polybia-MP1是一種天然抗菌肽，長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸殘基。Luong等[36] 將MP1及其突變序列第6位和第10位側(cè)鏈通過(guò)全碳?xì)滏湗蚵?lián)，得到MP1S、MP1S-D8N和MP1S-Q12K三種訂書(shū)肽（圖5C）。與母肽相比，訂書(shū)肽類似物的螺旋度提升了三倍，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的活性大幅度提升，溶血活性有中等程度提升。同時(shí)，訂書(shū)結(jié)構(gòu)修飾使MP1酶解穩(wěn)定性提高了大約70倍，大幅度增加了抗菌肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，表明全碳?xì)溆啎?shū)結(jié)構(gòu)是一種提高多肽穩(wěn)定性的有效手段。

盡管全碳?xì)滏湗蚵?lián)是最常用的訂書(shū)肽結(jié)構(gòu)，一些研究中還嘗試了其他類型的釘子。如Liu等[37]通過(guò)銅（I）催化的疊氮化物—炔烴環(huán)加成得到三唑環(huán)橋訂書(shū)肽C-MP-1（圖5D），C-MPI-1表現(xiàn)出與母肽相似的抗菌活性，但對(duì)胰蛋白酶抗性增強(qiáng)。通過(guò)圓二色散光譜測(cè)定了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明C-MPI-1在水溶液中采用α-螺旋結(jié)構(gòu)溶液，在30 mmol/L十二烷基硫酸鈉和50%三氟乙基中α-螺旋構(gòu)象率比母肽更高，膜穿透性實(shí)驗(yàn)表明MPI和訂書(shū)肽C-MPI-1都是作用在膜上的，表明這些肽將不易受常規(guī)抗性機(jī)制的影響。

除了直接對(duì)抗菌肽進(jìn)行訂書(shū)結(jié)構(gòu)改造外，研究人員還對(duì)抗菌蛋白等進(jìn)行截短和改造。例如CXCL10是一種由宿主對(duì)微生物感染產(chǎn)生的促炎趨化因子，除了影響免疫細(xì)胞遷移和激活的典型受體依賴性作用外，CXCL10還被發(fā)現(xiàn)可以直接殺死多種致病菌。Crawford等[38]使用多肽掃描（Peptide-based mapping）方法將CXCL10分為了9段連續(xù)的多肽，其中C末端片段P9顯示出抗菌活性，但僅在低鹽環(huán)境下可形成α-螺旋構(gòu)象時(shí)才對(duì)革蘭陰性菌有抗菌活性。通過(guò)將P9進(jìn)行訂書(shū)結(jié)構(gòu)修飾（圖5E），得到的訂書(shū)肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌均有抗菌活性。

另一種策略是基于蛋白質(zhì)相互作用界面（PPI）的設(shè)計(jì)，通過(guò)分析PPI介導(dǎo)的細(xì)胞功能和信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)新的抗菌作用靶點(diǎn)。例如Kang等[39]利用結(jié)核分枝桿菌毒素—抗毒素（TA）系統(tǒng)設(shè)計(jì)了新型訂書(shū)抗菌肽。在結(jié)核分枝桿菌TA系統(tǒng)VapBC30中，VapC30作為毒素，具有RNA酶活性引起細(xì)菌死亡；而VapB30是對(duì)應(yīng)的抗毒素，可與VapC30結(jié)合，從而對(duì)VapC30起抑制作用。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組中，有大量的TA系統(tǒng)，占總蛋白的5%。通過(guò)分析VapB30和VapC30相互作用界面，Kang等截取了VapB30中的一段多肽，它可以VapC30非活性區(qū)結(jié)合，阻止VapB30的結(jié)合，從而使VapC30的RNA酶催化區(qū)保留活性，抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)。但由于游離多肽柔性大，通過(guò)添加訂書(shū)修飾得到V30-sp-8（圖5F），可以提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞膜穿透性，對(duì)恥垢分枝桿菌MIC50lt;6.25 μmol/L，優(yōu)于萬(wàn)古霉素和線性的母肽 [39]。

本文所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了訂書(shū)肽活性預(yù)測(cè)模型，基于Magainin Ⅱ母肽設(shè)計(jì)了硫代環(huán)橋訂書(shū)肽Mag2（i+4）0St（圖5G）和Mag2（i+7）11St（圖5F），抗菌活性尤其是抗大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的活性顯著增加[40]。與全碳?xì)滏湗蚵?lián)相比，序列中不需要引入非天然氨基酸S5，也不需要使用釕催化劑，直接將需要加入釘子的氨基酸殘基替換為半胱氨酸，通過(guò)巰基—烯點(diǎn)擊反應(yīng)即可合成。但是缺點(diǎn)是母肽序列中如果有半胱氨酸或者蛋氨酸，需要預(yù)先保護(hù)或替換成其他氨基酸。另外，硫代環(huán)橋訂書(shū)肽在提高抗菌活性的同時(shí)，也可能提高溶血性和毒副作用，目前對(duì)于訂書(shū)肽毒副作用研究尚比較少，缺乏有效的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)手段。

5 總結(jié)與展望

抗菌肽因?yàn)榉€(wěn)定性和溶血性等問(wèn)題限制了其臨床上的應(yīng)用，通過(guò)化學(xué)修飾、引入非天然氨基酸以及環(huán)化等方法可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。近年來(lái)出現(xiàn)的訂書(shū)結(jié)構(gòu)環(huán)化修飾方法，可以有效地穩(wěn)定多肽的螺旋結(jié)構(gòu)，具有增加抗菌活性、增強(qiáng)膜通透性，防止蛋白酶水解等作用，是促進(jìn)抗菌肽臨床轉(zhuǎn)化有效的策略[41]。目前改造和設(shè)計(jì)的方法主要集中于三類：第一種是直接在天然抗菌肽上改造，如對(duì)Magainin Ⅱ、TP4、Polybia-MP1等進(jìn)行訂書(shū)結(jié)構(gòu)修飾，可在不降低母肽抗菌活性的基礎(chǔ)上，提高其體內(nèi)外穩(wěn)定性，部分訂書(shū)肽在小鼠敗血癥模型中顯示出很好的保護(hù)效果；第二種是對(duì)細(xì)胞因子或抗菌蛋白質(zhì)的截短及改造，隨著多肽固相合成技術(shù)的發(fā)展，短鏈多肽在生產(chǎn)、存儲(chǔ)等方面比蛋白質(zhì)大分子更具優(yōu)勢(shì)，因此也是獲得新型抗菌藥物的有效手段；第三種則是利用細(xì)菌體內(nèi)TA系統(tǒng)，根據(jù)毒素—抗毒素相互作用設(shè)計(jì)新型訂書(shū)抗菌肽，由于真核細(xì)胞中缺乏TA系統(tǒng)[42]，因此是很有潛力的新型抗菌藥物研發(fā)策略。

但是，訂書(shū)結(jié)構(gòu)修飾穩(wěn)定α-螺旋結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也可能引起溶血或細(xì)胞毒性的增加?？咕淖饔糜诩?xì)胞膜的選擇性，基于作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的上陰離子細(xì)菌細(xì)胞，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜大多為兩性離子脂質(zhì)[43]， 因而抗菌肽多帶正電荷。訂書(shū)結(jié)構(gòu)修飾時(shí)引入的非天然氨基酸及環(huán)狀側(cè)鏈，可能會(huì)改變?cè)行蛄兴鶐щ姾珊褪杷缑妫瑥亩绊懫淠みx擇性。在序列中引入堿性氨基酸如賴氨酸，可以增加膜選擇性，降低其溶血活性[34]。但是突變位置不同會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)，往往需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)篩選工作。

釘子引入的位置對(duì)于抗菌肽的活性及毒副作用也有重要的影響，為了避免關(guān)鍵殘基被替換引起活性喪失，通?？捎帽彼釖呙璧姆椒▉?lái)確定關(guān)鍵殘基[39]。釘子的數(shù)量可根據(jù)多肽長(zhǎng)度不同考慮單釘子或者雙釘子修飾，通常雙釘子結(jié)構(gòu)對(duì)α-螺旋具有更強(qiáng)的穩(wěn)定作用。

然而不管使用丙氨酸掃描，還是其他氨基酸逐步替換，都需要進(jìn)行大量的篩選實(shí)驗(yàn)。基于肽庫(kù)的快速篩選技術(shù)，如SLAY （Surface localized antimicrobial display）[44]等可以加快天然氨基酸組成的抗菌肽篩選過(guò)程，但是對(duì)于訂書(shū)肽等修飾多肽尚缺乏高通量篩選平臺(tái)。機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能近年來(lái)發(fā)展迅速，并越來(lái)越多地被應(yīng)用于抗菌肽設(shè)計(jì)篩選[45]，但目前大多數(shù)模型集中于天然氨基酸組成抗菌肽的活性預(yù)測(cè)，對(duì)于含修飾氨基酸或訂書(shū)結(jié)構(gòu)的多肽尚缺乏相應(yīng)模型，在抗菌肽溶血作用和穩(wěn)定性方面的預(yù)測(cè)報(bào)道也相對(duì)較少，為此，需要對(duì)訂書(shū)抗菌肽的作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究，從而推進(jìn)其理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化。

參 考 文 獻(xiàn)

World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system （GLASS） report 2022[R/OL]. [2022-12-09]. ISBN： 9789240062702." https：//www.who.int/publications/i/item/9789240062702.

Murray C J， Ikuta K S， Sharara F， et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019： a systematic analysis[J]. Lancet， 2022， 399 （10325）：629-655.

Hamid M N， Friedberg I. Identifying antimicrobial peptides using word embedding with deep recurrent neural networks[J]. Bioinformatics， 2019， 35（12）： 2009–2016.

Mookherjee M， Anderson M A， Haagsman H P， et al. Antimicrobial host defence peptides： functions and clinical potential[J]. Nat Rev Drug Discov， 2020， 19（5）：311–332.

Porto W F， Pires A S， Franco O L. Computational tools for exploring sequence databases as a resource for antimicrobial peptides[J]. Biotechnology Adv， 2017， 35（3）： 337-349.

Shi G， Kang X， Dong F， et al. DRAMP 3.0： an enhanced comprehensive data repository of antimicrobial peptides[J]. Nucleic Acids Res， 2022， 50（D1）：D488-D496.

馬天玥， 朱尤卓， 余冰欣， 等. 抗菌肽的作用機(jī)制與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].抗感染藥學(xué)， 2023， 20（5）：447-452.

Jochim A L， Arora P S. Assessment of helical interfaces in protein-protein interactions [J]. Mol Biosyst， 2009， 5 （9）： 924-926.

Schafmeister C E， Po J， Verdine G L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides [J]. J Am Chem Soc， 2000， 122： 5891-5892.

李博， 楊瀟驍， 李莉. 訂書(shū)肽的合成與活性研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 52（5）： 685-698.

Nguyen L T， Haney E F， Vogel H J. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action [J]. Trends Biotechnol， 2011， 29（9）： 464-472.

Katarzyna E G， Ma?gorzata D. Antimicrobial peptides under clinical trials [J]. Curr Top Med Chem， 2017， 17（5）： 620-628.

仇梓穎， 馬運(yùn)琪. 魚(yú)源β-防御素的生物信息學(xué)分析[J].國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)）， 2024， 45（02）：136-145.

Yang L， Harroun T A， Weiss T M， et al. Barrel-stave model or toroidal model？ A case study on melittin pores [J]. Biophys J， 2001， 81（3）： 1475-1485.

Hallock K J， Lee D K， Ramamoorthy A. MSI-78， an analogue of the magainin antimicrobial peptides， disrupts lipid bilayer structure via positive curvature strain [J]. Biophys J， 2003， 84（5）： 3052-3060.

Yoneyama F， Imura Y， Ohno K， et al. Peptide-lipid huge toroidal pore， a new antimicrobial mechanism mediated by a lactococcal bacteriocin， lacticin Q [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（8）： 3211-3217.

劉艷超， 孫欣， 馬天玥， 等. 抗菌肽的設(shè)計(jì)與臨床研究策略[J].國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)）， 2024， 45（03）：145-153.

Lee B， Hwang J S， Lee D G. Antibacterial action of lactoferricin B like peptide against Escherichia coli： reactive oxygen species-induced apoptosis-like death [J]. J Appl Microbiol， 2020， 129（2）： 287-295.

Gan B H， Gaynord J， Rowe S M， et al. The multifaceted nature of antimicrobial peptides： current synthetic chemistry approaches and future directions[J]. Chem Soc Rev， 2021， 50（13）： 7820-7880.

Di L. Strategic approaches to optimizing peptide ADME properties [J]. AAPS J， 2015， 17（1）： 134-143.

Sarkar T， Chetia M， Chatterjee S. Antimicrobial peptides and proteins： from nature’s reservoir to the laboratory and beyond[J]. Front Chem， 2021， 9： 691532.

Mahlapuu M， Hakansson J， Ringstad L， et al. Antimicrobial Peptides： An Emerging Category of Therapeutic Agents [J]. Front Cell Infect Microbiol， 2016， 6： 194

Di Bonaventura I， Baeriswyl S， Capecchi A， et al. An antimicrobial bicyclic peptide from chemical space against multidrug resistant Gram-negative bacteria [J]. Chem Commun （Camb）， 2018， 54（40）： 5130-5133.

Migon D， Neubauer D， Kamysz W. Hydrocarbon stapled antimicrobial peptides [J]. Protein J， 2018， 37（1）： 2-12.

Hilinski G J， Kim Y W， Hong J， et al. Stitched α-helical peptides via bis ring-closing metathesis [J]. J Am Chem Soc， 2014， 136： 12314-12322.

Kale S S， Villequey C， Kong X D， et al. Cyclization of peptides with two chemical bridges affords large scaffold diversities [J]. Nat Chem， 2018， 10（7）： 715-723.

Cantel S， Le Chevalier Isaad A， Scrima M， et al. Synthesis and conformational analysis of a cyclic peptide obtained via i to i+4 Intramolecular side-chain to side-chain azide-alkyne 1，3-dipolar cycloaddition [J]. J Organic Chemistry， 2008， 73（15）： 5663-5674.

Brunel F M， Dawson P E. Synthesis of constrained helical peptides by thioether ligation： application to analogs of gp41 [J]. Chem Commun （Camb）， 2005， 20： 2552-2554.

Kumita J R， Smart O S， Woolley G A. Photo-control of helix content in a short peptide [J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2000， 97（8）： 3803-3808.

Blackwell H E， Grubbs R H. Highly efficient synthesis of covalently cross-linked peptide helices by ring-closing metathesis[J]. Angew Chem Int Ed Engl， 1998， 37： 3281-3284.

You Y， Liu H， Zhu Y， et al. Rational design of stapled antimicrobial peptides[J]. Amino Acids， 2023，55（4）：421-442.

Cantel S， Isaad Ale C， Scrima M， et al. Synthesis and conformational analysis of a cyclic peptide obtained via i to i+4 intramolecular side-chain to side-chain azide-alkyne 1，3- dipolar cycloaddition [J]. J Org Chem， 2008， 73： 5663-5674.

Wang Y， Chou D H." A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization [J]. Angew Chem Int Ed Engl， 2015， 54： 10931-10934.

Mourtada R， Herce H.D， Yin D J， et al. Design of stapled antimicrobial peptides that are stable， nontoxic and kill antibiotic-resistant bacteria in mice[J]. Nat Biotechnol， 2019， 37：1186-1197.

Yeh J C， Hazam P K， Hsieh C Y， et al. Rational design of stapled antimicrobial peptides to enhance stability and in vivo potency against polymicrobial sepsis[J]. Microbiol Spectr，" 2023， 11（2）：e0385322.

Luong H X， Kim D H， Mai N T， et al. Mono-substitution effects on antimicrobial activity of stapled heptapeptides [J]. Arch Pharm Res， 2017， 40（6）： 713-719.

Liu B， Zhang W， Gou S， et al. Intramolecular cyclization of the antimicrobial peptide polybia-MPI with triazole stapling： influence on stability and bioactivity [J]. J Pept Sci， 2017， 23， 824-832.

Crawford M A， Ward A E， Gray V， et al. Disparate regions of the human chemokine CXCL10 exhibit broad-spectrum antimicrobial activity against biodefense and antibiotic-resistant bacterial pathogens[J]. ACS Infect Dis， 2023， 9（1）：122-139.

Kang S M， Moon H， Han S W， et al. Structure-based de novo design of Mycobacterium tuberculosis VapC-activating stapled peptides[J]. ACS Chem Biol， 2020， 15（9）： 2493-2498.

鄭珩，陳若樂(lè)，游宇豪. 基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型算法構(gòu)建的訂書(shū)抗菌肽及其應(yīng)用[P]. CN 117510590 A， 2023-10-27

Louren?o A L P， Rios T B， da Silva á P， et al. Peptide stapling applied to antimicrobial peptides[J]. Antibiotics， 2023， 12， 1400.

Williams J J， Hergenrother P J. Artificial activation of toxin-antitoxin systems as an antibacterial strategy[J]. Trends Microbiol， 2012， 20：291-298.

Matsuzaki K. Control of cell selectivity of antimicrobial peptides [J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1788（8）： 1687-1692.

Tucker A T， Leonard S P， DuBois C D， et al. Discovery of next-generation antimicrobials through bacterial self-screening of surface-displayed peptide libraries[J].Cell. 2018， 172（3）：618-628.

朱尤卓， 劉紅玉， 游宇豪， 等. 深度學(xué)習(xí)在抗菌肽藥物研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志， 2023， 48（4）：374-380.