摘要：目的 試驗(yàn)旨在獲得單核細(xì)胞增生李斯特菌新疆冷凍雞肉分離株LM928中LIPI-4 Lm4b_02327基因的重組蛋白。方法 根據(jù)Gen Bank 中 LM Clip80459菌株（登錄號(hào)CAS06084.1）Lm4b_02327序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR對(duì)Lm4b_02327基因進(jìn)行擴(kuò)增，純化目的片段后克隆至pMD19-T載體，雙酶切篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后利用軟件預(yù)測(cè)Lm4b_02327序列編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)該基因片段的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比。同時(shí)構(gòu)建pET32a-Lm4b_02327重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)、純化蛋白后用Western Blot鑒定。結(jié)果 LM928菌株的Lm4b_02327基因全長(zhǎng)為315 bp，共編碼105個(gè)氨基酸，該蛋白為偏酸性、無(wú)信號(hào)肽、親水性、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)、定位于細(xì)胞質(zhì)的不穩(wěn)定蛋白，該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)為PTSLac EⅡA組分。LM928菌株Lm4b_02327基因的核苷酸和氨基酸序列與CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性均為100.0%，與52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的核苷酸同源性分別為99.7%、97.8%和97.8%，與52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的氨基酸同源性分別為99.0%、94.3%和94.3%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，LM928菌株的Lm4b_02327基因與4b血清型菌株聚為同一分支。經(jīng)誘導(dǎo)后，pET32a-Lm4b_02327重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定表明該重組蛋白大小約為30 kDa，與預(yù)期大小一致。結(jié)論 本研究成功克隆Lm4b_02327基因，并獲得該蛋白的大量表達(dá)，為深入研究蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)魏思?xì)胞增多李斯特菌；Lm4b_02327基因；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Cloning， bioinformatics analysis and prokaryotic expression of the Lm4b_02327 gene of LIPI-4 from Listeria monocytogenes

LIU "Caixia，MA "Xun，LYU "Shuangfei，WANG "Jing*，KOU "Lijun，SHI "Weidi，KONG "Cuilian，

QIAN "Ruixuan，GAO "Shengjie，REN "Huijie

（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China）

Abstract： Objectives The objective of the study was to obtain the recombinant protein of the LIPI-4 Lm4b_02327 gene in the Listeria monocytogenes LM928 Xinjiang frozen chicken isolate.Methods The specific primers were designed based on the sequence of Lm4b_02327 of strain LM Clip80459 （CAS06084.1） in Gen Bank. The Lm4b_02327 gene was amplified by PCR， purified， and cloned into the pMD19-T vector， and the positive clones were screened for sequencing by double digestion. The software was then used to predict the physicochemical properties， secondary structure， and tertiary structure of the protein encoded by the Lm4b_02327 sequence， and the homology of nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of the gene fragment was compared. In the meantime， pET32a-Lm4b_02327 recombinant plasmid was constructed， transformed into E. coli BL21（DE3） receptor cells， and the protein was detected by SDS-PAGE， purified， and identified by Western Blot after induced expression.Conclusions The Lm4b_02327 gene of strain LM928 is 315 bp and encodes 105 amino acids. The encoded protein is an acidic， non-signaling peptide， hydrophilic， non-transmembrane-structured， unstable， cytoplasmic protein that is predicted to be a PTSLac EIIA component. The nucleotide and amino acid sequences of the LM928 Lm4b_02327 gene were identical to those of strains CFSAN023463， 52854， 02-6680， 02-6679， ICDC-LM188， LM3， N2306， GTA-L356 and Clip80459 to a degree of 100 %; The nucleotide homology with strains 52860， FSL-J1-158， and FSL J1-208 was 99.7%， 97.8%， and 97.8%， respectively; and the amino acid homology was 99.0%， 94.3%， and 94.3%. The Lm4b_02327 gene of strain LM928 clustered on the same branch as the 4b serotype strain， as shown by the phylogenetic tree. After induction， the pET32a-Lm4b_02327 recombinant plasmid was abundantly expressed in E.coli BL21， and SDS-PAGE and WesternBlot analysis revealed that the size of the recombinant protein was approximately 30 kDa， which was consistent with the predicted size. Results In this study， the Lm4b_02327 gene was successfully cloned， and a large quantity of protein expression was obtained， laying foundations for a comprehensive investigation into the function of the protein.

Key words： Listeria monocytogenes;Lm4b_02327 gene;Bioinformatics analysis;prokaryotic expression

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種機(jī)會(huì)性和高度侵襲性的食源性致病菌，能引起人和動(dòng)物的李斯特菌病，感染宿主主要表現(xiàn)為腦膜炎與敗血癥，常見(jiàn)于老年人和孕婦等免疫功能低下的群體中，孕婦或孕畜感染LM后通常發(fā)展為非特異性的感染性發(fā)熱疾病，進(jìn)一步引發(fā)胎盤感染，導(dǎo)致胎兒的早產(chǎn)、流產(chǎn)甚至死產(chǎn)等嚴(yán)重后果［1］。LM在1℃～45℃條件下生長(zhǎng)，在-20℃下可以存活1年，還能在高鹽、酸性條件下生存，該菌可以形成生物被膜以及在基因水平轉(zhuǎn)移和外排泵等機(jī)制的作用下產(chǎn)生耐藥性，以上特性增加了LM的防治難度［2］。因此，LM不僅對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響，也給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)較大威脅。

Maury等［3］在2016年發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的毒力島4（Listeria pathogenicity island 4，LIPI-4），這是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和母胎感染密切相關(guān)的特異性毒力因子。LIPI-4本質(zhì)上是一個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS），由編碼麥芽糖-6′-磷酸葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)錄抗終止子、與PTS系統(tǒng)相關(guān)的未知蛋白和膜透性酶Ⅱ（EⅡA、EⅡB、EⅡC）6個(gè)基因組成［4-5］。PTS的功能不僅負(fù)責(zé)碳水化合物的磷酸化和轉(zhuǎn)運(yùn)，還具有介導(dǎo)碳代謝調(diào)節(jié)、碳源儲(chǔ)備、協(xié)調(diào)碳氮代謝平衡、調(diào)節(jié)鐵鉀穩(wěn)態(tài)、毒力調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)等功能［6］。經(jīng)PCR驗(yàn)證分析，LM928菌株中含有LIPI-4基因［4］。

生物信息學(xué)分析對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)具有顯著的指導(dǎo)作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)使得其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［7］。此外，原核表達(dá)在快速制備抗體和體外功能研究方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)、分子量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、親疏水性、序列保守程度和GC含量等都會(huì)對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)生重要影響［8］。本研究通過(guò)克隆測(cè)序和生物信息學(xué)分析LM928菌株LIPI-4中的Lm4b_02327基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒以實(shí)現(xiàn)該蛋白的大量表達(dá)，為進(jìn)一步探討Lm4b_02327基因在LM LIPI-4致血腦屏障和胎盤屏障損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

LM928（1/2b血清型，ST87）菌株從新疆冷凍雞肉中分離；DL 2000 Plus DNA Marker、2×Taq Plus Master Mix Ⅱ、產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T（simple）、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物公司；腦心浸出液（BHI）和LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購(gòu)自Cytiva；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、Blue Plus Protein Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET32a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；硝酸纖維素（NC）膜購(gòu)自北京白鯊易科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Gen Bank 中 LM Clip80459菌株Lm4b_02327序列（登錄號(hào)CAS06084.1）用Oligo 6.0 軟件自行設(shè)計(jì)引物。引物序列：上游F：5′- CCGGAATTCATGGAAGGCACTGAATTACAG-3′，下游R：5′-CCGCTCGAGTTACTTTTCATCCAAACGCTTATA-3′（生工生物工程（上海）股份有限公司合成），預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為315 bp。

1.2.2PCR擴(kuò)增目的基因

為提取LM928菌株的DNA，將單菌落挑取到BHI液體培養(yǎng)基中，于37℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～14 h。之后，按照試劑盒說(shuō)明書提取了LM928菌株的基因組DNA。以提取的DNA為模板，對(duì)Lm4b_02327基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增（PCR擴(kuò)增體系為50 μL，引物退火溫度為58 ℃）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將其按照產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書純化回收，按照李紅歡［9］描述的方法連接至pMD19-T并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆后，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3生物信息學(xué)分析

利用在線軟件對(duì)Lm4b_02327編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)（ProtParam 軟件）、跨膜區(qū)域（TMHMM 軟件）、信號(hào)肽（SignalP 4.1 Server 軟件）、親疏水性分析（ProtScale軟件），并進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)（SOPMA 軟件）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（SWISS-MODEL 軟件）、亞細(xì)胞定位位置（Cell-PLoc-2）和磷酸化位點(diǎn)（Group-based Prediction System軟件）進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用DNAstar軟件對(duì)LM928 Lm4b_02327的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。再利用NCBI CDD 軟件預(yù)測(cè)Lm4b_02327基因編碼蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.4重組質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327的構(gòu)建

按照李紅歡［9］描述的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒：將測(cè)序正確的pMD19-T-Lm4b_02327質(zhì)粒和pET32a質(zhì)粒雙酶切（EcoR I和Xho I），0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后純化回收線性化的pET32a和目的片段，T4連接酶在4℃下過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定。

1.2.5目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

按照李紅歡［10］描述方法將重組質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327和pET32a空載體利用冷熱激法分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選出正確的轉(zhuǎn)化子。在37℃、160 r·min-1培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6至0.8，加入IPTG（終濃度為0.1mmol·L-1）以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。分別在0、2、4、6和8 h收集1mL菌液，8 000 r·min-1離心后，用無(wú)菌去離子水洗滌1次，將菌體懸浮在無(wú)菌去離子水中，按照比例加入 5×SDS-PAGE Loading Buffer，振蕩混勻后煮沸10 min以使蛋白質(zhì)變性，冰浴后取5μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色20 min，脫色后觀察結(jié)果。

1.2.6Lm4b_02327蛋白的純化與Western Blot鑒定

收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，液氮反復(fù)凍融3～5次，超聲裂解誘導(dǎo)菌體，高速離心30min后用SDS-PAGE電泳檢測(cè)以確定蛋白表達(dá)在上清液或沉淀中。之后利用親和層析柱法純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)后，將蛋白轉(zhuǎn)印約30 min至NC膜（0.22 μm），TBST水平振蕩10 min，重復(fù)3次，5%脫脂奶粉于常溫封閉2 h，TBST洗滌3次，加入鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體（1∶6 000）4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗滌3次，加入二抗（山羊抗鼠）IgG（1∶3 000），室溫振蕩孵育2 h，TBST洗滌3次，DAB避光顯色后進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1Lm4b_02327基因 PCR 擴(kuò)增及克隆測(cè)序

通過(guò)使用LM928菌株的DNA作為模板，利用特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Lm4b_02327目的基因。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在315 bp處呈現(xiàn)出清晰、單一的目標(biāo)條帶（圖1）。經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選和測(cè)序鑒定，Lm4b_02327基因的序列長(zhǎng)度為315 bp。

2.2蛋白基本理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ProtParam分析 Lm4b_02327基因的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示該基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為104個(gè)，分子量為約11.55 kDa，分子式為C503H803N139O164S4，理論等電點(diǎn)為5.11，消光系數(shù)（280nm）為3105，該蛋白有17個(gè)負(fù)電荷殘基，10個(gè)正電荷殘基，其不穩(wěn)定系數(shù)為54.37（gt;40為不穩(wěn)定性蛋白），進(jìn)一步表明該蛋白不穩(wěn)定。Lm4b_02327編碼的蛋白脂溶性系數(shù)為92.98，總平均疏水性為-0.267，通過(guò)ProtScale軟件分析表明其疏水性最大值為1.600，最小值為-1.967，且親水區(qū)域明顯大于疏水區(qū)域（圖2A），因此推斷Lm4b_02327基因編碼的蛋白屬于親水蛋白。Lm4b_02327蛋白無(wú)跨膜區(qū)域存在（圖2B），屬于非跨膜蛋白。通過(guò)SignaIP 4.1 Lm4b_02327蛋白預(yù)測(cè)顯示該蛋白不存在信號(hào)肽區(qū)域（圖2C）。使用Cell-PLoc-2在線軟件對(duì)Lm4b_02327蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞器定位，結(jié)果顯示該蛋白最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2D）。利用Group-based Prediction System軟件對(duì)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)占92%，剩余8%則蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（圖2E）。

2.3蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)分析

通過(guò)NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，我們預(yù)測(cè)Lm4b_02327蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于PTS_EⅡA_Lac超家族（圖3A）。利用在線軟件SOPMA，我們預(yù)測(cè)了LM928菌株的Lm4b_02327蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3B）。分析結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括70.19%的α-螺旋（Hh），共73個(gè)氨基酸殘基；8.65%的β-轉(zhuǎn)角（Tt），共9個(gè)氨基酸殘基；10.58%的無(wú)規(guī)則卷曲（Cc），共11個(gè)氨基酸殘基以及10.58%的延伸鏈（Ee），共11個(gè)氨基酸殘基。此外，我們還利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)了該蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖3C），其GMQE值為0.82，QMEAN4server值為0.79±0.05（表1）。

2.4基因序列同源性比對(duì)

本研究通過(guò)DNAstar軟件，將LM928菌株的Lm4b_02327基因的核苷酸與氨基酸序列與Gen Bank上公布的12株不同來(lái)源LM菌株的Lm4b_02327基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)（表1）。結(jié)果顯示：Lm4b_02327 核苷酸序列與CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性為100.0%；與52860菌株同源性為99.7%；與FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的同源性為97.8%。在NCBI 中預(yù)測(cè) Lm4b_02327 基因編碼蛋白的最大開(kāi)放閱讀框（ORF）為315bp，共編碼 105個(gè)氨基酸。LM928菌株Lm4b_02327 編碼的氨基酸與CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性為100.0%；與52860菌株同源性為99.0%；與FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的同源性為94.3%（圖4）。

2.5基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用Mega 7.0軟件分析LM928菌株和GenBank中的12株不同菌株的Lm4b_02327基因的分子進(jìn)化關(guān)系分析，構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，LM928與4b血清型菌株（52854、02-6680、02-6679、LM3、和Clip80459）和未知血清型的菌株（CFSAN023463、ICDC-LM188、N2306、GTA-L356）為同一分支，聚成一個(gè)類群，與4a血清型（FSL J1-208）、4c血清型（FSL-J1-158）和未知血清型（52860）菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

2.6重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327的鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示得到了315 bp和5900 bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖6），表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327。

2.7目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327和空載體轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）后，在IPTG的誘導(dǎo)下，比較菌株在不同時(shí)間點(diǎn)蛋白的表達(dá)情況。分別收集0、2、4、6和8 h時(shí)菌液1mL，加入5×loading buffer煮沸裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示空載體在20 ku左右有明顯蛋白條帶，而重組質(zhì)粒pET32a-Lm4b_02327經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后在30 ku左右出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小一致（圖7）。此外，該蛋白的表達(dá)量不隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

2.8Lm4b_02327蛋白的純化與Western Blot鑒定

經(jīng)過(guò)對(duì)重組菌誘導(dǎo)后通過(guò)液氮反復(fù)凍融和超聲破碎處理，重組菌的上清液和沉淀物通過(guò)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，目的蛋白主要存在于上清液中（圖8A）。通過(guò)親和層析柱進(jìn)行目標(biāo)蛋白的純化，蔗糖濃縮后得到純化的Lm4b_02327蛋白（圖8B）。Western Blot鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒和空載體在30和20 kDa處均產(chǎn)生了明顯的蛋白印跡條帶（圖8C），這表明成功表達(dá)Lm4b_02327蛋白。

3討論

PTS EⅡA已被證明與毒力相關(guān)，Liu等［11］構(gòu)建F2365菌株的果糖PTS EⅡA基因缺失株，結(jié)果顯示在缺失突變體中脅迫相關(guān)基因clpC的表達(dá)水平都升高，并且編碼EⅡA的缺失株顯著降低了F2365菌株對(duì)HT-29細(xì)胞的侵襲以及胞間傳播能力；吳昕彧等［12］證實(shí)了ptx A（EⅡA）、ptx B（EⅡB）基因與變異鏈球菌抗壞血酸代謝相關(guān)，野生株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力明顯高于ptx A基因缺失株，ptx B及ptx AB雙重基因缺失株甚至無(wú)法生長(zhǎng)；本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明Lm4b_02327對(duì)LM體外生長(zhǎng)沒(méi)有作用，但其對(duì)LM重要的毒力因子在體內(nèi)、外均具有顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［5］，提示LM LIPI-4可能通過(guò)Lm4b_02327參與調(diào)控細(xì)菌毒力。

本研究采用PCR方法從LM928菌株中成功克隆Lm4b_02327基因，測(cè)序結(jié)果顯示該基因315 bp中包含315 bp開(kāi)放閱讀框，編碼105個(gè)氨基酸。Lm4b_02327基因的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)為PTSLac中的EⅡA，該蛋白是一種偏酸性、親水性、不穩(wěn)定、不存在信號(hào)肽的非跨膜蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中。同源性分析結(jié)果顯示LM928 Lm4b_02327與參考4b型菌株同源性很高，其中與75%（9/12）菌株的核苷酸和氨基酸同源性均為100.0%，其中包括食品和環(huán)境中分離的CFSAN023463（桃，美國(guó)）、02-6680（環(huán)境、奶酪，加拿大）、LM3（菠菜，加拿大）和GTA-L356（蔬菜沙拉加拿大）菌株，還包括臨床來(lái)源的52854（牛宮頸-陰道拭子，美國(guó)）、02-6679（人糞便，加拿大）、ICDC-LM188（人—敗血癥—血液，中國(guó)北京）和N2306 （人—血液，瑞典）菌株；另外與52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的氨基酸同源性相似性高達(dá)99%、94.3%和94.3%。該結(jié)果提示分離株LM928可能會(huì)在人、家畜動(dòng)物、食品和環(huán)境中都有傳播，應(yīng)當(dāng)引起重視。另外，LM928屬于ST87型，該ST型是我國(guó)從人李斯特菌病中分離到的最常見(jiàn)的ST，在各種食品來(lái)源中均有發(fā)現(xiàn)，ST87主要存在于新鮮蔬菜樣品中，占LM總種群的36.7%，其次是ST8（26.7%）、ST9（13.3%）和ST3（6.7%）［13］。ST87型LM具有較高的臨床相關(guān)性，其中LIPI-4在ST87型LM中均存在［14］。2014～2016年Zhang等［15］在北京臨床中分離出49株LM，其中ST87型占12.2%（6/49），其中跟妊娠相關(guān)的有3株；2016—2018年Li等［16］在浙江省分離出13株與妊娠相關(guān)的LM，其中最常見(jiàn)的ST型為ST87和ST7。2023年Yuan等［17］在北京發(fā)現(xiàn)一例28歲孕16周4 d的患者，因發(fā)熱4 d入院，在血液中分離出ST87型LM。由此可見(jiàn)LM928可能會(huì)引發(fā)人或易感動(dòng)物的李斯特菌病，LIPI-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和母胎感染密切相關(guān)的特異性毒力因子，因此探究LIPI-4中各基因（如Lm4b_02327）在LIPI-4致血腦屏障和血胎屏障損傷中發(fā)揮的作用至關(guān)重要。

本研究通過(guò)構(gòu)建新疆冷凍雞肉分離菌株LM928 Lm4b_02327基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后誘導(dǎo)表達(dá)出2種形式的重組蛋白，其中可溶性蛋白形式表達(dá)量顯著高于包涵體形式表達(dá)量，由于可溶性蛋白具有活性好，后續(xù)的純化相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，故本研究從上清液中純化獲得了重組蛋白，SDS-PAGE與Western Blot鑒定結(jié)果表明本研究成功高效表達(dá)Lm4b_02327蛋白。為進(jìn)一步制備Lm4b_02327蛋白抗體及探索Lm4b_02327基因在LM LIPI-4致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-04-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160834，32160833）

作者簡(jiǎn)介：劉彩霞（1998—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物傳染病的診斷與防治研究。

*通信作者：王靜（1982—），女，副教授，從事分子病原與免疫學(xué)研究，e-mail：wjtry100@163.com。

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2024.22.014

文章編號(hào)：1007-7383（2024）03-0313-08