【摘 要】目的：觀察白藜蘆醇對(duì)多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及線粒體的形態(tài)和功能的改變，并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。方法：32只雌性SD大鼠幼鼠隨機(jī)分為2組，PCOS模型組（n=24）和模型對(duì)照組（n=8）。成功提取PCOS組顆粒細(xì)胞并體外培養(yǎng)，然后用不同濃度的白藜蘆醇處理顆粒細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化；Mito Tracker Deep Red染色觀察細(xì)胞線粒體的形態(tài)變化；JC-1檢測(cè)線粒體膜電位的變化；ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ATP的變化；分光光度計(jì)檢測(cè)與凋亡密切相關(guān)casppase-3和caspase-9酶活性變化；最后，蛋白免疫印跡法檢測(cè)顆粒細(xì)胞內(nèi)cas?pase-3和caspase-9蛋白水平的變化。結(jié)果：白藜蘆醇處理PCOS模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞后，顆粒細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)（P=0.000）；Mito Tracker Deep Read染色結(jié)果顯示線粒體質(zhì)量明顯增加，形狀呈管狀或長(zhǎng)條狀；顆粒細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量和線粒體膜電位也明顯增加（P=0.000、P=0.000）。另外，白藜蘆醇也降低了caspase-3和caspase-9酶活性和蛋白水平的表達(dá)（P=0.000、P=0.000）。結(jié)論：白藜蘆醇抑制了PCOS模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，也促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與白藜蘆醇改善顆粒細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇；顆粒細(xì)胞；線粒體；凋亡

【中圖分類號(hào)】R737.31 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-06-29

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一，影響著該人群中大約10%～15%的婦女[1]。PCOS具有明顯的2個(gè)特征：雄激素過(guò)量和排卵功能障礙；而臨床上則表現(xiàn)為高雄激素血癥、月經(jīng)不調(diào)等[2]。在形態(tài)學(xué)上，PCOS多表現(xiàn)為卵巢呈多囊，也可見(jiàn)幼稚卵泡、多發(fā)性的囊泡囊腫等[3]。大多數(shù)PCOS患者多伴有肥胖和胰島素抵抗，同時(shí)還增加了其他多種共病的風(fēng)險(xiǎn)，如2型糖尿病[4]、心血管疾病[5]和晚期子宮內(nèi)膜癌[6]等。PCOS發(fā)病機(jī)制尚不清楚，遺傳和表觀遺傳因素，各種環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素，如不健康的飲食和不良的生活習(xí)慣，這些都可能導(dǎo)致PCOS[7]。

線粒體是非常重要的雙層膜、動(dòng)態(tài)的、半自主性細(xì)胞器，由外膜、膜間隙和內(nèi)膜組成。線粒體通過(guò)融合和分裂兩種方式維持其結(jié)構(gòu)完整性，以發(fā)揮其生物學(xué)功能。線粒體是體內(nèi)的“能量工廠”，可通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，以提供生命活動(dòng)所需能量；線粒體還參與體內(nèi)的細(xì)胞增殖凋亡、自噬、氧化應(yīng)激等多種生理活動(dòng)。因此，線粒體正常的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)維持機(jī)體的多種生命活動(dòng)至關(guān)重要[8]。大量證據(jù)表明，線粒體功能障礙與PCOS的病理生理過(guò)程有著重要的密切的聯(lián)系，如線粒體基因組異常、能量失衡、氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、動(dòng)力學(xué)異常、生物合成減少等[9-10]。因此，改善線粒體功能障礙將會(huì)對(duì)未來(lái)治療PCOS有重要意義。

天然多酚類化合物白藜蘆醇（3，4，5-三羥基-反式二苯乙烯，resveratrol，Res）作為一種減少肥胖和相關(guān)代謝障礙的治療策略，引起了人們的極大興趣。白藜蘆醇主要存在于膳食植物中，包括虎杖、花生和葡萄皮的根等。Res具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤和增加胰島素敏感性等[11-12]。臨床和動(dòng)物研究表明，白藜蘆醇可以改善代謝功能障礙引起的月經(jīng)異常、痤瘡、脫發(fā)以及PCOS 中的高雄激素血癥[13]；此外，Res對(duì)卵泡發(fā)育也有積極影響，如閉鎖卵泡數(shù)量減少，卵巢卵泡儲(chǔ)備增加，卵巢壽命延長(zhǎng)[14-15]。然而，Res對(duì)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能有何影響卻鮮有報(bào)道。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建PCOS大鼠模型，分離得到卵巢顆粒細(xì)胞，并給予Res處理，觀察Res對(duì)顆粒細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能的影響，并探討其發(fā)揮作用的機(jī)制，為治療PCOS提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 20日齡雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量約50 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK（渝）2016-0001。所有大鼠均置于SPF級(jí)代養(yǎng)室飼養(yǎng)，每籠4只，溫度保持為（24±1） ℃，12 h光照晝夜循環(huán)，給予常規(guī)鼠糧和水，術(shù)前12 h禁食。

1.1.2 主要試劑 高糖F-12培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、二甲基亞砜、SDS-PAGE試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1等購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；白藜蘆醇購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK-8試劑盒、caspase-3和caspase-9 酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司；抗體cas?pase-3、caspase-9和內(nèi)參β-actin購(gòu)自博士德生物公司。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜和電化學(xué)發(fā)光（electro-chemi-luminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；Mito Tracker Deep Red購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 Res溶液配置和處理 稱取100 mg Res，以DMSO溶解，并加入三蒸水使其濃度為1.0 mmol/L，過(guò)濾后-20 ℃保存。藥物處理時(shí)，將Res母液分別加入4 mL培養(yǎng)液中，使得白藜蘆醇的工作液濃度分別為10、20、40 μmol/L。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 PCOS模型鼠（n=24）的建立采用本課題組一直采用的方法，如下：大鼠麻醉后，于頸背部皮下注射脫0.2 mL芝麻油劑和氫表雄酮6 mg/100（g·d），然后在腹部皮下注射諾和N 2 IU/d。模型對(duì)照組（n=8）直接采取背部皮下注射注射0.2 mL芝麻油，均連續(xù)注射35 d后停藥[16]。

1.2.3 卵巢顆粒細(xì)胞的收集和培養(yǎng) PCOS大鼠模型成功建立后處死SD大鼠，取出卵巢并小心剝離其周圍的脂肪組織等，生理鹽水、PBS緩沖液沖洗后剝離囊狀卵泡；再次沖洗，刺破卵泡，釋放卵巢顆粒細(xì)胞；用200目細(xì)胞篩將卵泡膜濾出，1 500 r/min×5 min，棄上清；再次1 500 r/min×5 min，棄上清后用含有1% 青霉素/鏈霉素和10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并均勻接種于培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定用免疫細(xì)胞化學(xué)法[17]。

1.2.4 CCK-8 將顆粒細(xì)胞按每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用不同濃度（5、10、20、40、80 μmol/L）Res處理該細(xì)胞，作用48 h，并設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組即DMSO 組（濃度為0.1%），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀上檢測(cè)其450 nm處的吸光度（absorbance，A）值，并按下列公式計(jì)算白藜蘆醇對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖率的影響：顆粒細(xì)胞增殖率（％）=（實(shí)驗(yàn)組吸收值A(chǔ)450 nm-空白對(duì)照吸收值A(chǔ)450 nm）（/ 對(duì)照組吸收值A(chǔ)450 nm-空白對(duì)照吸收值A(chǔ)450 nm）×100%。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè) 采用流式細(xì)胞法。將顆粒細(xì)胞接種于24 孔板中，密度為5×105 個(gè)/孔。分別給予溶劑DMSO和5、20、40 μmol/L的Res處理。收集每組細(xì)胞懸液至無(wú)菌EP管中；離心400 g×5 min，洗掉上清；用0.5 mL JC-1工作液懸浮細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育15～30 min；離心400 g×5 min，洗掉上清；用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心400 g×5 min，吸掉上清；再次用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心400 g×5 min，吸掉上清；用0.5 mL新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行后續(xù)的流式分析。

1.2.6 Mito Tracker Deep Red 染色-線粒體紅色熒光探針 分組同上：為溶劑DMSO對(duì)照組和5、20、40 μmol/L Res處理組。配置Mito Tracker Deep Red儲(chǔ)存液工作液，并避光保存。將貼壁的顆粒細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，RES處理后加入MitoTracker Deep Red 工作液，37 ℃孵育15～30 min；去除MitoTracker Deep Red工作液，加入37 ℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.7 ATP 含量檢測(cè) 分組同上：溶劑DMSO 對(duì)照組和5、20、40 μmol/L Res處理組。采用ATP檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)單步驟如下：準(zhǔn)備試劑、樣品和制備標(biāo)準(zhǔn)品；分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上加樣標(biāo)準(zhǔn)品50 mL，待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液40 mL和待測(cè)樣品10 mL（樣品最終稀釋度為5倍）輕輕晃動(dòng)混勻；溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min；洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 mL，空白孔除外；再次孵育和洗滌后顯色：每孔先加入顯色劑A 50 mL，再加入顯色劑B 50 mL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；終止：每孔加終止液50 mL，終止反應(yīng)并進(jìn)行測(cè)定（450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的A值）。

1.2.8 Caspase3和 caspase9的活性檢測(cè) 分組同上，為溶劑DMSO對(duì)照組和5、20、40 μmol/L Res處理組。收集Res處理后的各組顆粒細(xì)胞后，用PBS洗滌細(xì)胞2次（離心2 000 r/min，5 min），收集（3～5）×106個(gè)細(xì)胞；在沉淀的細(xì)胞中加入200 μL冰冷Lysis Buffer 吹打均勻；置冰上裂解20 min，渦旋振蕩4 次，每次10 s；4 ℃，離心10 000 r/min×1 min；小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；測(cè)定其中的蛋白濃度；吸取 50 μL含100～200 μg蛋白的細(xì)胞樣品加入50 μL的2×Reaction Buffer，再加入5 μL Caspase-3 Substrate，充分混勻后于37 ℃避光孵育4 h；酶標(biāo)儀在λ=405 nm測(cè)定其A值。通過(guò)計(jì)算ARes/A對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定其活性的大小變化。Caspase-9方法同caspase-3。

1.2.9 Western blot 收集各組顆粒細(xì)胞，加入1 mL蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min×15 min 離心后，用Bradford法測(cè)定每組蛋白樣品濃度并分裝保存。配置8%～10%的Page膠，上樣40 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后置入TBST稀釋的抗體caspase-3、caspase-9和β-actin，4 ℃孵育過(guò)夜；充分洗滌后加入1∶5 000的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，最后用ECL 發(fā)光試劑盒行曝光顯影，經(jīng)Bio-radChemical Dox XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-x± s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Res促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖

Res促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組、溶劑DMSO 組和5、10、20、40、80 μmol/L 的Res處理的顆粒細(xì)胞的增殖率分別為：42.3±1.06、41.2±1.40、45.5±1.35、61.2±1.92、71.9±1.81、81.5±0.737 和82.5±1.70，7 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=449.368，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與空白對(duì)照組和DMSO處理組比較，5 μmol/L Res處理顆粒細(xì)胞48 h 后，顆粒細(xì)胞的增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.068、P=0.063），空白對(duì)照組和DMSO處理組比較顆粒細(xì)胞的增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.394），40和80 μmol/L比較組顆粒細(xì)胞的增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P=0.438），其余各比較組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）（圖1）。

2.2 Res維持了卵巢顆粒細(xì)胞線粒體質(zhì)量

為了更好地表征線粒體的存在，本研究利用MitoTracker Deep Red染色通過(guò)共聚焦顯微鏡分析了它們的形態(tài)和質(zhì)量的變化。如圖2所示，在PCOS卵巢顆粒細(xì)胞DMSO處理后發(fā)現(xiàn)，線粒體的質(zhì)量明顯減少，呈現(xiàn)小的碎片狀；5 μmol/L Res處理后，線粒體的質(zhì)量變化無(wú)明顯改變；當(dāng)Res濃度增加至20 μmol/L和40 μmol/L后，線粒體的質(zhì)量明顯增加，呈現(xiàn)出管狀或長(zhǎng)條狀。

2.3 Res增加了卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)ATP的生成

溶劑DMSO 組和5、20、40 μmol/L 的ATP 含量分別為：1.170±0.080、1.240±0.0917、2.233±0.1210、3.243±0.050，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=358.325，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)Res濃度為5 μmol/L時(shí)，卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ATP含量無(wú)顯著增加，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.366）；當(dāng)濃度增加至20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的ATP明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和P=0.000）；與20 μmol/L比較，40 μmol/L的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的ATP明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（圖3）。

2.4 Res提升了卵巢顆粒細(xì)胞線粒體膜電位

陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光染料JC-1是檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑，有單體和多聚體2種形式。前者在流式細(xì)胞儀中綠色（FL-1）通道檢測(cè)出綠色熒光；而后者多聚體在FL-2通道檢測(cè)出現(xiàn)紅色熒光。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，線粒體膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，主要以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。因此，根椐這一特征檢測(cè)線粒體膜電位的變化，以顯示細(xì)胞的凋亡水平變化。溶劑DMSO 組和5、20、40 μmol/L 的膜電位分別為：12.050 30±0.187 35、13.928 70±0.951 42、29.233 30±0.545 01、60.980 00±2.920 09，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=623.988，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO 處理組比較，當(dāng)Res 濃度為5 μmol/L時(shí)，顆粒細(xì)胞的膜電位沒(méi)有明顯改變，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.179）；當(dāng)濃度增加至20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)，顆粒細(xì)胞的膜電位明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和P=0.000）；與20 μmol/L比較，40 μmol/L的顆粒細(xì)胞膜電位顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（圖4，n=3）。

2.5 Res降低了PCOS卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9的酶活性和蛋白的表達(dá)

如圖5，溶劑DMSO組和5、20、40 μmol/L的caspase-3酶活性和caspase-9酶活性的相對(duì)值分別為：5.633 30±0.285 37、5.656 70±0.292 80、3.267±0.16010、2.803 30±0.148 15 及4.593 30±0.092 92、4.486 70±0.100 17、3.656 70±0.075 72、2.523 30±0.041 63，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=120.383，P1=0.000；F2=420.981，P2=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)Res濃度為5 μmol/L時(shí)，卵巢顆粒細(xì)胞的caspase-3酶活性和caspase-9酶活性沒(méi)有明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.907、P2=0.145）；當(dāng)濃度增加至20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)，顆粒細(xì)胞的凋亡明顯抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.000、P2=0.000）；與20 μmol/L 比較，40 μmol/L的顆粒細(xì)胞凋亡率明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.000、P2=0.027）。

如圖6，溶劑DMSO組和5、20、40 μmol/L的caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的相對(duì)值分別為：0.911 670±0.015 500、0.917 330±0.012 633、0.557 670±0.011 015、0.298 330±0.017 243 及0.852 330±0.009 609、0.814 000±0.014 107、0.289 670±0.010 017、0.206 670±0.013 204，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=1 319.732，P1=0.000；F2=2 448.086，P2=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)Res濃度為5 μmol/L時(shí)，卵巢顆粒細(xì)胞的caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯改變，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.641、P2=0.704）；當(dāng)濃度增加至20 μmol/L 和40 μmol/L 時(shí)，顆粒細(xì)胞的蛋白表達(dá)明顯抑制，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.000、P2=0.000）；與20 μmol/L比較，40 μmol/L的顆粒細(xì)胞凋亡率明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.000、P2=0.000）。

3 討論

卵泡發(fā)育障礙既是PCOS 重要的臨床特征之一，也是PCOS主要的病理學(xué)改變。卵泡發(fā)育障礙多變現(xiàn)為多囊狀態(tài)，卵巢皮質(zhì)增厚、黃體化內(nèi)鞘、基質(zhì)增生、多發(fā)小囊泡以及多發(fā)未成熟的卵泡[18]。卵泡主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成，其中，顆粒細(xì)胞是圍繞在卵母細(xì)胞周圍的一類體細(xì)胞，它與膜細(xì)胞相互作用是卵泡發(fā)育和維持正常功能的重要條件。顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，功能和數(shù)量的變化都直接影響著卵母細(xì)胞的發(fā)育、排卵、受精以及胚胎著床等過(guò)程，是卵泡發(fā)育的重要標(biāo)志。目前，在生殖醫(yī)學(xué)中評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量以及發(fā)育動(dòng)力學(xué)相關(guān)的信息量有限，加之獲取方式的局限性，而顆粒細(xì)胞的獲取相對(duì)容易，且對(duì)卵泡發(fā)育有著重要意義，因此評(píng)估顆粒細(xì)胞的形態(tài)和功能就顯得尤其重要。

線粒體是重要的細(xì)胞器之一，是物質(zhì)代謝和能量代謝的重要場(chǎng)所。線粒體富含于顆粒細(xì)胞中，它的數(shù)量、形態(tài)和功能不僅直接影響著顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝、細(xì)胞周期以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，還影響著卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量。線粒體一旦發(fā)生異?？捎绊懻５念w粒細(xì)胞的功能，甚至導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡或死亡。研究已發(fā)現(xiàn)，在PCOS模型中，顆粒細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的線粒體嵴腫脹、消失、膜破裂和空泡等變化，甚至還出現(xiàn)線粒體分裂與融合動(dòng)態(tài)失衡等。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射氫表雄酮和諾和N構(gòu)建了PCOS的大鼠模型，并成功獲取了顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞中存在著大量線粒體損傷的表現(xiàn)：Mito Tracker Deep Red 染色后線粒體數(shù)量變少，質(zhì)量較小，且呈碎片狀；膜電位下降，發(fā)生去極化；顆粒細(xì)胞中ATP的生成量也下降，顆粒細(xì)胞的增殖率也降低。線粒體數(shù)量變少、質(zhì)量減小以及呈碎片狀是由于PCOS 造成了線粒體從正常的豆?fàn)钭兂汕驙睿⒊霈F(xiàn)線粒體嵴的斷裂、消失，甚至線粒體損失等；ATP生成量下降是由于線粒體的數(shù)量和形態(tài)的改變必然導(dǎo)致功能的改變，而能量代謝是線粒體的重要功能，ATP又是最重要能量形式，是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源，因此ATP 生成必然下降。另外，線粒體是調(diào)控凋亡的重要場(chǎng)所，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑也是真核細(xì)胞凋亡的重要途徑。一旦細(xì)胞線粒體受到損傷，其功能就會(huì)發(fā)生異常，比如引起氧化呼吸鏈的改變和活性氧等異常，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激等導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，表現(xiàn)為膜電位下降，與凋亡密切相關(guān)的caspase-3和caspase-9的酶活性和蛋白表達(dá)水平都處于高水平狀態(tài)。當(dāng)大量顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡后，其增殖也可能受到影響。

研究表明，多數(shù)植物提取物對(duì)PCOS動(dòng)物模型都有較明顯的治療效果，如姜黃素[19]、EGCG[20]等，這些化合物大多具有多機(jī)制、多靶點(diǎn)、低毒副作用，因此吸引了生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)生的目光。Res也是一種天然的多酚類植物化合物，也可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路地發(fā)揮其廣泛的藥理作用[21-22]。大量研究證實(shí)，Res可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能而發(fā)揮其抗腫瘤[23]、抗免疫應(yīng)激[24]、抗急性損傷[25]等功能，但對(duì)PCOS的顆粒細(xì)胞的線粒體是否也具有保護(hù)功能卻報(bào)道甚少。本研究結(jié)果表明，Res作用于PCOS大鼠模型顆粒細(xì)胞后，顆粒細(xì)胞的增殖率明顯提升，且呈濃度依賴性。結(jié)果還表明，Res對(duì)顆粒細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和功能都有明顯的改善作用：Mito Tracker Deep Red染色后發(fā)現(xiàn)線粒體的數(shù)量增加，質(zhì)量增加，其形態(tài)也從碎片狀恢復(fù)至條狀或管狀；隨著形態(tài)和數(shù)量的恢復(fù)，線粒體的功能也有顯著改善，顆粒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ATP量增多，線粒體介導(dǎo)的凋亡水平也受到了抑制，表現(xiàn)為線粒體去極化也逐漸減弱，膜電位得到提高，caspase-3和caspase-9的酶活性和蛋白表達(dá)水平都明顯降低。這說(shuō)明Res可抑制PCOS模型顆粒細(xì)胞線粒體損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，Res可通過(guò)改善PCOS卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和功能，抑制線粒體損傷所誘導(dǎo)的凋亡，同時(shí)也促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮其保護(hù)作用，這對(duì)深入探討Res在PCOS中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制具有重要的意義，但仍需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：李青穎）