摘要：目的 基于腸道菌群探討?zhàn)鲅云瑢︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。方法 36只SD大鼠隨機分為正常對照組、膠原誘導(dǎo)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（CIA）組、甲氨蝶呤0.002 g·kg-1劑量組、瘀血痹片0.4、0.8、1.6 g·kg-1（YXBL、YXBM、YXBH）劑量組，后5組采用牛Ⅱ型膠原乳劑誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，除正常組和CIA組大鼠給予三蒸水外，其余各組按上述劑量灌胃給藥。30 d后，測量各組大鼠脾臟、胸腺質(zhì)量，計算脾臟、胸腺指數(shù)；HE染色觀察滑膜組織、脾臟和結(jié)腸病理變化；16S rRNA高通量測序技術(shù)測定各組大鼠腸道菌群變化。結(jié)果 瘀血痹片可使CIA大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)下降（Pgt;0.05），足爪體積、踝周長、關(guān)節(jié)炎評分減少（Plt;0.01），滑膜組織增生減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少，改善脾臟和結(jié)腸病理變化，降低CIA大鼠腸道菌群中Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Monoglobus、UCG-005菌屬的相對豐度（Plt;0.05），增加Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度（Plt;0.05）。結(jié)論 瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有改善作用，可能與其調(diào)控腸道菌群有關(guān)。

關(guān)鍵詞：瘀血痹片；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；16S rRNA高通量測序技術(shù)；腸道菌群；物種差異性分析

中圖分類號：中圖分類號R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

The effect of Yuxuebi tablet on rheumatoid arthritis based on intestinal flora

SHAO "Ping1，HAN "Ling2，QI "Mushuang3，REN "Ying3，ZHU Wanjun3， DAI "Chunmei3，HU "Xiangka3*

（1 Benxi National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines Co.， Ltd.，

Benxi，Liaoning 117004， China; 2 China Resources Liaoning Benxi Third Pharmaceutical Co.， Ltd.， Benxi，

Liaoning 117004， China;

3 Jinzhou Medical University， Jinzhou，Liaoning 121001， China）

Abstract： "Objective To explore the effect of Yuxuebi tablet in the treatment of rheumatoid arthritis based on intestinal flora. Methods "Thirty-six SD rats were randomly divided into normal control group， collagen induced rheumatoid arthritis （CIA） group， methotrexate 0.002 g·kg-1 dose group， Yuxuebi tablet 0.4， 0.8， 1.6 g·kg-1 （YXBL， YXBM， YXBH） dose groups， the latter five groups were treated with bovine type Ⅱ collagen emulsion to induce rheumatoid arthritis model. Except for rats in the normal group and CIA group， which were given three distilled water， the other groups were given the above doses by intragastric administration. After 30 days， the weight of spleen and thymus of rats in each group was measured， and the spleen index and thymus index were calculated. HE staining was used to observe the pathological changes of synovial tissue， spleen and colon. 16S rRNA high-throughput sequencing technology was used to detect the changes in intestinal flora of rats in each group. Results The spleen index and thymus index of CIA rats were reduced （Pgt;0.05）， the paw volume， ankle circumference and arthritis score were decreased （Plt;0.01）， the synovial tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration were reduced， and the pathological changes of spleen and colon were improved after the CIA rats were treated with Yuxuebi tablet. Yuxuebi tablet could reduce the relative abundance of Fusicatenibacter， Erysipelotrichaceae_UCG-003， Monoglobus and UCG-005 （Plt;0.05）， and increase the relative abundance of Prevotellaceae_UCG-003 in the intestinal flora of CIA rats （Plt;0.05）. Conclusion Yuxuebi tablet can improve rheumatoid arthritis， which may be related to its regulation of intestinal flora.

Key words： Yuxuebi tablet;rheumatoid arthritis;16S rRNA high-throughput sequencing technology;intestinal flora;species difference analysis

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis， RA）是免疫激活和免疫耐受引起的最常見的一種全身炎癥性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、骨損傷、滑膜增生以及多種炎性細(xì)胞浸潤為特征，可嚴(yán)重?fù)p害身體功能、降低生活質(zhì)量［1］。全球RA患病率為0.2%～1%，中國RA患病率為0.28%～0.41%，共有近500萬人受影響［2］。RA患者發(fā)生嚴(yán)重感染、呼吸道疾病、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、癌癥和死亡的風(fēng)險高于普通人群［1］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因尚不清楚，但腸道微生物群失調(diào)可引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。人類胃腸道的黏膜表面有數(shù)萬億個共生微生物群，它們在宿主免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)、維持和功能中起著重要作用［3］。黏膜部位，可能是自身免疫啟動的部位。宿主和腸道微生物之間的相互作用部分是由腸道免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的，它們維持著一個復(fù)雜的平衡。腸道微生物群及其代謝物最顯著的功能之一是在黏膜表面系統(tǒng)的調(diào)節(jié)促炎的Th1和T細(xì)胞17（Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）之間的平衡，腸道微生物群失調(diào)可影響局部和全身免疫系統(tǒng)，并進(jìn)一步導(dǎo)致各種疾病，如RA［4］。因此，調(diào)節(jié)腸道微生物群可能是治療或預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展的一種策略。

16S rRNA為核糖體RNA的一個亞基，16S rDNA是編碼該亞基的基因。16S rDNA包括10個保守區(qū)域和9個高變區(qū)域，其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同而有一定的差異。因此，16S rDNA可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，用于測序分析和菌種鑒定。16S rRNA高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的差異比較分析。

中醫(yī)藥具有多分子、多靶點的優(yōu)勢，研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、調(diào)節(jié)機體免疫、降低炎癥因子、減輕炎性浸潤，改善RA癥狀［5］。瘀血痹片由乳香（炙）、威靈仙、紅花、丹參、沒藥（炙）、川牛膝、川芎、當(dāng)歸、姜黃、香附（炙）、炙黃芪組成，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，用于瘀血阻絡(luò)的痹證。研究表明瘀血痹片可能通過抑制LOX/Ras/Raf-1信號通路抑制血管生成來減輕RA的疾病嚴(yán)重程度、減少骨侵蝕，抑制NF-κB、JUN、p38的磷酸化，降低COX-2表達(dá)及炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平發(fā)揮抗炎作用［6-7］。本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得瘀血痹片治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素、丹參酮IIA、β-胡蘿卜素、鞣花酸、刺芒柄花素、異鼠李素和β-谷甾醇等度值排名前十的活性化合物，這些化合物可能是瘀血痹片改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。槲皮素可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群失調(diào)、抑制炎癥小體反應(yīng)保護(hù)非酒精性肝損傷［8］。木犀草素可減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥并調(diào)節(jié)腸道微生物群［9］。山奈酚通過恢復(fù)腸道微生物群、抑制 LPS-TLR4-NF-κB軸來緩解小鼠實驗性結(jié)腸炎［10］。黃芩素通過抑制皮質(zhì)促炎細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)腸道微生物群改善快速老化模型小鼠的衰老狀態(tài)和認(rèn)知功能［11］。β-胡蘿卜素通過增強腸上皮屏障功能和調(diào)節(jié)腸道微生物群對卵清蛋白誘導(dǎo)小鼠食物過敏產(chǎn)生保護(hù)作用［12］。瘀血痹片對RA宿主腸道菌群是否具有調(diào)節(jié)作用，目前還沒報道。本研究通過16S rRNA高通量測序探討?zhàn)鲅云瑢δz原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腸道菌群的影響，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新策略。

1材料與方法

1.1實驗藥物及試劑

瘀血痹片（遼寧華潤本溪三藥有限公司，規(guī)格：0.5 g×45片，批號：20220425），甲氨蝶呤片（規(guī)格：2.5 mg×16 片，上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：197220603）。牛Ⅱ型膠原（Bovine Type Ⅱ Collagen，Chondrex，規(guī)格：5 mL，貨號：20022）；不完全弗氏佐劑（IFA，Chondrex，規(guī)格：5 mL，貨號：7002）。

1.2實驗儀器

正置顯微鏡（Olympus， BX53F），高速冷凍離心機（Thermo Fisher， ST 16R）。

1.3實驗動物

SPF級雄性SD大鼠36只，180～200 g，購買于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2022072801），遵守實驗動物福利倫理原則，在錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，分籠飼養(yǎng)，室溫20 ℃～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h光照周期，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d進(jìn)行實驗。

2方法

1.4建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型［13］

將牛Ⅱ型膠原（CII，2 mg·mL-1）與不完全弗氏佐劑（IFA）在冰上避光等體積充分混合制成乳劑，第0天，每只大鼠尾根部2 cm處皮下注射0.2 mL；第7天進(jìn)行第2次免疫，每只大鼠尾根部皮下注射 0.1 mL乳劑（2 mg·mL-1 CII∶IFA= 1∶1），避開第一次注射部位。于第2次免疫后，每3天對各組大鼠的四肢關(guān)節(jié)及足爪情況進(jìn)行監(jiān)測，記錄每只大鼠的關(guān)節(jié)炎評分。模型判斷標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)炎評分為5級評分法：0分=無腫脹和紅斑出現(xiàn)；1分=可檢測到局限于足趾的腫脹和紅斑；2分=趾至跖骨輕度腫脹、紅斑；3分=足部至踝關(guān)節(jié)中度腫脹、紅斑；4分=包含踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的多個關(guān)節(jié)重度紅腫，嚴(yán)重功能障礙。AI評分 ≥ 4分，說明CIA造模成功。

1.5分組及給藥

36只SD雄性大鼠，隨機抽取6只作為正常對照組（Control），其余30只按照上述造模方法進(jìn)行造模，即初次免疫后第14天（即給藥第0天），將造模成功的30只SD大鼠隨機分為膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型組（CIA）、甲氨蝶呤0.002 g·kg-1劑量組（MTX）（相當(dāng)于臨床等效劑量）、瘀血痹片0.4 g·kg-1劑量組（YXBL）、瘀血痹片0.8 g·kg-1劑量組（YXBM）（相當(dāng)于臨床等效劑量）、瘀血痹片1.6 g·kg-1劑量組（YXBH），每組6只，對各組大鼠進(jìn)行稱重標(biāo)記。灌胃給藥30 d。

1.6檢測指標(biāo)及取樣

初次免疫后第14天（即給藥第0天），每 3 天對各組大鼠的四肢關(guān)節(jié)及足爪情況進(jìn)行監(jiān)測，記錄其關(guān)節(jié)炎評分，測量其踝周長和足爪體積。于末次給藥后24 h，留取各組大鼠糞便于無菌凍存管中，凍存于-80 ℃冰箱，備用。20%的烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，并對大鼠足爪以及踝關(guān)節(jié)進(jìn)行拍照。剖取大鼠胸腺、脾臟、滑膜以及結(jié)腸組織，其中一部分滑膜、脾臟和結(jié)腸組織浸泡于10%福爾馬林中，固定24 h，用于病理切片。

1.7臟器指數(shù)的計算

脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/體重（g）；胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/體重（g）。

1.8蘇木素-伊紅（HE）染色

取大鼠滑膜、脾臟和結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠滑膜、脾臟和結(jié)腸組織的病理變化。

1.916S rRNA測序

收集各組大鼠的新鮮糞便（約0.2 mg）于無菌管中，采用CTAB法進(jìn)行DNA提取，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取出的DNA純度和濃度；隨后取適量DNA于離心管中，并用無菌水稀釋至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)16Sv34擴增區(qū)域選擇引物（F：CCTAYGGGRBGCASCAG；R：GGACTACNNGGGTATCTAAT）進(jìn)行PCR擴增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，回收目的條帶，建庫、測序。截去barcode和引物序列，對樣本的reads進(jìn)行拼接、質(zhì)控。檢測嵌合體并進(jìn)行去除，從而得到最終的有效數(shù)據(jù)即Effective Tags，對其進(jìn)行降噪，過濾掉豐度小于5的序列，從而獲得最終的ASVs（Amplicon Sequence Variants，即擴增子序列變異）以及特征表。使用QIIME2軟件計算chao1、shannon和simpson指數(shù)，并繪制goods_coverage稀釋曲線（Rarefaction Curve）和物種累積箱形圖（Species Accumulation Boxplot）。使用QIIME2軟件計算Unifrac距離，調(diào)用QIIME2軟件中的adonis和anosim函數(shù)分析組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性。使用R軟件通過T檢驗進(jìn)行屬水平上的物種顯著差異性分析。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素多水平方差分析，方差齊則采用LSD法檢驗，方差不齊則采用Games-Howell法檢驗，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體重的影響

如圖1所示，與正常組大鼠相比，CIA組大鼠體重下降（Pgt;0.05），與CIA組相比，各給藥組大鼠體重增加（Pgt;0.05），但均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)作為檢測指標(biāo)可在一定程度上反映機體對抗原的免疫應(yīng)答水平，體現(xiàn)藥物對機體免疫功能的影響。機體免疫功能表現(xiàn)亢進(jìn)或抑制時，胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞也相應(yīng)地增殖或萎縮。如圖2所示，與正常組相比，CIA組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)升高（Pgt;0.05）；與CIA組相比，YXB各劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)下降（Pgt;0.05），MTX組胸腺指數(shù)下降（Pgt;0.05），但均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足爪、踝關(guān)節(jié)、足爪體積、關(guān)節(jié)炎評分、踝周長的影響

于初次免疫后第14天（即給藥第0天），CIA組以及各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎評分均大于4，說明CIA造模成功。隨著時間的延長，與正常組相比，CIA組大鼠的足爪體積增大（Plt;0.01），出現(xiàn)畸形，踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，踝周長增大（Plt;0.01），關(guān)節(jié)炎評分持續(xù)增高（Plt;0.01）；與CIA組相比，各給藥組足爪未出現(xiàn)畸形，踝關(guān)節(jié)腫脹度減輕，其中MTX組以及YXBM組和YXBH組大鼠足爪體積、關(guān)節(jié)炎評分以及踝周長下降（Plt;0.01），YXBL組大鼠足爪體積、關(guān)節(jié)炎評分下降（Plt;0.01），結(jié)果見圖3。

2.4瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響

滑膜由基質(zhì)和細(xì)胞及纖維構(gòu)成，內(nèi)表層平滑，為1～3層結(jié)締組織細(xì)胞，又稱滑膜細(xì)胞。細(xì)胞層下方即為毛細(xì)血管網(wǎng)，其下為纖維組織，其厚度因部位而不一，含有血管、淋巴管和神經(jīng)纖維，細(xì)胞成分有纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。如圖4所示，與正常組相比，CIA組大鼠滑膜組織內(nèi)表層細(xì)胞層次增加明顯、細(xì)胞密集，滑膜組織增生明顯，炎性細(xì)胞浸潤增多；與CIA組相比，MTX組大鼠以及瘀血痹片各劑量組大鼠滑膜組織增生減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少，其中MTX組以及YXBM和YXBH組大鼠滑膜組織基本正常。

2.5瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

脾臟分為白髓、紅髓和邊緣區(qū)，脾白髓內(nèi)含脾小體，脾小體與淋巴結(jié)的淋巴小體有著相似的結(jié)構(gòu)和特點，因此脾小體常有生發(fā)中心即炎癥的發(fā)生中心［14］。

如圖5所示，正常組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，脾小體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見，白髓與紅髓的邊界清晰。CIA組大鼠的脾小體形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，出現(xiàn)生發(fā)中心，白髓增生并向紅髓擴展，與紅髓界限模糊。MTX組以及瘀血痹片各劑量組的脾臟病理變化均有不同程度的改善。

2.6瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響

如圖6所示，正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，未發(fā)現(xiàn)炎癥等病變；CIA組大鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞形態(tài)不清晰，有壞死現(xiàn)象；MTX組和YXBL組大鼠結(jié)腸粘膜病變改善不大，YXBM組和YXBH組大鼠結(jié)腸粘膜炎性細(xì)胞浸潤減少，杯狀細(xì)胞形態(tài)清晰可見，無壞死現(xiàn)象，有向正常恢復(fù)的趨勢。

2.7瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腸道菌群的影響

2.7.1Alpha多樣性分析

如圖7A、7B、7C所示，與正常組相比，CIA組大鼠Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)增加（Pgt;0.05），與CIA組相比，MTX組、YXBL組大鼠Chao1指數(shù)降低（Pgt;0.05），YXBM組Shannon指數(shù)降低（Pgt;0.05）。說明了各組大鼠腸道菌群具有相似的物種多樣性和豐富度。根據(jù)多樣性指數(shù)goods_coverage的稀疏性曲線（圖7D），每個樣本中的ASVs數(shù)量與序列數(shù)呈正相關(guān)。隨著測序量的增加，曲線趨于平坦，表明測序深度基本上覆蓋了樣本中的所有物種。在一定范圍內(nèi)，隨著樣本量的加大，箱形圖位置趨于平緩（圖7E），表示此環(huán)境中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多，測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，樣本量較充分，更多的數(shù)據(jù)量不會對alpha多樣性指數(shù)有顯著的影響。

2.7.2Beta多樣性分析

Adonis分析結(jié)果顯示Plt;0.05（表1）。Anosim分析結(jié)果顯示：Control-CIA（R=0.432，P=0.015）；CIA-MTX（R=0.628，P=0.005）；CIA-YXBM（R=0.212，P=0.04），以上結(jié)果說明了CIA組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常組存在差異，MTX組、YXBM組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與CIA組存在差異。

Control：正常對照組；CIA：膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型組；MTX：甲氨蝶呤0.002g·kg-1劑量組；YXBL：瘀血痹片0.4 g·kg-1劑量組；YXBM：瘀血痹片0.8 g·kg-1劑量組；YXBH：瘀血痹片1.6 g·kg-1劑量組；Df：自由度；SumsOfSqs：總方差，又稱離差平方和；MeanSqs：均方（差），即SumsOfSqs/Df；F.Model：F檢驗值；R2：表示不同分組對樣本差異的解釋度，即分組方差與總方差的比值，R2 越大表示分組對差異的解釋度越高；Pr：P值，小于0.05說明本次檢驗的可信度高。group表示實驗中的分組方法，Residuals表示為殘差值，Total為總值。

2.7.3ASV分析

如圖8A所示，在門水平上，主要以擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Fimicutes）為主，與正常組相比，CIA組擬桿菌門相對豐度減少，厚壁菌門相對豐度增加，厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值增加（圖8E）。與CIA組相比，各給藥組擬桿菌門相對豐度減少，YXBH組厚壁菌門相對豐度減少，各給藥組F/B值增加（圖8E）。

如圖8B所示，與正常組相比，CIA組大鼠腸道菌群在屬水平上最大豐度排名前35的物種總豐度降低，與CIA組相比，MTX組和YXBH組大鼠腸道菌群在屬水平上最大豐度排名前35的物種總豐度增加。根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣本中的豐度信息，從物種層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，如圖8C所示，與正常組相比，CIA組大鼠腸道菌群中Prevotellaceae_UCG-003、Parabacteroides、Bacteroides、Turicibacter、Anaerostipes等菌屬的相對豐度下降，Lachnospiraceae_ND3007_group、Alloprevotella、UCG-005等菌屬的相對豐度增加；

與CIA組相比，MTX、YXBL、YXBM、YXBH組大鼠腸道菌群中Parabacteroides、Bacteroides、Turicibacter、Anaerostipes等菌屬的相對豐度增加，Lachnospiraceae_ND3007_group、Alloprevotella、UCG-005等菌屬的相對豐度下降。如圖8D所示，在門水平，與正常組相比，CIA組Proteobacteria、Actinobacteriota、Deferribacterota、Cyanobacteria菌門的相對豐度減少，F(xiàn)irmicutes、Euryarchaeota、Desulfobacterota、Spirochaetota、Elusimicrobiota菌門的相對豐度增加；與CIA組相比，MTX組Euryarchaeota、Desulfobacterota、Spirochaetota菌門的相對豐度減少，Deferribacterota、Cyanobacteria菌門的相對豐度增加；YXBL組Elusimicrobiota菌門的相對豐度減少，Deferribacterota、Cyanobacteria菌門的相對豐度增加；YXBM組Actinobacteriota、Deferribacterota、Cyanobacteria、Desulfobacterota菌門的相對豐度增加；YXBH組Firmicutes、Euryarchaeota、Desulfobacterota、Spirochaetota、Elusimicrobiota菌門的相對豐度減少，Proteobacteria、Actinobacteriota、Cyanobacteria菌門的相對豐度增加。與正常組相比，如圖8F所示，各組共有ASVs個數(shù)為690，與正常組相比，CIA組大鼠腸道菌群ASVs個數(shù)減少，MTX、YXBM、YXBH組ASVs個數(shù)增加。

2.7.4物種差異性分析

基于ASV分析，通過T-test找出屬水平下組間具有顯著差異性的物種。如圖9所示，與正常組相比，CIA組大鼠腸道菌群中Alloprevotella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、UCG-005、Lachnospiraceae_ND3007_group、Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Monoglobus菌屬的相對豐度增加（Plt;0.05）；與CIA組相比，MTX組Muribaculaceae、Bacteroides、Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Turicibacter、Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度增加（Plt;0.05），UCG-005、Lachnospira菌屬的相對豐度減少（Plt;0.05）；YXBL組Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Monoglobus菌屬的相對豐度減少（Plt;0.05），Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度增加（Plt;0.05）；YXBM組Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度增加（Plt;0.05）、Erysipelotrichaceae_UCG-003菌屬的相對豐度減少（Plt;0.05）；YXBH組UCG-005、Monoglobus菌屬的相對豐度減少（Plt;0.05）。

3討論

RA是一種會導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥、軟骨損傷和骨破壞的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，膠原誘導(dǎo)的RA大鼠模型在組織病理學(xué)和免疫學(xué)方面具有與人類臨床RA相似的特征而被廣泛應(yīng)用于探索藥物對RA的作用以及作用機制［15］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠足爪出現(xiàn)畸形，足爪體積、踝周長明顯增大，踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎評分明顯升高，滑膜組織增生明顯，炎性細(xì)胞浸潤增多，脾臟組織中脾小體形態(tài)異常，白髓增生，與紅髓邊界模糊，結(jié)腸黏膜出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞輪廓不清晰，有壞死；瘀血痹片和陽性藥甲氨蝶呤可減輕RA大鼠足爪、踝關(guān)節(jié)腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎評分，減輕滑膜組織增生，減少炎性細(xì)胞浸潤，改善脾臟和結(jié)腸病理變化，有增加RA大鼠體重、降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的趨勢，其中瘀血痹片0.8 g·kg-1和1.6 g·kg-1給藥劑量效果較好。

RA發(fā)病機制復(fù)雜，腸道微生物群在維持人類健康中起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是另一個攜帶人體“第二個基因組”的“隱藏器官”［16］。腸道微生物群失調(diào)與RA發(fā)病機制之間的相互作用引起了越來越多研究者的興趣。糞便樣本由于獲取方便且被認(rèn)為代表了宿主的所有腸道微生物變化，其微生物分析已被用于各種研究來探索腸道微生物群失調(diào)與RA發(fā)病機制之間的關(guān)系［17］。本研究發(fā)現(xiàn)CIA組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及β多樣性發(fā)生了改變，α多樣性雖有變化，但不明顯，可能由于大鼠的個體差異，或是RA模型時間短的原因。同樣的SD大鼠，其供應(yīng)商不同，年齡不同，其遺傳背景和腸道菌群也會不一樣，有待進(jìn)一步研究。

Muribaculaceae、Bacteroides、Turicibacter、Phascolarctobacterium可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為結(jié)腸上皮提供能量以維持腸道屏障功能并具有抗炎作用［18-20］。Muribaculaceae抑制CD8+ T細(xì)胞激活，耐受免疫刺激，與炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β呈負(fù)相關(guān)［21］，TNF-α、IL-6和IL-1β的過量產(chǎn)生會誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)的促炎微環(huán)境，協(xié)同介導(dǎo)滑膜炎、軟骨和骨破壞［22］。有研究表明Alloprevotella與RA診斷指標(biāo)類風(fēng)濕因子或抗環(huán)瓜氨酸蛋白抗體水平呈正相關(guān)，提示Alloprevotella可能促進(jìn)RA的進(jìn)展［23］。Lachnospiraceae與RA高危人群自身抗體IgG和IgA發(fā)生交叉反應(yīng)，在抗瓜氨酸蛋白抗體陽性的人的糞便中其豐度增加［24］。Lachnospiraceae_NK4A136_group與促炎細(xì)胞因子含量、足掌腫脹和關(guān)節(jié)炎評分呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞分泌的抗炎細(xì)胞因子IL-10含量呈負(fù)相關(guān)［25］。Monoglobus的相對豐度隨類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的活動度增加而增加，與Th1和Th2細(xì)胞的絕對計數(shù)及細(xì)胞因子IL-10、IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的水平呈正相關(guān)［26］，這些細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞密切相關(guān)［4］。Fusicatenibacter與抑郁癥呈正相關(guān)，RA和重度抑郁癥（MDD）通常同時發(fā)生，RA患者中MDD的患病率為13%～42%，比一般人群的患病率高2-4倍［27-28］。UCG-005的豐度與促炎因子TNF-α、IL-6呈正相關(guān)［29］，TNF-α參與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制，IL-6可促進(jìn)TNF-α釋放，進(jìn)而加重關(guān)節(jié)炎［30］。DAS28評分高的RA患者IL-6水平明顯升高［21］。Parabacteroides具有抗炎作用，可降低TNF-α 和IL-17A的水平［31］。IL-6促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，抑制Treg細(xì)胞的分化，破壞Th17/Treg細(xì)胞比例的平衡，促進(jìn)RA的進(jìn)展［32］。研究表明瘀血痹片可降低促炎因子TNF-α、IL-6的水平［7］，甲氨蝶呤可降低Th17細(xì)胞、IL-1β、IL-17A的水平，增加Treg細(xì)胞、IL-10、TGF-β1的水平［33］。二十五味驢血丸可以通過抑制MMPs的產(chǎn)生和破骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)腸道菌群（如降低Erysipelotrichaceae_UCG-003菌屬的相對豐度）和宿主代謝物來改善RA的關(guān)節(jié)損傷［34］。Jia等［35］研究發(fā)現(xiàn)Prevotellaceae_UCG-003與Th17相關(guān)細(xì)胞因子和Th17/Treg比值成負(fù)相關(guān)，與Treg相關(guān)細(xì)胞因子成正相關(guān)，暗示了其與免疫調(diào)控相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)RA模型大鼠腸道菌群中Alloprevotella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、UCG-005、Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Monoglobus菌屬的相對豐度增加，與文獻(xiàn)報道相符［22-23，36］。瘀血痹片可降低Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Monoglobus和UCG-005菌屬的相對豐度，增加Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度，與其他藥物調(diào)控腸道菌群的結(jié)果一致［26，34-35，37］。甲氨蝶呤可增加Muribaculaceae、Bacteroides、Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Turicibacter、Prevotellaceae_UCG-003菌屬的相對豐度，減少UCG-005、Lachnospira菌屬的相對豐度。但Yu［38］和Coradduzza等［39］研究表明Fusicatenibacter在RA患者腸道菌群中的豐度減少，而在健康人以及RA恢復(fù)較好的患者腸道菌群中的豐度較大。Fusicatenibacter還可誘導(dǎo)腸黏膜分泌IL-10發(fā)揮抗炎作用，其豐度與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生呈正相關(guān)［40］。有研究發(fā)現(xiàn)Prevotellaceae_UCG-003與TNF-α成正相關(guān)，參與慢性炎癥［21］。Fusicatenibacter和Prevotellaceae_UCG-003菌屬對RA的發(fā)生及進(jìn)展的影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上，腸道微生物群和宿主之間存在著一種復(fù)雜而微妙的動態(tài)平衡，瘀血痹片可調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，腸道菌群可能進(jìn)而作用于腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，調(diào)控免疫系統(tǒng)，恢復(fù)促炎因子與抗炎因子之間的平衡，改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，為臨床上類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供一個新的策略。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2023-05-23

基金項目：企業(yè)橫向：瘀血痹片產(chǎn)品工藝技術(shù)提升-基于腸道菌群研究瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制（012）遼寧省橫向課題項目（2022-012）

作者簡介：邵平（1984—），男，高級工程師，從事中藥新藥開發(fā)、中成藥工程技術(shù)研究、中藥大品種二次開發(fā)等方面的研究。

*通信作者：胡相卡（1989—），女，實驗師，從事中藥藥效學(xué)及質(zhì)量評價研究，e-mail：hxk89111@163.com。

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2024.22.011

文章編號：1007-7383（2024）03-0358-11

基于腸道菌群研究瘀血痹片對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用