摘要：【目的】對(duì)棉花衣分和鈴重進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，挖掘相關(guān)的候選基因，為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和分子設(shè)計(jì)育種提高棉花產(chǎn)量提供遺傳基礎(chǔ)?！痉椒ā坷?00份陸地棉種質(zhì)資源重測(cè)序（10×）數(shù)據(jù)和3 055 642個(gè)高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）對(duì)2年5個(gè)環(huán)境及最佳線(xiàn)性無(wú)偏預(yù)測(cè)值（best linear unbiased predictive value， BLUP）的衣分和鈴重進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和候選基因。【結(jié)果】衣分和鈴重在不同環(huán)境下存在較廣泛的變異，衣分平均變異系數(shù)為9.40%，遺傳力為92.81%；鈴重平均變異系數(shù)為11.96%，遺傳力為86.67%。不同環(huán)境間，群體的鈴重呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，衣分也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。群體結(jié)構(gòu)分析、主成分分析和系統(tǒng)發(fā)育分析將300份陸地棉分為6個(gè)亞群，全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測(cè)到223個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus， QTL）與衣分相關(guān)，89個(gè)QTL與鈴重相關(guān)。對(duì)衣分中篩選到的3個(gè)穩(wěn)定的QTL qLP_Gh5.18、qLP_Gh12.43和qLP_Gh17.2進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)17個(gè)相關(guān)候選基因；對(duì)鈴重中篩選到的2個(gè)穩(wěn)定的QTL qBW_Gh7.5和qBW_Gh19.5進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)相關(guān)候選基因。【結(jié)論】在300份陸地棉群體中鑒定到5個(gè)穩(wěn)定的QTL與棉花衣分和鈴重關(guān)聯(lián)，挖掘到25個(gè)與衣分和鈴重相關(guān)的候選基因。

關(guān)鍵詞：陸地棉；衣分；鈴重；全基因組關(guān)聯(lián)分析

Genome-wide association study of cotton lint percentage and boll weight

Du Xiao1， Long Yilei1， Tan Yanping1， Li Lili2， Wang Yin1， Jin Shen1， Yang Yinan1， Ai Xiantao3*

（1." College of Life Science and Technology， Xinjiang University/Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering， Urumqi 830000， China; 2. Kuqa Modern Agricultural Science and Innovation Center， Kuqa， Xinjiang 842000， China; 3. College of Intelligent Agriculture （Research Institute）， Xinjiang University， Urumqi 830000， China）

Abstract： [Objective] This study aims to perform genome-wide asscciation study of cotton yield traits， such as lint percentage （LP） and boll weight（BW）， and to mine the candidate genes， and may be helpful for improving cotton yield through molecular marker-assisted selection and molecular design breeding. [Methods] Genome-wide association study was performed using 300 upland cotton germplasms resequencing （10×） data and 3 055 642 high-quality single nucleotide polymorphism （SNP） for LP and BW in five environments and best linear unbiased predictive value （BLUP） for two years to detect significant association loci and candidate genes. [Results] The cotton LP and BW showed wide variations in different environments， with an average coefficient of variation of 9.40% and heritability of 92.81% for LP， and an average coefficient of variation of 11.96% and heritability of 86.67% for BW. BW is significantly positively correlated in different environments. It’s the same with LP. Population structure analysis， principal component analysis， and phylogenetic analysis classified the 300 upland cotton lines into six subgroups. Genome-wide association study detected a total of 223 quantitative trait locus （QTL） associated with LP and 89 QTL associated with BW. The three stable QTL qLP_Gh5.18， qLP_Gh12.43， and qLP_Gh17.2 screened in LP were further analyzed， and 17 related candidate genes were found. Two stable QTL qBW_Gh7.5 and qBW_Gh19.5 related to BW were further analyzed， and 8 related candidate genes were identified. [Conclusion] Five stable QTL were identified in 300 up land cotton lines associated with cotton LP and BW， and a total of 25 candidate genes related to LP and BW were mined.

Keywords： Gossypium hirsutum L.; lint percentage; boll weight; genome-wide association study

棉花（Gossypium）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，為紡織品生產(chǎn)提供了天然纖維[1]。陸地棉具有高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣的特點(diǎn)，是栽培最廣泛的棉種。隨著全球人口的增長(zhǎng)和工業(yè)化的不斷發(fā)展，紡織工業(yè)對(duì)棉花的需求持續(xù)增長(zhǎng)。培育高產(chǎn)的棉花品種是棉花育種者不懈追求的目標(biāo)。由于長(zhǎng)期人工選擇育種，陸地棉品種遺傳多樣性降低、遺傳背景狹窄[2]，這無(wú)疑增加了通過(guò)常規(guī)育種手段提高棉花產(chǎn)量的難度。因此，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study， GWAS）挖掘與產(chǎn)量性狀相關(guān)的優(yōu)良基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus， QTL），對(duì)于加速棉花高產(chǎn)分子育種具有十分重要的意義。

鈴重（boll weight， BW）和衣分（lint percentage， LP）是重要的棉花產(chǎn)量性狀，也是典型的數(shù)量性狀，容易受到環(huán)境因素的影響[3]。大量學(xué)者通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)和雙親連鎖作圖技術(shù)，鑒定了許多與棉花產(chǎn)量性狀相關(guān)的QTL[4-8]，這些研究為解析棉花產(chǎn)量性狀的分子機(jī)理及分子標(biāo)記輔助選擇（molecular marker-assisted selection， MAS）育種提供了基礎(chǔ)。然而，這些來(lái)自種間群體的QTL大多定位于非常大的遺傳區(qū)域，往往不穩(wěn)定，因此不能直接應(yīng)用于陸地棉改良[9]。GWAS是以連鎖不平衡（linkage disequilibrium， LD）為基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)成千上萬(wàn)的分子標(biāo)記，篩選出與目標(biāo)性狀表型變異相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，進(jìn)而分析關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記對(duì)表型的遺傳效應(yīng)[10]。因分辨率高、成本低、不需要系譜等優(yōu)勢(shì)，GWAS已逐漸成為解析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的有效方法，利用該方法在棉花株型[11-12]、纖維品質(zhì)[13-16]、抗性[17-18]等性狀的相關(guān)研究中挖掘了大量的QTL/基因。在棉花產(chǎn)量性狀的研究中，Zhu等[19]對(duì)13個(gè)不同地點(diǎn)的242個(gè)棉花種質(zhì)進(jìn)行GWAS分析，報(bào)道了95個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的非冗余QTL，其中包括12個(gè)在6個(gè)及以上環(huán)境檢測(cè)到的穩(wěn)定的QTL和1個(gè)重要基因Gh_A07G1389，該基因編碼四肽重復(fù)樣超家族蛋白，與超短纖維突變體（Liy）相關(guān)基因同源。Sun等[20]利用SNP63K陣列對(duì)719份棉花進(jìn)行了基因分型，鑒定出2個(gè)提高皮棉產(chǎn)量的基因Gh_

D03G1064和Gh_D12G2354。Song等[21]利用SNP63K陣列對(duì)276份棉花進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)Gh_D05G0313和Gh_D05G1124在胚珠和纖維發(fā)育階段高表達(dá)。Wang等[22]利用SNP80K陣列對(duì)189個(gè)棉花進(jìn)行基因分型，鑒定了與BW相關(guān)的候選基因Gh_A02G1473、Gh_A10G1765和Gh_

A02G1442。這些重要候選基因的發(fā)掘?yàn)槊藁ǜ弋a(chǎn)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）的標(biāo)記密度是影響GWAS準(zhǔn)確性的主要因素之一[23]，上述棉花產(chǎn)量性狀相關(guān)研究中由于受SNP標(biāo)記密度的影響，導(dǎo)致挖掘的候選基因數(shù)量受限。本研究以300份不同來(lái)源的陸地棉重測(cè)序（10×）數(shù)據(jù)，對(duì)5個(gè)環(huán)境下的BW和LP進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析，以確定遺傳位點(diǎn)與產(chǎn)量性狀的關(guān)系，研究結(jié)果可為棉花產(chǎn)量的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

300份不同來(lái)源陸地棉種質(zhì)資源材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花種質(zhì)資源庫(kù)提供（表1），其中，國(guó)內(nèi)種質(zhì)274份，國(guó)外種質(zhì)26份。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

300份棉花材料于2022年4月10日種植在新疆庫(kù)車(chē)市烏恰鎮(zhèn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科創(chuàng)中心1號(hào)和2號(hào)試驗(yàn)田，分別用E1、E2表示這2個(gè)環(huán)境；2023年4月9日種植在新疆庫(kù)車(chē)市烏恰鎮(zhèn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科創(chuàng)中心1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)試驗(yàn)田，用E3、E4、E5表示這3個(gè)環(huán)境。2號(hào)試驗(yàn)田是2022年新開(kāi)墾改良的試驗(yàn)田，3號(hào)試驗(yàn)田是2023年新開(kāi)墾改良的試驗(yàn)田，因3塊試驗(yàn)田棉花長(zhǎng)勢(shì)有明顯差異，可以視作不同的環(huán)境。每個(gè)試驗(yàn)田設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，行距配置為（66＋10）cm，株距為10 cm，1膜6行，幅寬2.28 m，小區(qū)行長(zhǎng)4 m。機(jī)械鋪膜打孔，人工膜上點(diǎn)播，膜下滴灌栽培，田間管理措施同常規(guī)大田生產(chǎn)一致。

1.3 表型測(cè)定方法

參照杜雄明等[24]編著的《棉花種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，在吐絮期，每個(gè)材料挑選10個(gè)連續(xù)單株，分別采收每株中部果枝吐絮暢的棉鈴1個(gè)，共采收10個(gè)棉鈴，隨后進(jìn)行室內(nèi)考種，考種項(xiàng)目包括BW和LP。

1.4 表型數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 25和Prism 9進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析；采用軟件R 4.4.0對(duì)不同環(huán)境的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，用lme4包對(duì)各環(huán)境各性狀表型的最佳線(xiàn)性無(wú)偏預(yù)測(cè)（best linear unbiased prediction， BLUP）值進(jìn)行計(jì)算，并計(jì)算廣義遺傳力（H2），公式如下：

H 2＝Vg/（Vg＋＋＋）

式中，Vg、Vge、Vgy、Ve、L、Y分別代表遺傳方差、基因型與環(huán)境間的交互方差、基因型與年份的交互方差、環(huán)境方差、環(huán)境數(shù)和年份數(shù)。

1.5 DNA提取和基因組重測(cè)序

對(duì)每個(gè)棉花種質(zhì)的單株幼葉進(jìn)行取樣，使用康為世紀(jì)的CWE9600 Magbead Blood DNA Kit試劑盒運(yùn)用磁珠法進(jìn)行DNA的提取；并通過(guò)隨機(jī)DNA片段化（300～350 bp）、末端修復(fù)、加PolyA并連接測(cè)序接頭，篩選300～350 bp的DNA片段，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和純化，從而獲得測(cè)序文庫(kù)。隨后使用DNBSEQ-T7測(cè)序儀，采用雙末端（pair-end， PE）150 bp的測(cè)序方法上機(jī)測(cè)序。

1.6 測(cè)序讀長(zhǎng)質(zhì)量過(guò)濾和比對(duì)

使用fastp對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)包括：去除帶接頭的讀長(zhǎng)；去除未知/不確定堿基含量超過(guò)1%的讀長(zhǎng)；去除低質(zhì)量（Q≤5）堿基數(shù)超過(guò)50%的讀長(zhǎng)。使用BWA" 0.7.17（MEM算法）軟件將干凈讀長(zhǎng)比對(duì)到陸地棉TM-1參考基因組（http：//ibi.zju.edu.cn/cotton/source/TM-1_V2.1），使用GATK 4.1.8.0軟件自帶的模塊對(duì)Bam文件進(jìn)行去重，然后基于Bam文件統(tǒng)計(jì)各樣品的測(cè)序深度、基因組覆蓋度等信息。

1.7 群體SNP檢測(cè)

使用軟件GATK 4.1.8.0 callSNP命令調(diào)取SNP，采用VariantFiltration模塊對(duì)SNP進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控過(guò)濾，選擇標(biāo)準(zhǔn)：群體內(nèi)個(gè)體缺失率≤1 %、SNP缺失率≤1 %、次要等位基因頻率（minor allele frequency， MAF）＞0.05，最終保留3 055 642個(gè)高質(zhì)量 SNP用于主成分分析（principal component analysis， PCA）、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、群體結(jié)構(gòu)分析和GWAS分析。

1.8 群體結(jié)構(gòu)和LD分析

為了從全基因組的角度闡明系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用Tassel軟件中的鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用軟件Admixture評(píng)估群體遺傳結(jié)構(gòu)，假設(shè)K取值2～10，每次運(yùn)行迭代10 000次。利用GCTA軟件進(jìn)行PCA分析以評(píng)估群體的遺傳結(jié)構(gòu)。使用軟件PopLDdecay計(jì)算成對(duì)高質(zhì)量SNP之間的LD系數(shù)（r2），結(jié)果用于估計(jì)LD衰減。

1.9 GWAS

利用3 055 642個(gè)高質(zhì)量SNP對(duì)2個(gè)性狀進(jìn)行GWAS分析，利用全基因組高效混合模型關(guān)聯(lián)軟件包GEMMA 0.94.1[25]（http：//www.xzlab.org/

software.html），用以群體結(jié)構(gòu)（Q）矩陣為協(xié)變量的一般線(xiàn)性模型GLM （Q）、以主成分（P）矩陣為協(xié)變量的一般線(xiàn)性模型GLM （P）、以群體結(jié)構(gòu)（Q）和親緣關(guān)系（K）矩陣為協(xié)變量的混合線(xiàn)性模型MLM （Q + K）、以主成分（P）和親緣關(guān)系（K）矩陣為協(xié)變量的混合線(xiàn)性模型MLM （P + K）等4個(gè)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)－lg（1/N）計(jì)算閾值，N為有效SNP數(shù)。本研究中使用“plink--indep--pairwise 50 10 0.1”質(zhì)控后獲得182 147個(gè)有效SNP，經(jīng)計(jì)算閾值為5.26。

1.10 單倍型分析及候選基因的預(yù)測(cè)

GWAS分析后，對(duì)QTL進(jìn)行命名，對(duì)所有環(huán)境及模型下檢測(cè)到的顯著SNP按照其位置進(jìn)行排序，若相鄰2個(gè)SNP的距離大于LD衰減距離454.6 kb，則這2個(gè)SNP屬于不同的QTL，反之則視為是同1個(gè)QTL。對(duì)多環(huán)境重復(fù)檢測(cè)到的穩(wěn)定QTL，選擇每個(gè)QTL中表型變異解釋率（phenotypic variation explained， PVE）最大的SNP做單倍型分析，利用曼-惠特尼檢驗(yàn)對(duì)不同單倍型之間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。將棉花候選基因比對(duì)到擬南芥基因組（www.arabidopsis.org）同源基因并進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

為了評(píng)估關(guān)聯(lián)群體中產(chǎn)量性狀的表型變異，對(duì)LP和BW在2年5個(gè)環(huán)境的表型值及BLUP值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2）。結(jié)果表明，LP變化范圍為18.45%～58.54%；BW變化范圍為2.91～8.78 g。2個(gè)性狀在5個(gè)環(huán)境及BLUP值下均具有較廣泛的變異，LP的平均變異系數(shù)為9.40%，BW的平均變異系數(shù)為11.96%；LP的遺傳力為92.81%，BW的遺傳力為86.67%，表明這2個(gè)性狀主要受遺傳因素影響。LP的偏度為－0.65～

－0.24、峰度為0.10～1.36，BW的偏度為－0.37～

0.14、峰度在－0.22～0.57之間，兩者均呈近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀特征。LP在5個(gè)環(huán)境下的表型值和BLUP值間均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，BW類(lèi)似，但是LP與BW在不同環(huán)境間呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系，有呈正相關(guān)關(guān)系的，如LP_E1與BW_E1、BW_E2；也有呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的，如LP_

E5與BW_E1、BW_E2（圖1）。

2.2 群體結(jié)構(gòu)和LD分析

群體結(jié)構(gòu)分析對(duì)后續(xù)研究不同亞群遺傳信息尤為重要，可以初步推斷亞群分化程度和親緣關(guān)系，反映群體內(nèi)遺傳多樣性。利用Admixture對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，當(dāng)K為6時(shí)，交叉驗(yàn)證誤差最小，從而確定K最佳取值為6（圖2A），即300份陸地棉材料分為6個(gè)亞群（圖2C）。系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2B）和PCA分析（圖2D）也將這些材料劃分為6個(gè)亞群。根據(jù)PopLDdecay計(jì)算r2最大值為0.86，衰減一半時(shí)對(duì)應(yīng)的距離為454.6 kb，即300份陸地棉材料的LD衰減距離為454.6 kb（圖2E），LD衰減距離中等，適合進(jìn)行后續(xù)的GWAS。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用3 055 642個(gè)高質(zhì)量的SNP對(duì)2年5個(gè)環(huán)境的LP、BW表型數(shù)據(jù)及其BLUP值，使用GLM （Q）、MLM （Q＋K）、GLM （P）和MLM （P＋K） 4種模型進(jìn)行GWAS分析。GLM （Q）模型檢測(cè)到8 358個(gè)與LP顯著關(guān)聯(lián)的SNP，MLM （Q＋K）模型檢測(cè)到198個(gè)，GLM（P）模型檢測(cè)到17 355個(gè)，MLM （P＋K）模型檢測(cè)到2 385個(gè)，共檢測(cè)到28 296個(gè)SNP與LP顯著關(guān)聯(lián)（包含不同模型重復(fù)檢測(cè)的SNP）。對(duì)于BW，GLM （Q）模型檢測(cè)到680個(gè)顯著關(guān)聯(lián)SNP，MLM （Q＋K）模型檢測(cè)到34個(gè)，GLM （P）模型檢測(cè)到754個(gè)，MLM （P＋K）模型檢測(cè)到36個(gè)，共檢測(cè)到1 504個(gè)SNP與BW顯著關(guān)聯(lián)。按照454.6 kb的LD衰減距離（圖2E），將與LP顯著關(guān)聯(lián)的SNP整合到223個(gè)QTL中，解釋了6.67%～14.35%的PVE，將與BW顯著關(guān)聯(lián)的1 504個(gè)SNP整合在89個(gè)QTL中，解釋了6.66%～10.24%的PVE。其中，被重復(fù)檢測(cè)的QTL共91個(gè)，88個(gè)與LP關(guān)聯(lián)、3個(gè)與BW關(guān)聯(lián)。圖3展示了這91個(gè)QTL在26條染色體上的分布情況，與LP關(guān)聯(lián)的QTL在除A01外的染色體均有分布，其中A02染色體上數(shù)量最多，為23個(gè)；A12次之，共7個(gè)；A03、A04、A09、A10、A13、D01和D09號(hào)染色體上各有1個(gè)QTL。A07、D06和D11號(hào)染色體上各有1個(gè)與BW關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定QTL。

2.4 候選基因的預(yù)測(cè)

為了篩選與LP和BW相關(guān)的穩(wěn)定QTL，從上述91個(gè)QTL篩選在5個(gè)環(huán)境以及BLUP值中重復(fù)檢測(cè)到3次及以上的穩(wěn)定QTL（表3），獲得3個(gè)與衣分相關(guān)的QTL：qLP_Gh5.18、qLP_Gh12.43、qLP_Gh17.2，2個(gè)與BW相關(guān)的QTL，分別是qBW_Gh7.5和qBW_Gh19.5。

對(duì)A05染色體上qLP-Gh5.18進(jìn)行分析，該QTL在5個(gè)環(huán)境及BLUP值下在4種模型中均被檢測(cè)到（圖4A和表3）。其中，snp497745解釋14.35%的PVE，是qLP_Gh5.18中PVE最高的SNP位點(diǎn)，對(duì)該SNP進(jìn)行后續(xù)分析（后文也是用QTL區(qū)間內(nèi)PVE最高的SNP進(jìn)行分析）。局部曼哈頓圖（圖4B）表明在A05染色體上108.85～109.11 Mb區(qū)間出現(xiàn)明顯峰值，對(duì)此區(qū)間內(nèi)的LD程度進(jìn)一步分析并結(jié)合LD熱圖，將候選區(qū)間縮小為160 kb（圖4D）。在此區(qū)間內(nèi)共注釋了7個(gè)候選基因（表4），結(jié)合擬南芥注釋信息，推測(cè)GH_A05G4223與擬南芥基因AT5G-

05340.1同源，擬南芥AT5G05340.1編碼產(chǎn)物與參與木質(zhì)素生物合成的過(guò)氧化物酶相似，其功能突變?nèi)笔?dǎo)致木質(zhì)部纖維發(fā)育異常以及木質(zhì)素生物合成酶活性降低。GH_A05G4224編碼含有側(cè)器官邊界（lateral organ boundaries，LOB）結(jié)構(gòu)域的蛋白，作為木質(zhì)部細(xì)胞分化主調(diào)控因子VND7的調(diào)控因子，參與木質(zhì)部分化調(diào)控。GH_A05G4226編碼WEB家族蛋白DUF827；GH_A05G4227編碼絨毛曲霉腺嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-次黃嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)體AzgA的同源物；GH_A05G4228在擬南芥中的同源基因編碼Lung七跨膜受體家族蛋白；GH_A05G4229編碼DEAD-box解旋酶家族蛋白；GH_A05G4230編碼1種假定的二羥丙酮磷酸還原酶，參與葉綠體內(nèi)甘油-3-磷酸的供應(yīng)。單倍型分析發(fā)現(xiàn)攜帶AA單倍型的棉花品種的LP極顯著低于攜帶GG單倍型的品種（圖4C）。

對(duì)A12號(hào)染色體上qLP-Gh12.43進(jìn)行分析，該QTL在GLM （P）和GLM （Q）模型下在5個(gè)環(huán)境及BLUP值均被檢測(cè)到（表3和圖5A），snp1691332解釋9.69%的PVE。局部曼哈頓圖表明A12號(hào)染色體上106.57～106.82 Mb區(qū)域有明顯峰值，結(jié)合LD熱圖（圖5B和5D）對(duì)該區(qū)間內(nèi)的LD程度進(jìn)行分析，將候選基因區(qū)域縮小至50 kb，在該候選區(qū)域內(nèi)共注釋了6個(gè)候選基因（表4）。snp1691332在GH_A12G2883內(nèi)，其擬南芥的同源基因編碼四肽重復(fù)樣超家族蛋白；GH_A12G2884編碼ARM重復(fù)超家族蛋白；GH_A12G2885編碼645個(gè)氨基酸的甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白，包含1個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域、2個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域和1個(gè)SRA結(jié)構(gòu)域；GH_A12G2886編碼R2R3轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員；GH_A12G2887編碼五肽重復(fù)蛋白；GH_A12G2888編碼1個(gè)與MAP激酶MAPK9相似的蛋白。單倍型分析發(fā)現(xiàn)攜帶AA單倍型的棉花品種的LP極顯著高于攜帶GG的單倍型品種（圖5C）。

對(duì)qLP-Gh17.2進(jìn)行分析，該QTL位于D04染色體上，在4種模型下均被檢測(cè)到（表3和圖6A），snp2180718解釋10.69%的PVE。局部曼哈頓圖（圖6B）表明在D04號(hào)染色體上3.80～3.96 Mb區(qū)域出現(xiàn)明顯峰值，結(jié)合熱圖（圖6D）進(jìn)一步分析該區(qū)間內(nèi)的LD，將候選區(qū)域縮小至40 kb。在該候選區(qū)域內(nèi)共包含4個(gè)候選基因（表4），GH_D04G0279的擬南芥同源基因編碼1種IAA-氨基合成酶，在體外將天冬氨酸和其他氨基酸結(jié)合到生長(zhǎng)素上；GH_D04G0280編碼五肽重復(fù)超家族蛋白；GH_D04G0281編碼肌動(dòng)蛋白基因家族成員；GH_D04G0282編碼GRIP卷曲蛋白（DUF1664）。單倍型分析發(fā)現(xiàn)攜帶TT單倍型的棉花品種的LP極顯著高于攜帶CC單倍型的品種（圖6C）。

對(duì)與BW相關(guān)的qBW_Gh7.5和qBW_19.5進(jìn)行后續(xù)分析。qBW_Gh7.5位于A07號(hào)染色體上（圖7和表3），與Sun等[20]和Ma等[16]發(fā)現(xiàn)的相關(guān)位點(diǎn)共定位（表5）。該QTL在GLM （P）和GLM （Q）模型中被檢測(cè)到（表3），區(qū)間內(nèi)的snp852852解釋8.89%的PVE，是A07號(hào)染色體中檢測(cè)到的QTL中PVE最大的位點(diǎn)。局部曼哈頓圖（圖7B）表明在A07號(hào)染色體上90. 83～91.18 Mb區(qū)域出現(xiàn)明顯峰值，結(jié)合熱圖（圖7D）對(duì)該區(qū)間內(nèi)的LD程度進(jìn)行分析，將候選區(qū)域縮小至170 kb，在該候選區(qū)域內(nèi)共注釋了5個(gè)候選基因（表4）。其中，GH_A07G2234的擬南芥同源基因編碼RIN4-like/NOI家族成員；GH_A07G2235編碼1種富含半胱氨酸的多肽，該多肽是1種在葉肉細(xì)胞中產(chǎn)生的分泌因子，作用于表皮以促進(jìn)氣孔的形成；GH_A07G2236編碼天冬酰-tRNA合成酶；GH_A07G2237編碼受體樣蛋白激酶相關(guān)家族蛋白；GH_A07G2243編碼AGC（cAMP依賴(lài)性、cGMP依賴(lài)性蛋白激酶C）激酶家族蛋白。單倍型分析發(fā)現(xiàn)攜帶GG單倍型的棉花品種的BW極顯著高于攜帶AA單倍型的品種（圖7C）。

對(duì)D06染色體上qBW-Gh19.5進(jìn)行分析，該QTL在4個(gè)模型下被檢測(cè)到（圖8A和表3），snp2428027解釋7.89%的PVE。局部曼哈頓圖（圖8B）表明在D06號(hào)染色體上64.22～64.56 Mb區(qū)域出現(xiàn)明顯峰值，結(jié)合LD熱圖（圖8D）將候選區(qū)域縮小至14 kb。該候選區(qū)域內(nèi)包含3個(gè)候選基因（表4），GH_D06G2300的擬南芥同源基因編碼GDSL酯酶/?；D(zhuǎn)移酶/脂肪酶；GH_D06G2301編碼花粉中參與脂滴生物形成的膜蛋白；GH_D06G2302編碼1個(gè)水通道蛋白同源物。單倍型分析發(fā)現(xiàn)攜帶GG單倍型的棉花品種的BW顯著高于攜帶AA單倍型的品種（圖8C）。

3 討論

3.1 影響GWAS結(jié)果的因素

GWAS是分析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的有效手段之一[27]，表型數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、SNP標(biāo)記密度、群體結(jié)構(gòu)和GWAS分析方法等都會(huì)對(duì)關(guān)聯(lián)分析最終結(jié)果產(chǎn)生很大影響。棉花的產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，還容易受栽培地氣候、土壤肥力、田間管理、病蟲(chóng)害等的影響。為了減少環(huán)境對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)果的影響，本研究對(duì)2年5個(gè)地點(diǎn)的LP和BW進(jìn)行BLUP值的計(jì)算，以BLUP值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，極大地減少了環(huán)境因素對(duì)遺傳評(píng)估的影響，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[28]。LD分析是GWAS的基礎(chǔ)，受多種因素的影響，如遺傳衰減、自然選擇和種群結(jié)構(gòu)，而群體結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是影響GWAS結(jié)果的重要因素[29]。本研究中將300份陸地棉分為6個(gè)亞群，但可以看到亞群2與其他5個(gè)亞群明顯分開(kāi)（圖2D），這可能是育種工作造成的種內(nèi)漸滲[28]。研究表明所使用的群體存在較多亞群時(shí)，等位基因在基因組上的分布往往不平衡，可能造成標(biāo)記與數(shù)量性狀相關(guān)位點(diǎn)的假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，從而掩蓋了真正的信號(hào)，使關(guān)聯(lián)分析更加復(fù)雜[31]。PCA作協(xié)變量可以更有效地控制群體結(jié)構(gòu)，同時(shí)降低過(guò)度校正的風(fēng)險(xiǎn)。所以本研究不僅使用GLM （Q）和MLM （Q＋K），還使用GLM （P）和MLM （Q＋ K），增加了GWAS結(jié)果的可靠性。

3.2 棉花產(chǎn)量性狀候選基因的預(yù)測(cè)

挖掘更多的棉花產(chǎn)量相關(guān)基因?qū)铀倜藁ǜ弋a(chǎn)育種具有極其重要的作用。前人已定位到許多與棉花產(chǎn)量性狀相關(guān)的基因，如：Gh_D05G1960、Gh_D05G1965、Gh_D03G1064、Gh_D12G2354、Gh_D06G2161、Gh_A08G0716、Gh_A08G0783、Gh_A07G1389、Gh_A02G1473、Gh_A10G1765、Gh_A02G1442、Gh_D05G0313和Gh_D05G1124等都在纖維發(fā)育中起關(guān)鍵作用[19， 21-22， 28， 32]，遺憾的是這些候選基因都未經(jīng)過(guò)基因功能驗(yàn)證，還不能直接用于棉花產(chǎn)量性狀的改良。

本研究在5個(gè)環(huán)境及BLUP下檢測(cè)到223個(gè)QTL與LP相關(guān)，89個(gè)QTL與BW相關(guān)。91個(gè)QTL被重復(fù)檢測(cè)到，88個(gè)與LP關(guān)聯(lián)的QTL中9個(gè)與前人研究中共定位（表5），79個(gè)為新定位到的QTL；3個(gè)與BW關(guān)聯(lián)的QTL中qBW_Gh7.5與Sun等[20]和Ma等[16]的相關(guān)研究結(jié)果共定位（表5），其余2個(gè)為新定位的QTL。

對(duì)在5個(gè)環(huán)境及BLUP下穩(wěn)定檢測(cè)（3次及以上）到的3個(gè)穩(wěn)定的LP相關(guān)QTL進(jìn)行分析，共鑒定到17個(gè)候選基因。在qLP_Gh5.18分析中，共鑒定了7個(gè)候選基因。其中，GH_A05G4228編碼LUNG七跨膜受體家族蛋白，Sun等[20]在對(duì)LP的研究中定位了1個(gè)與GH_A05G4228功能相同的基因，該基因在纖維發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)，推測(cè)GH_A05G4228可能與纖維發(fā)育有關(guān)。GH_A05G4223編碼蛋白的序列與參與木質(zhì)素生物合成的過(guò)氧化物酶相似，功能突變?nèi)笔П憩F(xiàn)為木質(zhì)部纖維發(fā)育異常和木質(zhì)素生物合成酶活性降低，推測(cè)該基因可能與纖維發(fā)育相關(guān)。在qLP_Gh12.43分析中，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)候選基因，GH_A12G2887編碼五肽重復(fù)超家族蛋白。TPR在棉纖維發(fā)育中的作用機(jī)制之一是與肌動(dòng)蛋白形成復(fù)合物控制纖維生長(zhǎng)[27]，Zhu等[19]報(bào)道四肽重復(fù)樣超家族蛋白與短纖維突變體（Ligon-lintless）表型相關(guān)，并且在開(kāi)花前3 d至開(kāi)花后1 d的纖維中高表達(dá)，該基因可能與纖維細(xì)胞突起有關(guān)，進(jìn)而影響LP性狀。GH_A12G2886編碼R2R3轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，R2R3轉(zhuǎn)錄因子家族包括AP2/EREBP家族、MYB家族等，這些轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[34-36]。棉花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子GhMYB25-like和GhMYB3均已被證明調(diào)控纖維的發(fā)育[36-37]。在qLP_Gh17.2分析中，共定位到4個(gè)候選基因，GH_D04G0279編碼1種IAA-氨基合成酶，在體外將天冬氨酸和其他氨基酸結(jié)合到生長(zhǎng)素上，目前還沒(méi)有關(guān)于該基因的任何報(bào)道。但眾所周知，生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，是植物生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，生長(zhǎng)素能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗逆性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，故推測(cè)該基因可能通過(guò)影響棉花生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響LP性狀；GH_D04G0280編碼五肽重復(fù)超家族蛋白，棉花Gh_A03G0489編碼五肽重復(fù)超家族蛋白，該基因中22 bp的缺失突變會(huì)降低纖維細(xì)胞壁厚度[38]，推測(cè)GH_D04G0280可能通過(guò)調(diào)控纖維發(fā)育影響LP。

在qBW-Gh7.5區(qū)間內(nèi)定位到5個(gè)候選基因，其中GH_A07G2243被重點(diǎn)關(guān)注，其編碼AGC激酶家族蛋白，據(jù)報(bào)道其同源基因在植物中發(fā)揮多種功能，包括生長(zhǎng)、免疫、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。在水稻中AGC基因家族主要與光合作用相關(guān)，通過(guò)調(diào)控光合作用進(jìn)而影響水稻產(chǎn)量[41]。擬南芥AGC蛋白激酶AGC1-4通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育進(jìn)而影響種子的大小，AGC1-4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥種子變小，agc1-4突變體的種子明顯大于野生型[42]，因此推測(cè)GH_A07G2243可能影響棉花種子發(fā)育進(jìn)而影響鈴重。在qBW_

Gh19.5分析中發(fā)現(xiàn)3個(gè)候選基因，目前在棉花或其他作物中尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于這些基因或同源基因的報(bào)道。但我們發(fā)現(xiàn)GH_D06G2301編碼主要在花粉中參與脂滴生物形成的膜蛋白，因此推測(cè)該基因可能通過(guò)參與花粉的形成，影響棉花的授粉，進(jìn)而對(duì)棉花的產(chǎn)量具有一定的影響。本研究鑒定的候選基因?qū)Ξa(chǎn)量性狀是否具有調(diào)控作用，還需進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證，才能更有效地指導(dǎo)棉花的育種。

4 結(jié)論

利用5個(gè)環(huán)境下對(duì)300份陸地棉的衣分和鈴重及其BLUP值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定了3個(gè)穩(wěn)定的衣分相關(guān)QTL，在對(duì)應(yīng)區(qū)間內(nèi)挖掘到17個(gè)候選基因；鑒定了2個(gè)鈴重相關(guān)QTL，挖掘到8個(gè)候選基因。

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（責(zé)任編輯：王國(guó)鑫 責(zé)任校對(duì)：王小璐）