［摘要］ 目的

探究銀杏內酯B對脂肪肝小鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響及其機制。

方法 選擇60%高脂飼料喂養(yǎng)16周的C57BL/6J雄性小鼠共25只，分為假手術組（開腹后縫合）、模型組（阻斷肝中、左葉血流1 h后再灌注6 h）、銀杏內酯B組（25 mg/kg銀杏內酯B腹腔注射2次后同模型組處理）、GW9662組（1 mg/kg GW9662腹腔注射2次后同模型組處理）、GW9662＋銀杏內酯B組（25 mg/kg銀杏內酯B＋1 mg/kg GW9662混合溶液腹腔注射2次后同模型組處理）。給藥并行手術后6 h檢測各組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平，免疫印跡法檢測各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平，油紅O染色檢測各組小鼠肝臟組織脂肪化程度，HE染色檢測各組小鼠肝臟組織壞死程度。

結果 油紅O染色結果顯示，各組小鼠肝臟脂肪化程度已達脂肪肝水平。血清酶學檢測結果顯示，銀杏內酯B組、GW9662＋銀杏內酯B組小鼠血清ALT、AST水平均顯著低于模型組（P＜0.05），銀杏內酯B組小鼠血清ALT水平顯著低于GW9662＋銀杏內酯B組（P＜0.05）。HE染色結果顯示，銀杏內酯B組小鼠肝組織壞死面積百分比顯著低于模型組及GW9662＋銀杏內酯B組（P＜0.05）。免疫印跡結果顯示，銀杏內酯B組小鼠肝組織Bax表達水平顯著低于模型組（P＜0.05），而Bcl-2、PPARγ表達水平顯著高于模型組及GW9662＋銀杏內酯B組（P＜0.05）。

結論 銀杏內酯B可通過上調肝組織PPARγ水平以減輕脂肪肝小鼠缺血再灌注損傷。

［關鍵詞］ 再灌注損傷；脂肪肝；銀杏內酯類；PPARγ；疾病模型，動物

［中圖分類號］ R619.9；R575.5

［文獻標志碼］ A

Effect of ginkgolide B on hepatic ischemia-reperfusion injury in mice with fatty liver disease and its mechanism

HUANG Xijian， ZHAO Jinxin， LUO Lijian， LIU Huan， CAI Jinzhen

（Organ Transplantation Center， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266035， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the effect of ginkgolide B on hepatic ischemia-reperfusion injury in mice with fatty liver disease and its mechanism.

Methods A total of 25 male C57BL/6J mice were fed with 60% high-fat diet for 16 weeks， and then they were divided into sham-operation group （laparotomy and suture）， model group （occlusion of blood flow in the middle and left lobes of the liver for 1 h， followed by reperfusion for 6 h）， ginkgolide B group （intraperitoneal injection of 25 mg/kg ginkgolide B twice， followed by the treatment in the model group）， GW9662 group （intraperitoneal injection of 1 mg/kg GW9662 twice， followed by the treatment in the model group）， and GW9662+ginkgolide B group （intraperitoneal injection of 25 mg/kg ginkgolide B+1 mg/kg GW9662 twice， followed by the treatment in the model group）. At 6 h after administration and surgery， the serum levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were measured for each group; Western blotting was used to measure the protein expression levels of Bax， Bcl-2， and PPARγ in liver tissue; oil red O staining was used to measure the degree of fatty changes in the liver， and HE staining was used to measure the degree of necrosis in liver tissue.

Results Oil red O staining showed that the degree of fatty changes in the liver had reached the level of fatty liver disease in each group. The se-

rum enzymatic analysis showed that the ginkgolide B group and the GW9662+ginkgolide B group had significantly lower serum le-

vels of ALT and AST than the model group （Plt;0.05）， and the ginkgolide B group had a significantly lower serum level of ALT than the GW9662+ginkgolide B group （Plt;0.05）. HE staining showed that the ginkgolide B group had a significantly lower percentage of necrotic area in liver tissue than the model group and the GW9662+ginkgolide B group （Plt;0.05）. Western blotting showed that the ginkgolide B group had a significantly lower expression level of Bax in liver tissue than the model group （Plt;0.05）， as well as significantly higher expression levels of Bcl-2 and PPARγ than the model group and the GW9662+ginkgolide B group （Plt;0.05）.

Conclusion Ginkgolide B can alleviate ischemia-reperfusion injury in mice with fatty liver disease by upregulating PPARγ in liver tissue.

［KEY WORDS］ Reperfusion injury; Fatty liver; Bilobalides; PPAR gamma; Disease models， animal

銀杏內酯B是從銀杏葉及其根皮中分離出的特異性血小板活化因子強效選擇拮抗劑［1］。研究表明銀杏內酯B具有抗炎、抗過敏、抗氧化及神經(jīng)保護等多種作用［2］。近年來銀杏內酯B被廣泛應用于各類炎癥反應或器官缺血再灌注（I/R）損傷改善的研究中［3-5］。終末期肝臟疾病嚴重影響患者的生存質量，現(xiàn)代醫(yī)學對于終末期肝病最有效的治療手段即為肝臟移植［6］。然而，肝臟移植勢必會導致肝臟組織I/R損傷的發(fā)生，其發(fā)生機制復雜且極大影響患者的預后［7-8］，加之近年來供肝臟移植中供體肝臟出現(xiàn)脂肪肝的概率逐漸增高，因此探究新的脂肪肝I/R損傷治療靶點尤為重要。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）具有調控炎癥及脂質平衡等多種功能，其一般分為PPARα、PPARβ、PPARγ三種類型，分別由不同基因編碼［9-10］。肝臟組織中PPARs主要表型為PPARα，其主要調節(jié)肝細胞脂質代謝。有研究表明僅通過調控PPARα無法有效改善肝細胞脂肪浸潤，但是聯(lián)合調控PPARα以及PPARγ則能夠有效地改善肝細胞的脂肪浸潤［11］。GW9662為PPARγ的特異性抑制劑，有研究表明GW9662可以通過抑制PPARγ表達加劇肝臟損傷［12］。目前對于銀杏內酯B能否減輕脂肪肝的I/R損傷尚未有研究涉及。本研究通過建立小鼠非酒精性脂肪肝I/R損傷模型，探究銀杏內酯B對脂肪肝I/R損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與器械

雄性5周齡SPF級C57BL/6J小鼠（體質量為18～20 g）購自北京斯貝福生物技術有限公司，蛋白免疫印跡實驗用電泳儀、轉膜槽以及電泳槽購自美國Bio-Rad公司，PVDF膜購自德國Milipore公司，兔源性β-actin抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔源性Bax抗體、兔源性Bcl-2抗體購自浙江華安生物技術有限公司，兔源性PPARγ抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，60%高脂飼料購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，銀杏內酯B、GW9662購自美國Glpbio公司，RIPA細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，顯影液購自江蘇新賽美生物科技有限公司。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)、分組及處理

將小鼠飼養(yǎng)在青島大學醫(yī)學部動物實驗中心的SPF級鼠房，飼養(yǎng)環(huán)境為20～24 ℃，12/12 h晝夜節(jié)律，空氣濕度約為50%，自由進食與飲水。使用60%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠16周后，選擇體質量≥37 g的小鼠共25只。將小鼠隨機分組，假手術組以1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后沿小鼠腹正中線切開后縫合關腹，不做其他處理；模型組以1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后沿小鼠腹正中線切開后輕柔分離肝臟組織，使用顯微血管夾阻斷肝左葉、肝中葉血流，期間需保持小鼠腹部濕潤與小鼠體溫，1 h后取下血管夾，輕柔關腹后將小鼠置于溫暖環(huán)境；銀杏內酯B組腹腔注射25 mg/kg銀杏內酯B，共2次，中間間隔12 h，隨后同模型組處理；GW9662組腹腔注射 1 mg/kg GW9662，共2次，中間間隔12 h，隨后同模型組處理；GW9662＋銀杏內酯B組腹腔注射25 mg/kg銀杏內酯B＋1 mg/kg GW9662混合溶液，共2次，中間間隔12 h，隨后同模型組處理，每組均5只小鼠。

1.3 各組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平檢測

手術后6 h再次麻醉各組小鼠，每只采集眼球血1.5 mL于EP管中，室溫靜置2 h后，4 ℃過夜，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液檢測小鼠血清中ALT、AST水平。結果取3次重復實驗的平均值。

1.4 油紅O及HE染色檢測各組小鼠肝組織損傷情況

脫頸處死各小組小鼠，分離肝臟左葉及中葉，將肝左葉保存至4%甲醛溶液中備用，肝中葉分離成4～5小塊置于2 mL凍存管中，于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ〗萦?%甲醛溶液的各組小鼠肝左葉組織，固定脫水、透明、浸蠟包埋、切片并烘干后，按照油紅O及HE染色試劑盒說明書要求的步驟進行染色，封片后在正置顯微鏡下拍照。使用Image J軟件測量并計算HE染色切片中各組小鼠肝組織壞死面積百分比，壞死面積百分比=切片中肝組織壞死面積/切片總面積×100%，結果取3次重復實驗的均值。

1.5 免疫印跡法檢測各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平

取小鼠肝中葉組織分離為綠豆大小組織塊，使用RIPA細胞裂解液、組織研磨儀及超聲細胞粉碎機裂解1 h。裂解結束后4 ℃下25 420 r/min離心30 min，取上清液。使用BCA法進行蛋白定量分析，按照1∶4比例加入Loading Buffer，100 ℃恒溫煮蛋白5～10 min，冷卻后4 ℃下25 420 r/min離心2～3 min。將處理完的蛋白進行電泳分離，使用SDS-PAGE分離膠配制電泳用膠體，PVDF膜轉膜。使用1×TBST緩沖液配制含0.05 g/L脫脂奶粉的封閉液，在水平搖床上室溫封閉1 h（80次/min）。封閉結束以后使用1×TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，分別使用Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶2 000）、PPARγ（1∶1 000）以及β-actin（1∶10 000）抗體4 ℃下水平搖床上孵育過夜。使用1×TBST緩沖液在室溫下水平搖床放置10 min（80次/min），使用1×TBST緩沖液洗膜5次。使用HRP偶聯(lián)抗體（1∶5 000）孵育二抗，并在室溫下水平搖床孵育1 h（80次/min），再次使用1×TBST緩沖液洗膜5次。將條帶置于TANON顯影儀進行顯影后分析各蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達量以各蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值計算。結果取3次重復實驗的平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad 8.02軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用x-±s表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用Dunnett t法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結" 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較

血清學檢測結果顯示，假手術組、模型組、銀杏內酯B組、GW9662組和GW9662＋銀杏內酯B組小鼠血清中ALT水平分別為（33.5±9.7）、（2 633.7±966.2）、（685.3±54.3）、（1 825.2±72.1）、（1 241.8±103.1）U/L；血清AST水平分別為（115.5±16.6）、（2 441.2±555.1）、（1 038.5±101.4）、（2 454.6±296.6）、（1 580.3±524.1）U/L。各組小鼠血清中ALT、AST水平差異顯著（F=21.19、48.88，P＜0.05），銀杏內酯B組、GW9662＋銀杏內酯B組小鼠血清ALT、AST水平均顯著低于模型組（P＜0.05），銀杏內酯B組小鼠血清ALT水平顯著低于GW9662＋銀杏內酯B組（P＜0.05），AST水平與GW9662＋銀杏內酯B組無明顯差異（P＞0.05）。

2.2 各組小鼠肝組織損傷情況比較

油紅O染色結果顯示，各組小鼠脂滴均呈現(xiàn)橘紅色氣泡狀，分布均勻且廣泛。HE染色結果顯示，假手術組小鼠肝組織無明顯異常，其他四組小鼠肝組織均可見均質紅染區(qū)域，提示肝臟組織中出現(xiàn)壞死。假手術組、模型組、銀杏內酯B組、GW9662組和GW9662＋銀杏內酯B組小鼠肝組織壞死面積百分比分別為（0.20±0.01）%、（74.66±20.22）%、（34.67±4.23）%、（70.67±17.56）%以及（68.33±13.57）%。各組小鼠肝組織壞死面積百分比差異顯著（F=202.80，P＜0.05），其中銀杏內酯B組小鼠肝組織壞死面積百分比低于模型組及GW9662＋銀杏內酯B組（P＜0.05），GW9662＋銀杏內酯B組小鼠肝組織壞死面積百分比與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

2.3 各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平比較

免疫印跡實驗結果顯示，各組小鼠肝組織Bax、Bcl-2、PPARγ表達水平均有顯著差異（F=6.67～9.81，P＜0.05）；其中銀杏內酯B組小鼠肝組織Bax水平顯著低于模型組（P＜0.05），Bcl-2、PPARγ水平顯著高于模型組以及GW9662＋銀杏內酯B組小鼠（P＜0.05）。見圖2、表1。

3 討" 論

近十年來，我國終末期肝病的患病率越來越高，目前對于終末期肝病最有效的治療手段為肝臟移植［13-14］。肝移植手術患者無法避免肝組織I/R損傷發(fā)生，而I/R損傷嚴重影響患者預后［15-17］。肝功能檢測是檢測患者移植肝臟狀態(tài)的重要指標，而動物實驗中則可通過計算動物模型肝臟組織切片壞死面積比例及檢測肝組織凋亡相關蛋白等表達水平變化評估肝臟損傷程度。銀杏內酯B是從銀杏葉或根莖中提取出的一種具有特異血小板活化因子的強效選擇性拮抗劑［1，18］。多項研究表明，銀杏內酯B具有抗炎、抗過敏、抗氧化以及神經(jīng)保護等系列作用［2，19］。另外銀杏內酯B能夠減輕缺血性心臟病及缺血性腦病損傷，并能減輕脂肪性肝病肝細胞中脂肪浸潤程度［20-21］。PPARs為過氧化物酶體增殖物激活受體，在體內具有調控脂質代謝、葡萄糖代謝、細胞分化等功能，PPARγ屬于PPARs的分型之一［22-23］。既往研究表明，銀杏內酯B能夠通過調控PPARγ來緩解缺血性心肌病進展［20］。也有研究表明，銀杏內酯B可通過激活PPARγ上調TGF-β表達，從而緩解缺血性腦損傷［5］。GW9662為PPARγ的特效抑制劑，有研究表明GW9662可以通過抑制PPARγ表達加劇膿毒癥所致肝損傷［12］。

本研究中，根據(jù)油紅O染色以及HE染色結果，我們成功建立了脂肪肝小鼠肝臟I/R損傷模型。血清酶學中ALT、AST水平能一定程度代表肝臟受損程度，本研究中銀杏內酯B組、GW9662＋銀杏內酯B組小鼠血清ALT、AST表達水平均顯著低于模型組，銀杏內酯B組小鼠血清ALT表達水平顯著低于GW9662＋銀杏內酯B組，且銀杏內

酯B組小鼠肝組織壞死面積百分比顯著低于模型

組和GW9662＋銀杏內酯B組。證明銀杏內酯B能夠通過上調脂肪肝小鼠肝組織PPARγ表達減輕肝組織I/R損傷。有研究表明，小鼠肝組織PPARγ表達上調可抑制促炎性Kupffer細胞表達，進而抑制IL-10、TNF-α等促炎因子的表達與釋放，從而緩解肝臟I/R損傷［24］，但本研究中銀杏內酯B上調PPARγ表達緩解肝臟I/R損傷的具體機制尚需進一步實驗驗證。在肝臟I/R損傷模型中，受損肝組織中肝細胞存在凋亡、焦亡、鐵死亡等多種死亡方式，本研究以細胞凋亡標志蛋白Bax（促凋亡蛋白）及Bcl-2（抗凋亡蛋白）為指標評估小鼠肝臟I/R損傷的嚴重程度。免疫印跡實驗結果顯示，銀杏內酯B組小鼠肝組織Bax表達水平顯著低于模型組，但與GW9662＋銀杏內酯B組差異不明顯，銀杏內酯B組小鼠肝組織Bcl-2、PPARγ表達水平則顯著高于模型組和GW9662＋銀杏內酯B組。表明銀杏內酯B可能通過上調脂肪肝小鼠肝組織PPARγ表達抑制了肝細胞凋亡，從而減輕了肝臟I/R損傷。銀杏內酯B組與GW9662＋銀杏內酯B組小鼠肝組織Bax水平差異不顯著的原因，推測為GW9662＋銀杏內酯B組混合溶液給藥方式影響了GW9662對PPARγ的抑制作用，后續(xù)我們會針對此問題進一步研究以增加結果的可信度。

本研究中存在一定不足之處，首先本研究未涉及PPARγ對于脂肪肝小鼠肝組織I/R損傷影響的體外驗證，以及其相關下游通路和具體機制的驗證；另外，銀杏內酯B是否可以減輕脂肪肝小鼠肝組織脂肪浸潤本研究也未進行驗證。

綜上所述，銀杏內酯B可以通過上調PPARγ的表達，以減輕脂肪肝小鼠肝組織I/R損傷。該結論可能為臨床脂肪供肝肝臟移植術后患者的恢復治療提供一個治療新靶點。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學實驗動物福利倫理委員會的審核批準（文件號20220630C-

572520221130011）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的要求進行。

作者聲明：黃希健、趙金鑫、劉歡參與了研究設計；黃希健、羅禮鍵、蔡金貞參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）