關(guān)鍵詞：蟬花；生物學(xué)性狀；馴化；篩選

中圖分類號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

蟬花（Cordyceps chanhua）又名蟲(chóng)花、知了花、蟬草或金蟬花，是我國(guó)名貴的藥食蟲(chóng)草真菌，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。隋唐《藥性論》和明代《本草綱目》詳細(xì)記載了蟬花的主要功效。國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的2020 年第9 號(hào)公告，首次將人工培養(yǎng)的蟬花子實(shí)體列為新食品原料，這是繼廣東蟲(chóng)草和蛹蟲(chóng)草之后的又一個(gè)被正式審批的蟲(chóng)草類新食品原料，極大促進(jìn)了蟬花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。蟬花富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和化學(xué)活性成分，如蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、腺苷、多糖、甘露醇和礦物質(zhì)等；野生蟬花與人工培養(yǎng)子實(shí)體的多種藥理功效相似，且不同培養(yǎng)時(shí)期和不同部位的蟬花代謝產(chǎn)物顯著不同，有望開(kāi)發(fā)成綠色功能食品和治療腫瘤的新資源藥物[3-6]。目前，約20 種蟲(chóng)草屬物種在市場(chǎng)上廣泛流通[7-9]。

前人曾將Isaria cicadae 視作蟬花的學(xué)名，將C. cicadae 作為I. cicadae 的有性型[10]。分子生物學(xué)證據(jù)表明，蟲(chóng)草屬（Cordyceps）和棒束孢屬（Isaria）均為多系起源，此二屬的分類地位和屬下物種多樣性也發(fā)生了較大變化[11-13]。李增智等[14]通過(guò)形態(tài)分類學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究，將采自江西井岡山的有性型蟲(chóng)草標(biāo)本描述為蟲(chóng)草科蟲(chóng)草屬的1 個(gè)新種——蟬花（Cordyceps chanhua Z. Z. Li， F.G. Luan， Hywel-Jones， C. R. Liamp;S.L. Zhang），首次明確了蟬花的分類地位，同時(shí)明確指出“蟬花”可能是一個(gè)復(fù)合群，從而為蟬花的開(kāi)發(fā)利用和蟲(chóng)草物種多樣性研究提供理論基礎(chǔ)[6]。野生蟬花子座橙色至淡橘黃色，具多次分枝；子囊殼埋生，子囊孢子絲狀，光滑透明，（247～360）μm×（1.5～1.8）μm；孢梗束淡黃色至淡黃褐色，分生孢子長(zhǎng)橢圓形，（6.4～13.8）×（2.1～3.1）μm[10]。雖然野生蟬花和人工栽培蟬花在形態(tài)上具有一定差異，但二者的主要營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)和藥效等相似[4， 8]。

蟬花具有巨大開(kāi)發(fā)價(jià)值，但野生蟬花資源短缺，影響野生蟬花菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體形成的重要因素目前還沒(méi)有系統(tǒng)的研究，中國(guó)西南地區(qū)的蟬花資源有待深入挖掘[15-16]。本研究基于形態(tài)解剖學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)，對(duì)采自云南曲靖的一株野生蟲(chóng)草進(jìn)行物種鑒定，通過(guò)組織分離和菌株純化，對(duì)其生物學(xué)特性和栽培馴化條件進(jìn)行初步研究，以期為蟲(chóng)草屬物種多樣性研究、種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為一株野生蟲(chóng)草（采集號(hào)：hlh1945），采自云南曲靖翠峰山（24°59?N，103°96?E，海拔約2000 m）。基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)自北京百邁客生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與物種鑒定 （1）菌株分離。利用組織分離法，從野外采集的新鮮蟲(chóng)體中挑取少量菌絲在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上獲得菌株，菌株保存于曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心。蟲(chóng)體利用硅膠干燥，制作成分子材料，用于DNA 提取和標(biāo)本觀察。

（2）培養(yǎng)基制備?；A(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg，定容至1000 mL，自然pH。液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg，定容至1000 mL，自然pH。培養(yǎng)基于高溫蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌20 min。

（3）標(biāo)本和菌株形態(tài)觀察。觀察野生蟲(chóng)草子實(shí)體的形狀、大小和顏色等特征，根據(jù)子實(shí)體和菌絲體的菌絲、產(chǎn)孢組織和孢子等顯微特征，進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 分別提取野外采集的子實(shí)體、分離菌株和人工栽培獲得的子實(shí)體的總DNA?；谕ㄓ靡颕TS1f（5?-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3?）和ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）分別擴(kuò)增以上3 種材料的ITS片段。擴(kuò)增步驟：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸7 min，將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用RAxMLv.7.2.6 軟件，基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，步長(zhǎng)值設(shè)置為1000。

1.2.3 菌絲體生物學(xué)特性研究 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種菌株，使菌株活化，為菌絲體生物學(xué)特性研究提供材料。

（1）碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以不加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將碳源分別設(shè)定為蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖和甘油，濃度均為20 g/L，pH 為6。將直徑約5 mm 菌絲塊接種至直徑為6 cm 的平板上，24 ℃避光培養(yǎng)10 d，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。菌絲萌發(fā)后，每天觀察、測(cè)量并記錄菌絲生長(zhǎng)情況，從第2 天起采用十字交叉法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度，并觀察記錄菌落形態(tài)。

（2）氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以不加蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將氮源分別設(shè)定為酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨和尿素，濃度均為2 g/L，pH 為6。

（3）無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以不加磷酸二氫鉀和硫酸鎂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將無(wú)機(jī)鹽分別設(shè)定為硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鐵、硫酸鋅和硫酸銅，濃度均為2 g/L，pH為6。

（4）不同pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基設(shè)置7 個(gè)pH 梯度（4、5、6、7、8、9、10），進(jìn)行菌絲培養(yǎng)。

（5）不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將培養(yǎng)溫度設(shè)置7 個(gè)梯度（15、18、21、24、27、30、33 ℃），進(jìn)行菌絲培養(yǎng)。

1.2.4 菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn) 在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)影響蟬花菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基條件進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。利用三因素三水平基于最適pH 和溫度，以碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽為影響因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)定6 個(gè)重復(fù)，確定并優(yōu)化蟬花菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

1.2.5 人工栽培試驗(yàn) 液體菌種制備：將直徑約5 mm 的菌塊接種至裝有100 mL 液體優(yōu)化培養(yǎng)基的三角瓶中，150 r/min、24 ℃避光振蕩培養(yǎng)6 d，備用。在高9.0 cm、寬6.5 cm 的組培瓶中裝入40 g小麥和大米以1∶1 混合的培養(yǎng)基，水60 mL，透氣膜封口，121 ℃滅菌20 min，反復(fù)滅菌3 次，冷卻后接種5 mL 稀釋5 倍的液體菌種，重復(fù)10瓶，置于24 ℃培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)后采收子實(shí)體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，在單因素和正交試驗(yàn)方差分析中，Plt;0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種鑒定

通過(guò)觀察野外采集的新鮮蟲(chóng)草標(biāo)本，獲得相關(guān)外部形態(tài)特征和內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。從蟬若蟲(chóng)頭部和胸部各長(zhǎng)出若干個(gè)淡黃色至橙色具多分枝的子座和孢梗束，分枝柄部橙黃色或黃白色，（8.0～28.0）mm×（1.5～3.0）mm；末端淡黃白色，形成多個(gè)西藍(lán)花狀或雞冠狀產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，布滿污白色粉末狀分生孢子；分生孢子長(zhǎng)橢圓形，連接成長(zhǎng)鏈狀，（4.0～8.5）μm×（1.5～3.5）μm（圖1）?；谝陨闲螒B(tài)特征，將其初步鑒定為蟬花（C. chanhua）。

野外采集的蟬花子實(shí)體、分離菌株和人工栽培獲得的子實(shí)體與蟬花模式標(biāo)本（JGS150713）的ITS 片段在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚成一個(gè)獨(dú)立的分化支系，并獲得100%支持率，結(jié)果表明此支系樣本代表蟬花（C. chanhua）（圖2）。

2.2 單因素試驗(yàn)

蟬花菌絲在不同碳源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度和菌絲活力存在一定差異（表2，圖3）。菌絲在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白且呈絨毛狀；其次是麥芽糖和無(wú)碳源對(duì)照組（CK1）培養(yǎng)基；在甘油培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，長(zhǎng)勢(shì)最差。CK1菌絲雖能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度不穩(wěn)定，菌絲形態(tài)不規(guī)則，說(shuō)明碳源是蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，其對(duì)碳源的種類具有廣泛適應(yīng)性。不同碳源培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)不同，以果糖為碳源的菌絲最為濃密潔白。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)30 d，CK1 和葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲會(huì)分泌深黃色色素，菌絲可能易老化（圖3）。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，可確定最佳碳源為蔗糖。

不同氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)有明顯影響，菌絲在酵母粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白呈毛絮狀，其次為蛋白胨、硝酸鉀、CK2、氯化銨和硫酸銨；以尿素為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最慢且長(zhǎng)勢(shì)最差。以氯化銨和硫酸銨為氮源的菌絲最濃密。和碳源類似，菌絲對(duì)氮源的種類也具有廣泛適應(yīng)性。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，可確定最佳氮源為酵母粉（表2，圖3）。

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較小，菌絲在以硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，且差異不顯著；在硫酸鐵、硫酸鋅和硫酸銅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，且差異不顯著；但前、后2 組無(wú)機(jī)鹽下的菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，確定最適無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂（表2，圖3）。

不同pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響顯著，當(dāng)5菌絲生長(zhǎng)的溫度適應(yīng)范圍較廣，15～33 ℃均能生長(zhǎng)，但不同溫度條件下的菌絲生長(zhǎng)速度存在顯著差異。在設(shè)定的6 個(gè)溫度梯度中，溫度低于24 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度隨溫度增高而逐漸加快，菌絲較為稠密；溫度高于24 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)逐漸受抑制，生長(zhǎng)速度變慢；溫度達(dá)到33 ℃時(shí)，菌絲不再生長(zhǎng)。24 ℃條件下，菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)快，呈毛氈狀，將其確定為最適溫度（表2，圖3）。

2.3 菌絲生長(zhǎng)正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)表明，菌絲生長(zhǎng)的最適pH 為6，最適溫度為24 ℃，在此條件下，對(duì)3 個(gè)因素碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽各設(shè)置3 個(gè)成分水平，進(jìn)行三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)（表3，圖4）。碳源的極差最大，R 為1.21，說(shuō)明碳源是影響蟬花菌絲生長(zhǎng)的重要因素，其次為氮源和無(wú)機(jī)鹽。從均值T可知，菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為蔗糖、酵母粉和硫酸鎂。方差分析表明，碳源的F 值最大，3 種因素的顯著性差異依次為碳源gt;氮源gt;無(wú)機(jī)鹽，這與正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析一致（表3，表4）。在蔗糖-酵母粉-硫酸鎂組合下，蟬花菌絲生長(zhǎng)速度快、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、不易老化（圖4）。

2.4 人工栽培

蟬花在小麥和大米以1∶1 混合的培養(yǎng)基上可正常生長(zhǎng)，子實(shí)體采收周期約為40～45 d，每個(gè)栽培瓶收獲蟬花干重平均約9.56 g。人工栽培收獲蟬花子實(shí)體與野生子實(shí)體在外部形態(tài)特征上明顯不同，子實(shí)體呈淡土黃色至淡黃色，較柔韌，扁平彎曲狀、分枝較少，高1.5～5.0 cm，寬0.3～0.8 cm，厚0.1～0.2 cm；孢梗束外密布污白色絮狀或粉末狀分生孢子；但二者顯微結(jié)構(gòu)類似，分生孢子呈長(zhǎng)橢圓形，連接成長(zhǎng)鏈狀，（3.5～8.5）×（1.5～3.0）μm（圖1，圖5）。

3 討論

野生菌種質(zhì)資源收集和遺傳多樣性研究是我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)性工作，野生食藥用菌株的分離、鑒定和馴化不僅為真菌資源開(kāi)發(fā)和利用提供了原材料，還有利于保護(hù)真菌物種多樣性[17-18]。云南地形地貌復(fù)雜，兼具熱帶、亞熱帶和溫帶植被類型，孕育了極其豐富的真菌資源，但還有大量野生食用菌物種深藏于山間林下而鮮為人知，亟需加大研發(fā)力度，充分發(fā)揮和持續(xù)利用云南豐富的野生食用菌資源，為地方經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展服務(wù)[19]。蟬花是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥食兩用真菌，已有1500 多年的利用歷史。蟬花基因組約為36.9 Mb，基因編碼蛋白數(shù)量高于其他蟲(chóng)草真菌，線粒體基因組長(zhǎng)度也呈現(xiàn)出多態(tài)性，表明其具有豐富的遺傳基因[20-21]。蟬花不同種群內(nèi)個(gè)體在形態(tài)特征、生理特性和分子序列等方面具有豐富的遺傳變異性[22-23]。其不同種群的遺傳譜系隨機(jī)分布，與地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性，而形態(tài)性狀具有一定地理相關(guān)性[23-25]，溫度和濕度是影響蟬花分布的主要因素[26]。

本研究從滇東北海拔約2000 m 的云南松林下獲得一株野生蟲(chóng)草，該物種野生子實(shí)體、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)菌絲及人工栽培子實(shí)體的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)與模式標(biāo)本相似，其ITS 片段與蟬花模式標(biāo)本以高支持率聚在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育支，利用形態(tài)解剖和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，將其準(zhǔn)確鑒定為蟬花。由于天然野生蟬花資源極度缺乏，不少研究逐漸關(guān)注蟬花菌絲體的液體發(fā)酵，其培養(yǎng)周期短、發(fā)酵條件可控、易規(guī)模化生產(chǎn)，因此成為獲取蟬花原材料的主要渠道。本文研究表明，蟬花菌絲最適生長(zhǎng)溫度為24 ℃，最適pH 為6，最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為蔗糖、酵母粉和硫酸鎂，碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最大，其次為氮源，無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較小。前人研究表明，碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)均有顯著影響，培養(yǎng)溫度范圍為25～28 ℃，最適pH范圍為6～7[27-29]，與本文研究基本一致，表明蟬花不同菌株的培養(yǎng)條件較為穩(wěn)定。

蟬花具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，因此針對(duì)蟬花的人工栽培開(kāi)展了大量研究。譚悠久等[2]通過(guò)蟬花野外菌株繁育，初步建立了蟬花菌株的子實(shí)體篩選和分子鑒定體系，有效提高了子實(shí)體產(chǎn)量。本研究以小麥和大米為培養(yǎng)基，在24 ℃下培養(yǎng)40～45d后，可獲得長(zhǎng)勢(shì)整齊的子實(shí)體，人工培養(yǎng)獲得的子實(shí)體形態(tài)與野生蟬花具有一定差異，顏色較淺、分枝較少、子座和孢梗束呈扁平狀，分生孢子粉呈污白色，分生孢子形狀和大小與野生蟬花一致。陳祝安等[30]首次通過(guò)固體培養(yǎng)，初步實(shí)現(xiàn)蟬花的人工栽培，觀察到類似寄主體上的孢梗束；孢梗束生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)量對(duì)碳源濃度較敏感，而氮源對(duì)其影響不大。蟬花在以無(wú)機(jī)鹽為主要營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生孢梗束，以大米為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的蟬花孢梗束生長(zhǎng)最快，適合進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，添加蟬蛹粉可顯著提高子實(shí)體產(chǎn)量，蟬花氨基酸、粗多糖和蛋白質(zhì)含量均高于野生蟬花相應(yīng)物質(zhì)含量[31-32]。有研究推測(cè)特定微生物群落和土壤理化性質(zhì)可能在蟬花的子實(shí)體發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[33]。

今后，擬通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和野外繁育，優(yōu)化菌絲培養(yǎng)基配方的最適濃度，篩選人工栽培技術(shù)參數(shù)，并從分子生物學(xué)角度對(duì)菌株進(jìn)行優(yōu)化[34]，以期改善蟬花子實(shí)體品質(zhì)，提升其活性物質(zhì)含量，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)菌株資源，為蟬花的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論、資源和技術(shù)支持。