摘要：【目的】研究外源脯氨酸對(duì)棉花根際土壤微生物碳源利用和土壤酶活性的影響，深入了解脯氨酸防病促生的生態(tài)機(jī)制。【方法】設(shè)置施用不同濃度（0、50、100、200和400 mmol·L－1）脯氨酸處理，以感黃萎病棉花品種鄂荊1號(hào)為試驗(yàn)材料，利用Biolog-ECO平板法評(píng)價(jià)不同處理的根際土壤微生物群落功能多樣性和碳源利用情況；采用主成分分析比較不同處理的根際土壤微生物的碳源利用特征，測(cè)定棉花根際土壤中脲酶、β-葡萄糖苷酶、中性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性；通過(guò)冗余分析解析土壤酶活性與土壤微生物對(duì)不同類型碳源利用能力的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】除400 mmol·L－1脯氨酸處理的土壤微生物McIntosh指數(shù)顯著上升外，施用脯氨酸處理的土壤優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)及豐富度指數(shù)與空白對(duì)照均無(wú)顯著差異。培養(yǎng)6～20 d，50～200 mmol·L－1脯氨酸處理的土壤微生物代謝活性均低于空白對(duì)照，但差異均不顯著；400 mmol·L－1脯氨酸處理的土壤微生物代謝活性顯著高于空白對(duì)照。土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類具有較高的利用能力。50～400 mmol·L－1脯氨酸處理下，土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸、D-半乳糖酸內(nèi)酯、β-甲基-D-葡萄糖苷、糖原的利用能力顯著提高，對(duì)L-精氨酸、D-半乳糖醛酸、D-木糖、i-赤蘚糖醇的利用能力顯著降低。與空白對(duì)照相比，施用脯氨酸處理導(dǎo)致土壤β-葡萄糖苷酶和脲酶活性顯著降低，對(duì)中性磷酸酶活性無(wú)顯著影響；芳基硫酸酯酶活性隨脯氨酸濃度升高呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。冗余分析表明，脲酶活性與土壤微生物對(duì)L-精氨酸、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力正相關(guān)；β-葡萄糖苷酶活性與土壤微生物對(duì)L-精氨酸、丙酮酸甲酯、D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力正相關(guān)；中性磷酸酶活性與土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、糖原和β-甲基-D-葡萄糖苷的利用能力正相關(guān)；芳基硫酸酯酶活性與土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D-氨基葡萄糖酸、D-半乳糖酸內(nèi)酯、衣康酸和D-甘露醇的利用能力正相關(guān)。以碳水化合物為碳源時(shí)，β-葡萄糖苷酶和脲酶活性與土壤微生物對(duì)糖原的利用能力負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】施用外源脯氨酸改變根際土壤微生物的碳代謝活性，導(dǎo)致土壤中β-葡萄糖苷酶和脲酶活性顯著降低。以碳水化合物為碳源時(shí)，這2種酶活性與土壤微生物對(duì)D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力存在正相關(guān)性，與土壤微生物對(duì)糖原的利用能力存在負(fù)相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：脯氨酸；棉花；根際微生物；土壤酶；Biolog-ECO；碳源利用；冗余分析

Effects of proline on microbial carbon source utilization and enzyme activity in cotton rhizosphere microorganisms

Zhao Weisong， Li Shezeng， Lu Xiuyun， Cui Naqi， Guo Qinggang*， Ma Ping

（Plant Protection Institute， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Centre of Hebei Province/International Science and Technology Joint Research Center on IPM of Hebei Province， Baoding， Hebei 071000， China）

Abstract： [Objective] The objective of this study is to study the effects of exogenous application of proline on carbon source utilization by soil microorganisms in the cotton rhizosphere and soil enzyme activities， and deeply understand the ecological mechanism of proline in disease prevention and cotton growth promotion. [Methods] In this study， the application of different proline concentrations （0， 50， 100， 200 and 400 mmol·L-1） were set， with a cotton Verticillium wilt-susceptible variety Ejing 1 as the experimental material， and the Biolog-ECO plate method was used to evaluate the functional diversity and carbon source utilization of rhizosphere soil microbial communities under different treatments. Principal component analysis was used to compare the carbon source utilization characteristics of rhizosphere soil microorganisms under different treatments. The activities of neutral phosphatase （NP）， arylsulfatase （ASF）， urease （UE）， and β-glucosidase （β-GC） in cotton rhizosphere soil of different treatments were determined， respectively. Redundancy analysis was used to analyze the correlation between soil enzyme activities and the utilization ability of soil microorganisms for different types of carbon sources. [Results] The McIntosh index of soil microorganisms treated with 400 mmol·L-1 proline increased significantly， while there were no significant differences in the Simpson index， Shannon-Wiener index， Richness index， and Pielou index of soil microorganisms treated with proline compared with control. The soil microbial metabolic activities treated with 50-200 mmol·L-1 proline were all lower than that of the blank control after incubating for 6 to 20 days， while the soil microbial metabolic activity treated with 400 mmol·L-1 proline was significantly higher than that of the blank control. Soil microorganisms treated with proline have higher utilization ability for amino acids， carboxylic acids， and carbohydrates. The utilization ability of soil microorganisms treated with 50-400 mmol·L-1 proline was significantly enhanced for L-phenylalanine， D-galactonolactone， β-methyl-D-glucoside， and glycogen; while the utilization ability for L-arginine， D-galacturonic acid， D-xylose， and i-erythritol was significantly reduced. Compared with the blank control， proline treatments significantly reduced the activities of soil β-GC and UE， and had no significant effect on the activity of NP. The activity of ASF showed a trend of first decreasing and then increasing with the increase of proline concentration. Redundancy analysis shows that UE activity was positively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for L-arginine， D-galacturonic acid， γ-hydroxybutyric acid， D-xylose， and i-erythritol; β-GC activity was positively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for L-arginine， pyruvic acid methyl ester， D-xylose， and i-erythritol; NP activity was positively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for L-asparagine，" D-galacturonic acid， γ-hydroxybutyric acid， glycogen， and β-methyl-D-glucoside; ASF activity was positively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for L-phenylalanine， L-serine， L-threonine， glycyl-L-glutamic acid， D-glucosaminic acid， D-galactonolactone， itaconic acid， and D-mannitol， respectively. With carbohydrates as carbon source， the activities of β-GC and UE are negatively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for glycogen. [Conclusion] The proline treatments can change the soil microbial metabolic activities， leading to a significant decrease in the activities of soil β-GC and UE. With carbohydrates as carbon source， the activities of β-GC and UE are positively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for D-xylose and i-erythritol， but negatively correlated with the utilization ability of soil microorganisms for glycogen.

Keywords： proline; cotton; rhizosphere microorganism; soil enzyme; Biolog-ECO; carbon utilization; redundancy analysis

根系分泌物是植物-土壤系統(tǒng)中信息傳遞和物質(zhì)交換的重要載體物質(zhì)，其在調(diào)節(jié)植物-土壤-微生物的互作過(guò)程、根際微生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能方面具有重要作用[1]。根系分泌物能夠通過(guò)植物自身化感作用[2]、招募有益根際微生物[3-5]和改變根際微生態(tài)環(huán)境[6-7]等影響植物土傳病害的發(fā)生。

目前，關(guān)于根系分泌物與寄主、生防微生物和病原微生物互作方面開(kāi)展了大量的研究[8-11]。已有研究表明，黃瓜根系分泌物中色氨酸能夠招募并且提高解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9在黃瓜根部的定殖能力[10]；棉花根系分泌物中脯氨酸能夠招募枯草芽孢桿菌（B. subtilis）NCD-2生物膜的形成，并提高菌株的定殖能力[11]。植物根系分泌物的組成十分復(fù)雜，許多學(xué)者采用外源添加標(biāo)準(zhǔn)溶液模擬根系分泌物，以闡明根系分泌物對(duì)微生物群落的調(diào)控作用[12-16]。田晴等[14]研究表明外源添加小麥根系分泌物能夠降低西瓜根際土壤中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxy-

sporum）的豐度，增加有益微生物毛殼菌屬（Chaetomium sp.）和頂孢霉屬（Acremonium sp.）的相對(duì)豐度。嚴(yán)文輝等[15]研究表明添加外源丁香酸和蘋果酸可明顯改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和潛在功能。楊章明等[16]研究表明，施用外源有機(jī)酸（如肉桂酸）能夠顯著刺激青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的定殖與侵染，并加重?zé)煵萸嗫莶〉陌l(fā)生，但對(duì)煙草植株生長(zhǎng)影響不明顯。此外，根系分泌物對(duì)土壤微生物的影響在一定程度上與物質(zhì)濃度有關(guān)[17]，根系分泌物中低濃度的有機(jī)酸和酚酸類物質(zhì)對(duì)植物種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)主要表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而高濃度則主要是抑制作用[18-19]。然而，關(guān)于根系分泌物對(duì)土壤微生物生態(tài)功能變化情況關(guān)注較少。

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根系分泌物中含有較高比例的脯氨酸，在調(diào)控棉花植株健康生長(zhǎng)及棉花-土壤微生物互作過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[11， 20]，然而脯氨酸對(duì)棉花根際土壤微生物碳源利用和土壤酶活性的影響尚不明確。前期研究表明施用脯氨酸能夠有效降低棉花黃萎病的發(fā)生[20]，然而脯氨酸如何影響棉花根際土壤微生物的微生態(tài)尚不清晰。本研究以施用外源脯氨酸處理的棉花根際土壤為研究對(duì)象，利用Biolog-ECO平板分析脯氨酸處理下土壤微生物的功能多樣性和碳源利用能力，同時(shí)從生理生化水平研究脯氨酸處理對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)相關(guān)酶活性的影響，探究脯氨酸處理下土壤微生物的酶活性與微生物代謝的關(guān)系，初步解析外源脯氨酸對(duì)棉花根際土壤微生物的微生態(tài)效應(yīng)，進(jìn)而揭示脯氨酸防病促生的生態(tài)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花材料是感黃萎病品種鄂荊1號(hào)，由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。L-脯氨酸（簡(jiǎn)稱脯氨酸，CAS：147-85-3，純度≥99.0%）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，使用時(shí)用蒸餾水進(jìn)行稀釋。

次氯酸鈉溶液（分析純，有機(jī)氯含量≥10.0%）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，使用時(shí)用蒸餾水稀釋至1%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選飽滿、均勻一致的棉花種子，先用70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇浸泡3 min，再用1%次氯酸鈉消毒10 min，用無(wú)菌水沖洗3次，最后播種于含有1 kg培養(yǎng)基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土∶土壤＝1∶1）的花盆（上直徑13.5 cm、下直徑9 cm、高11.5 cm）中，每個(gè)花盆中播種10粒種子，每盆保證8株棉苗。將花盆置于日光溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，待棉苗生長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，分別澆施5 mL濃度為50、100、200和400 mmol·L－1的脯氨酸溶液（記作L50、L100、L200和L400），以澆施相同體積的蒸餾水為空白對(duì)照（CK）， 然后每盆灌施蒸餾水200 mL。每7 d澆施1次，共澆施3次。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)各1盆。

1.3 根際土壤的收集

采用抖根法收集根際土壤樣品[20]。具體操作步驟如下：將培養(yǎng)60 d的棉花植株整個(gè)根系完整挖出，輕抖根系，棄去與根系結(jié)合不緊密的土壤，用毛刷清理、收集與根系緊密結(jié)合的土壤，將采集的根際土壤過(guò)篩（孔徑2 mm）后4 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.4 不同處理的根際土壤微生物代謝特征分析

參考趙衛(wèi)松等[21]方法稍作修改，具體操作如下：將4 ℃保存的土壤樣品放在培養(yǎng)箱于25 ℃活化24 h，準(zhǔn)確稱取3 g土壤樣品加到27 mL無(wú)菌的0.85 mol·L－1 NaCl溶液，于25 ℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng)45 min，然后用上述無(wú)菌的0.85 mol·L－1 NaCl溶液稀釋1 000倍制備成接種液并轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液槽中，利用8孔道排槍向Biolog-ECO平板孔加入150 μL接種液，對(duì)照孔加入相同體積的無(wú)菌的0.85 mol·L－1 NaCl溶液。將平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 d，利用ELxS08-Biolog微孔板讀數(shù)儀測(cè)定樣品在590 nm和750 nm的吸收值（分別用A590和A750表示），試驗(yàn)重復(fù)3次。采用培養(yǎng)20 d的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算下列參數(shù)，以對(duì)不同脯氨酸處理下根際土壤微生物代謝特征進(jìn)行分析，計(jì)算公式如下：

平均顏色變化率（average well color development，AWCD），用來(lái)評(píng)價(jià)不同脯氨酸處理下土壤微生物對(duì)碳源的利用能力。微生物代謝活性用A590－A750計(jì)算，若數(shù)值小于0.06則記作0。

AWCD＝" " （1）

式中，Ci和K分別表示第i孔和對(duì)照孔的微生物代謝活性，n為碳源種類數(shù)，本研究中為31。

優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Simpson index， D）用來(lái)評(píng)估土壤微生物群落的物種優(yōu)勢(shì)度。

D＝1－∑Pi2 （2）

Pi＝ （3）

香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener index， H）用來(lái)評(píng)估群落中物種的多樣性。

H＝－∑（Pi×lnPi） （4）

McIntosh指數(shù)（McIntosh index， U）是基于群落物種多維空間上的歐氏距離多樣性指數(shù)。

U＝" （5）

式中，ni為第i孔的相對(duì)吸光值即Ci－K。

均勻度指數(shù)（Pielou index， J）：

J＝ （6）

式中，S為能被利用的碳源總數(shù)。

豐富度指數(shù)（Richness index， R），表示可被利用的碳源總數(shù)目，本研究中為相對(duì)吸光值大于0.06的孔數(shù)。

土壤微生物對(duì)碳源的相對(duì)利用率，以所有處理中最大AWCD值為基準(zhǔn)，其他處理的AWCD與基準(zhǔn)值之比。

1.5 土壤酶活性測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[21]的方法分別測(cè)定與土壤氮、磷循環(huán)相關(guān)的土壤脲酶（urease， UE）活性和中性磷酸酶（neutral phosphatase， NP）活性。按照參考文獻(xiàn)[22]的方法測(cè)定與碳、硫循環(huán)相關(guān)的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase， β-GC）和芳基硫酸酯酶（arylsulfatase， ASF）活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯新復(fù)極差法多重比較不同處理間的顯著性差異。采用Canoco 4.5軟件和CanoDraw軟件分別進(jìn)行主成分分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源脯氨酸對(duì)棉花根際土壤微生物功能多樣性的影響

根際土壤微生物功能多樣性分析結(jié)果表明，除400 mmol·L－1脯氨酸處理下土壤微生物的McIntosh指數(shù)顯著上升外，其他脯氨酸處理下土壤微生物優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、McIntosh指數(shù)、香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)及豐富度指數(shù)與空白對(duì)照之間不存在顯著差異（表1）。

2.2 外源脯氨酸對(duì)土壤微生物代謝活性的影響

從圖1可以看出，培養(yǎng)0～6 d，土壤微生物的AWCD很低，說(shuō)明微生物的代謝活性較低；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理的AWCD均呈上升趨勢(shì)，其中400 mmol·L－1脯氨酸處理的土壤微生物代謝活性顯著高于空白對(duì)照，50～200 mmol·L－1脯氨酸處理的土壤微生物代謝活性均低于空白對(duì)照，但無(wú)顯著差異（圖1）。

2.3 外源脯氨酸處理的根際土壤微生物的碳源利用分析

2.3.1 外源脯氨酸處理的根際土壤微生物對(duì)碳源利用的主成分分析。主成分分析結(jié)果表明，除50 mmol·L－1脯氨酸處理外，其他濃度脯氨酸處理的土壤微生物的碳源與空白對(duì)照在主成分坐標(biāo)中位于不同的象限，表明與空白對(duì)照相比，100～400 mmol·L－1脯氨酸處理下根際土壤微生物對(duì)碳源的利用存在差異。第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別解釋所有變量的94.2%和2.9%，2個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率為97.1%，說(shuō)明其能夠表征土壤微生物的碳源利用特征（圖 2）。

2.3.2 外源脯氨酸處理下根際土壤微生物對(duì)碳源的利用特征分析。通過(guò)相對(duì)利用率比較不同處理下根際土壤微生物的碳源利用能力，從圖3可以看出，棉花根際土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類碳源的利用率較高。脯氨酸處理下土壤微生物對(duì)不同碳源的利用能力存在不同程度的差異。400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)羧酸類、氨基酸類和碳水化合物類碳源的利用能力，顯著降低了土壤微生物對(duì)聚合物類和雙親類化合物的利用能力，土壤微生物對(duì)胺類物質(zhì)的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著。脯氨酸濃度為200 mmol·L－1和100 mmol·L－1處理顯著提高了土壤微生物對(duì)羧酸類物質(zhì)的利用能力，顯著降低了土壤微生物對(duì)碳水化合物類、聚合物類和雙親類化合物的利用能力，土壤微生物對(duì)胺類和氨基酸類物質(zhì)的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著。50 mmol·L－1脯氨酸處理顯著降低了土壤微生物對(duì)胺類、聚合物類和雙親類化合物的利用能力，對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類物質(zhì)的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著。

2.3.3 外源脯氨酸處理下根際土壤微生物對(duì)主要碳源的利用比較。進(jìn)一步分析比較脯氨酸處理下根際土壤微生物對(duì)氨基酸類、碳水化合物類和羧酸類碳源的具體利用情況（圖4）。在氨基酸類方面（圖4A），不同脯氨酸處理不同程度地顯著降低土壤微生物對(duì)L-精氨酸的利用能力。脯氨酸濃度為200 mmol·L－1的處理顯著降低了土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸的利用能力，脯氨酸濃度為100 mmol·L－1和400 mmol·L－1的處理顯著提高了土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸的利用能力，而脯氨酸濃度為50 mmol·L－1的處理下土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著。施用脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸的利用能力；200 mmol·L－1和400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高土壤微生物對(duì)L-絲氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸的利用能力；400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高土壤微生物對(duì)L-蘇氨酸的利用能力，而其他濃度處理對(duì)土壤微生物對(duì)L-蘇氨酸的利用能力與空白對(duì)照無(wú)顯著差異。

在羧酸類方面（圖4B），50 mmol·L－1脯氨酸處理下土壤微生物對(duì)衣康酸、α-丁酮酸、丙酮酸甲酯和D-氨基葡萄糖酸的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著，但土壤微生物對(duì)D-半乳糖醛酸、4-羥基苯甲酸和γ-羥基丁酸的利用能力顯著降低，對(duì)D-半乳糖酸內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸和D-蘋果酸的利用能力則顯著提高。100 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)D-半乳糖酸內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸、衣康酸、D-蘋果酸和D-氨基葡萄糖酸的利用能力，顯著降低了土壤微生物對(duì)D-半乳糖醛酸的利用能力，未顯著影響微生物對(duì)其他羧酸類物質(zhì)的利用能力。200 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)D-半乳糖酸內(nèi)酯和衣康酸的利用能力，顯著降低了土壤微生物對(duì)D-半乳糖醛酸的利用能力，未顯著影響微生物對(duì)其他羧酸類物質(zhì)的利用能力。脯氨酸濃度為400 mmol·L－1處理下，土壤微生物對(duì)D-半乳糖酸內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、衣康酸、D-蘋果酸和D-氨基葡萄糖酸的利用能力顯著提高，對(duì)D-半乳糖醛酸的利用能力顯著降低，對(duì)γ-羥基丁酸、α-丁酮酸和丙酮酸甲酯的利用能力與空白對(duì)照差異不顯著。

在碳水化合物類方面（圖4C），脯氨酸濃度為50 mmol·L－1和200 mmol·L－1的處理顯著提高土壤微生物對(duì)β-甲基-D-葡萄糖苷和糖原的利用能力，顯著降低壤微生物對(duì)D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力，未顯著影響土壤微生物對(duì)D-甘露醇和α-D-乳糖的利用能力。脯氨酸濃度為100 mmol·L－1和400 mmol·L－1的處理顯著提高了土壤微生物對(duì)β-甲基-D-葡萄糖苷、糖原和α-D-乳糖的利用能力，顯著降低對(duì)D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力，100 mmol·L－1脯氨酸處理還顯著降低土壤微生物對(duì)D-甘露醇和D-纖維二糖的利用能力。

2.4 施用脯氨酸對(duì)根際土壤酶活性的影響

研究結(jié)果（表2）表明，施用不同濃度脯氨酸對(duì)棉花根際土壤酶活性產(chǎn)生不同程度的影響。施用脯氨酸顯著降低了β-葡萄糖苷酶活性和脲酶活性，而對(duì)中性磷酸酶活性無(wú)顯著影響。50 mmol·L－1和100 mmol·L－1脯氨酸處理顯著降低了芳基硫酸酯酶的活性，而200 mmol·L－1和400 mmol·L－1脯氨酸處理下芳基硫酸酯酶活性與空白對(duì)照差異不顯著。

2.5 土壤酶活性與碳源利用能力的相關(guān)性分析

施用脯氨酸處理的土壤酶活性與土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類碳源利用能力的冗余分析結(jié)果（圖5）表明，對(duì)于氨基酸類碳源，脲酶和β-葡萄糖苷酶活性與土壤微生物對(duì)L-精氨酸的利用能力存在正相關(guān)性，與土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸的利用能力存在負(fù)相關(guān)性；中性磷酸酶活性與土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸的利用能力存在正相關(guān)性；芳基硫酸酯酶活性與土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸的利用能力存在正相關(guān)性，而與土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸的利用能力存在負(fù)相關(guān)性（圖5A）。

對(duì)于羧酸類碳源，脲酶和中性磷酸酶活性與土壤微生物對(duì)D-半乳糖醛酸和γ-羥基丁酸的利用能力存在正相關(guān)性；β-葡萄糖苷酶活性與土壤微生物對(duì)丙酮酸甲酯的利用能力存在正相關(guān)性；芳基硫酸酯酶活性與土壤微生物對(duì)丙酮酸甲酯的利用能力存在負(fù)相關(guān)性，而與土壤微生物對(duì)D-半乳糖酸內(nèi)酯、D-氨基葡萄糖酸、衣康酸、α-丁酮酸和4-羥基苯甲酸的利用能力存在正相關(guān)性（圖5B）。

對(duì)于碳水化合物類碳源，脲酶和β-葡萄糖苷酶活性與土壤微生物對(duì)D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力存在正相關(guān)性，而與土壤微生物對(duì)糖原的利用能力存在負(fù)相關(guān)性；中性磷酸酶活性與土壤微生物對(duì)糖原和β-甲基-D-葡萄糖苷的利用能力存在正相關(guān)性；芳基硫酸酯酶活性與土壤微生物對(duì)D-甘露醇的利用能力存在正相關(guān)性，而與土壤微生物對(duì)D-纖維二糖的利用能力存在負(fù)相關(guān)性（圖5C）。

3 討論

根系分泌物是1把“雙刃劍”，在調(diào)控植物病害發(fā)生方面具有重要作用[23-29]。已有研究表明，感黃萎病橄欖品種產(chǎn)生的根系分泌物能顯著誘導(dǎo)病菌分生孢子和微菌核的萌發(fā)[23]；煙草根系分泌物苯甲酸和3-苯基丙酸能夠促進(jìn)煙草青枯病菌（R. solanacearum）的生長(zhǎng)并加重病害發(fā)生程度[30]。然而，番茄植株根系分泌的蘋果酸能吸引有益菌解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）T-5[26]，西瓜根系分泌物的蘋果酸和檸檬酸能夠招募多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）SQR-21在寄主根際定殖發(fā)揮防病促生作用[27]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，外源施用低濃度脯氨酸促進(jìn)黃萎病的發(fā)生，而高濃度脯氨酸能夠降低黃萎病發(fā)生[20]。

Biolog方法是基于微生物群落對(duì)不同碳源的利用程度來(lái)表征微生物功能的動(dòng)態(tài)變化，廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落功能多樣性的研究[21， 31-32]。土壤微生物功能多樣性是描述土壤微生物群落特征的1個(gè)重要指標(biāo)[33-34]，其與土壤營(yíng)養(yǎng)元素（如碳、氮、磷等）循環(huán)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程存在密切關(guān)系[35]。土壤微生物功能多樣性和植物健康狀況有一定相關(guān)性，土壤微生物多樣性能夠影響植物土傳病害的發(fā)生[21， 36-37]。根系分泌物介導(dǎo)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能變化對(duì)寄主的生長(zhǎng)發(fā)育能夠產(chǎn)生重要的影響[1， 38-39]。沈鳳英等[38]研究表明，高濃度的根系分泌物能夠顯著改變夾竹桃根際土壤微生物群落功能多樣性。嚴(yán)文輝等[15]研究表明添加外源蘋果酸能顯著提高番茄植株根際細(xì)菌群落的短鏈有機(jī)酸降解能力，添加外源丁香酸可降低細(xì)菌生物膜的形成能力并提高細(xì)菌群落對(duì)芳香族化合物的降解能力。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，脯氨酸處理下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異（400 mmo·L－1脯氨酸處理下的McIntosh指數(shù)除外），但大部分處理下土壤微生物的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)呈上升趨勢(shì)。推測(cè)脯氨酸能改變土壤微生物群落功能多樣性，降低土傳病害的發(fā)生，與前人研究的觀點(diǎn)相似[1，" 38-39]。通過(guò)對(duì)不同類型碳源物質(zhì)的相對(duì)利用率分析發(fā)現(xiàn)，施用脯氨酸對(duì)棉花根際土壤微生物的碳源利用存在不同程度的影響，其中400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類碳源的利用能力，顯著降低對(duì)聚合物類和雙親化合物類碳源的利用能力。進(jìn)一步分析表明，400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)L-天冬酰胺酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D-半乳糖酸內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、衣康酸、D-蘋果酸、D-氨基葡萄糖酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、糖原和α-D-乳糖的利用能力。值得注意的是，植物根系分泌物成分復(fù)雜，基于上述對(duì)土壤微生物碳代謝特征的研究結(jié)果，將脯氨酸與不同類型氨基酸、碳水化合物或者羧酸類物質(zhì)聯(lián)合使用是否改變棉花農(nóng)藝性狀以及黃萎病的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和轉(zhuǎn)化的動(dòng)力，其潛在的生物化學(xué)活性對(duì)土壤生態(tài)功能具有重要意義。已有研究表明，植物根系分泌物能夠?qū)ν寥烂富钚援a(chǎn)生不同程度的影響，改善土壤肥力進(jìn)而影響植物的健康生長(zhǎng)[40-42]。彭雪梅等[40]研究發(fā)現(xiàn)空心蓮子草根系分泌物改變了土壤酶活性，使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和功能向著有利于植物生長(zhǎng)的方向轉(zhuǎn)化。劉澤淼等[42]研究表明低濃度外源芍藥內(nèi)酯苷處理能提高芍藥根中可溶性蛋白和脯氨酸含量，改善土壤酶活性，促進(jìn)芍藥的生長(zhǎng)發(fā)育；高濃度芍藥內(nèi)酯苷處理則抑制芍藥生長(zhǎng)、降低成花率。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明外源施用脯氨酸降低土壤銨態(tài)氮含量，而對(duì)速效磷含量無(wú)顯著影響，對(duì)棉花株高和地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量 具有促進(jìn)作用[20]。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，施用脯氨酸顯著降低β-葡萄糖苷酶和脲酶活性，對(duì)中性磷酸酶活性無(wú)顯著影響。隨著脯氨酸濃度升高，芳基硫酸酯酶活性呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，且400 mmol·L－1脯氨酸處理與空白對(duì)照的酶活性不存在顯著差異。由此推測(cè)，外源施用脯氨酸能夠通過(guò)降低土壤脲酶活性，改變土壤銨態(tài)氮含量，在一定程度上發(fā)揮防病促生作用。

根系分泌物是調(diào)控根際微生態(tài)功能的重要因素，也是植物與土壤交流的主要媒介[43]。根系分泌物成分復(fù)雜，根際微環(huán)境受到多種因素影響。本研究通過(guò)澆灌不同濃度的脯氨酸對(duì)根際土壤酶活性、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝功能產(chǎn)生不同程度的影響，表明根際土壤微環(huán)境與植物根系分泌物濃度有密切關(guān)系。此外，棉花抗/感黃萎病品種產(chǎn)生的根系分泌物種類及濃度不同，導(dǎo)致根際微生物結(jié)構(gòu)和功能存在差異[44]。本研究?jī)H以棉花感病品種為試驗(yàn)材料開(kāi)展研究，對(duì)于棉花抗病品種根際微生物的微生態(tài)效應(yīng)的影響，有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)，已有研究表明，脯氨酸在緩解植物逆境（鹽脅迫、干旱、重金屬污染、凍害等）損傷方面具有重要的作用[45-49]。曾鈺等[45]研究認(rèn)為外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)缺硼條件下棉花植株生長(zhǎng)；戴茂華等[46]研究認(rèn)為干旱條件下棉花葉片的脯氨酸含量增加能夠抵御植株干旱脅迫；楊艷兵等[47]研究表明棉花在鹽脅迫下，植株體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加。高彥強(qiáng)等[48]研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施適宜濃度的脯氨酸能夠有效緩解鹽脅迫下芹菜株高、莖粗及葉片葉綠素含量的降低，促進(jìn)根系形態(tài)建成及生物量的積累，增強(qiáng)光合作用。陳奮奇等[49]研究表明外源脯氨酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、滲透溶質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)離子平衡能力來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)玉米幼苗的傷害作用。然而，在病原菌脅迫下脯氨酸處理對(duì)棉花植株氧化酶活性產(chǎn)生何種影響以及內(nèi)生微生物如何變化有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

培養(yǎng)6～20 d，50～200 mmol·L－1脯氨酸處理對(duì)棉花根際土壤微生物的代謝活性無(wú)顯著影響，而400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高土壤微生物代謝活性?？瞻讓?duì)照和外源脯氨酸處理下，棉花根際土壤微生物對(duì)羧酸類、氨基酸類和碳水化合物類物質(zhì)的平均相對(duì)利用率較高，施用脯氨酸處理影響根際微生物對(duì)上述化合物的利用能力：50～400 mmol·L－1脯氨酸處理顯著提高了土壤微生物對(duì)L-苯丙氨酸、D-半乳糖酸內(nèi)酯、β-甲基-D-葡萄糖苷、糖原的利用能力，顯著降低了土壤微生物對(duì)L-精氨酸、D-半乳糖醛酸、D-木糖、i-赤蘚糖醇的利用，未顯著影響微生物對(duì)α-丁酮酸和丙酮酸甲酯的利用能力。施用脯氨酸處理顯著降低土壤β-葡萄糖苷酶和脲酶活性；在以碳水化合物為碳源時(shí)，這2種酶的活性與土壤微生物對(duì)D-木糖和i-赤蘚糖醇的利用能力存在正相關(guān)性，而與土壤微生物對(duì)糖原的利用能力存在負(fù)相關(guān)性。

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（責(zé)任編輯：王國(guó)鑫 責(zé)任校對(duì)：秦凡）