◎ 李 晗，楊保侖，孫墨可，馬飛躍，邵 超

（吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 白城 137000）

燕麥，作為禾本科燕麥屬（Avena）的一種多樣化植物，已廣泛分布于世界各地[1]。燕麥的多個(gè)品種，包括皮燕麥和裸燕麥，呈現(xiàn)出豐富的生態(tài)適應(yīng)性，使其在不同氣候和土壤條件下都能茁壯生長(zhǎng)。除了其廣泛的種植范圍外，燕麥還因其卓越的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受矚目。已有研究表明，燕麥β-葡聚糖可以降低血清膽固醇、血糖和血壓水平，有望預(yù)防一系列慢性疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和冠心病[2]?；诖?，本文將介紹燕麥中β-葡聚糖的檢測(cè)方法，以供參考。

1 相關(guān)介紹

1.1 原理介紹

燕麥中的β-葡聚糖是一種多糖化合物，由葡萄糖分子通過(guò)1，3-β 鍵和1，4-β 鍵的特定排列而組成[3]。本研究介紹了一種基于酶解和比色法的分析方法，以測(cè)定燕麥中β-葡聚糖的含量。這種方法的原理在于地衣酶（Lichenase）和β-葡聚糖苷酶（β-Glucosidase）的協(xié)同作用，通過(guò)一系列精確的生物化學(xué)反應(yīng)步驟，將復(fù)雜的β-葡聚糖分解為可測(cè)量的產(chǎn)物[4]。①將待測(cè)樣品懸浮在pH 6.5 的緩沖溶液中，創(chuàng)造一個(gè)適宜酶反應(yīng)的環(huán)境。通過(guò)地衣酶的作用，β-葡聚糖鏈被逐漸降解，形成較小的β-葡聚糖分子，利用β-葡聚糖苷酶將較小的β-葡聚糖分子轉(zhuǎn)化為D－葡萄糖。②引入GOPOD 試劑緩沖液與D－葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，生成可測(cè)量的昆亞胺染料。昆亞胺染料具有明顯的吸光特性，其吸光度可以通過(guò)光譜儀器準(zhǔn)確測(cè)定。③根據(jù)昆亞胺染料的吸光度值，精確測(cè)定樣品中β-葡聚糖的含量[5]。

1.2 器械介紹

器械所使用的酶標(biāo)儀型號(hào)為Multiskan GO，由賽默飛（美國(guó)）生產(chǎn)。Multiskan GO 酶標(biāo)儀是該領(lǐng)域內(nèi)的先進(jìn)儀器，具有高精度光學(xué)系統(tǒng)、支持吸光度測(cè)量、熒光測(cè)量和發(fā)光測(cè)量等多種測(cè)量模式、儀器具有直觀的用戶界面，易于操作和設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)以及支持同時(shí)處理多個(gè)樣品。

酶標(biāo)板選用康寧（美國(guó)）生產(chǎn)的酶標(biāo)板。在目標(biāo)波長(zhǎng)下，孔間差異小于0.002，以確保數(shù)據(jù)的精確性和可重復(fù)性。其余儀器信息如表1 所示。

表1 儀器信息表

1.3 試劑介紹

本方法選擇了一系列關(guān)鍵試劑，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。表2 為本研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑的相關(guān)信息。

表2 試劑列表

2 檢測(cè)步驟

2.1 收樣

在燕麥β-葡聚糖的檢測(cè)方法研究中，樣品的收集和處理，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中至關(guān)重要的一環(huán)。①要從可靠的供應(yīng)商或燕麥生產(chǎn)基地獲得樣品，確保樣品的來(lái)源可追溯，且沒(méi)有受到不適當(dāng)?shù)奶幚砘蛭廴荆x擇的燕麥樣品應(yīng)符合研究目標(biāo)。②確定所需的燕麥樣品數(shù)量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析的要求，樣品數(shù)量應(yīng)足夠大，以便進(jìn)行多次分析，從而獲得可靠的平均結(jié)果。同時(shí)，還要考慮到可能需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的因素，因此應(yīng)多準(zhǔn)備部分樣品。

2.2 粉碎過(guò)篩

在進(jìn)行分析之前，必須對(duì)燕麥樣品進(jìn)行樣品研磨，以獲得均勻的粉末狀物料。①研磨的過(guò)程應(yīng)該在低溫條件下進(jìn)行，以避免熱敏感性的β-葡聚糖分子降解。同時(shí)，燕麥樣品顆粒應(yīng)當(dāng)達(dá)到所需的細(xì)度，以確保后續(xù)的化學(xué)反應(yīng)能夠均勻進(jìn)行。②對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，以便追蹤和管理。標(biāo)識(shí)信息應(yīng)包括樣品來(lái)源、采集日期、樣品編號(hào)等。③燕麥樣品應(yīng)儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，通常在－20 ℃以下，冷藏有助于保持樣品的穩(wěn)定性，防止微生物污染，延長(zhǎng)樣品的保質(zhì)期。此外，存儲(chǔ)容器應(yīng)具有良好的密封性，以防止空氣和濕氣的進(jìn)入，從而影響樣品的質(zhì)量。

2.3 樣品前處理

在燕麥β-葡聚糖的檢測(cè)方法研究中，樣品前處理是為了從燕麥樣品中提取β-葡聚糖，并為后續(xù)的定量分析做好準(zhǔn)備的關(guān)鍵步驟。

（1）從事先準(zhǔn)備好的燕麥樣品中精確稱取100 mg 的質(zhì)量，并將其置于15 mL 的試管中。這一步有助于確定分析的起始樣品質(zhì)量，以確保后續(xù)步驟中使用的樣品量是已知的。

（2）向試管中加入4 mL 的80%乙醇，然后將試管置于70 ℃的恒溫水浴中孵育2 h。乙醇的加入有助于燕麥中β-葡聚糖的提取，溫度的控制可確保反應(yīng)的正常進(jìn)行。期間，使用渦旋混勻來(lái)確保充分的反應(yīng)和溶解。

（3）完成乙醇提取后，通過(guò)高速離心將固體顆粒和乙醇分離，以獲取上清液，其中便含有提取的β-葡聚糖。乙醇提取需要重復(fù)3 次，以確保充分提取β-葡聚糖，提高分析的靈敏度。

（4）將上清液小心倒出，確保不丟失任何β-葡聚糖。接著，將樣品中的殘余物質(zhì)與50%乙醇混合，然后再加入磷酸緩沖液，以清洗和準(zhǔn)備樣品，確保在后續(xù)反應(yīng)中獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

（5）地衣酶酶解反應(yīng)將β-葡聚糖鏈被地衣酶酶解，分解為較小的β-葡聚糖單體。地衣酶選擇性地切割β-葡聚糖鏈中的1，4-β 鍵。酶解反應(yīng)需要在沸水浴中孵育3 min，然后在50 ℃的水浴鍋中孵育5 min，其間需間斷地渦旋混勻。地衣酶的加入會(huì)停止酶解反應(yīng)，確保不再發(fā)生新的酶解。

為了進(jìn)一步處理樣品，取上清液0.05 mL 并加入β-葡聚糖苷酶，繼續(xù)在50 ℃下孵育10 min。隨后，加入GOPOG 試劑，繼續(xù)在50 ℃下孵育20 min，形成昆亞胺染料，以進(jìn)行后續(xù)的吸光度測(cè)定。

3 定量分析

3.1 定量分析原理

在燕麥β-葡聚糖的檢測(cè)方法研究中，定量分析的原理是基于光譜學(xué)原理，利用物質(zhì)對(duì)特異性波長(zhǎng)的吸收峰測(cè)定目標(biāo)化合物的含量。在定量分析的過(guò)程中，可以遇到2種類型的目標(biāo)物：直接目標(biāo)物和間接目標(biāo)物。

（1）直接目標(biāo)物本身具有特定的吸收峰，其分析原理相對(duì)直接而簡(jiǎn)單。在燕麥β-葡聚糖檢測(cè)中，β-葡聚糖是直接目標(biāo)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成使其在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有吸收峰。分析過(guò)程中，樣品中的β-葡聚糖會(huì)與適當(dāng)?shù)脑噭┗蚍磻?yīng)條件產(chǎn)生特定的吸收峰。通過(guò)測(cè)量這一吸收峰的強(qiáng)度或光密度，可以反映β-葡聚糖的含量。該過(guò)程借助光譜學(xué)儀器如分光光度計(jì)進(jìn)行，測(cè)定目標(biāo)波長(zhǎng)下的吸光度。

（2）與直接目標(biāo)物不同，間接目標(biāo)物的分析需要通過(guò)化學(xué)或物理反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生特定的吸收峰，然后通過(guò)吸收峰的強(qiáng)度定量目標(biāo)化合物的含量。在燕麥β-葡聚糖檢測(cè)方法中，可能存在一些間接目標(biāo)物，需要進(jìn)行反應(yīng)以生成特定吸收峰，并通過(guò)光譜學(xué)儀器進(jìn)行定量分析。例如，在前述的燕麥β-葡聚糖檢測(cè)方法中，樣品在酶解、反應(yīng)和昆亞胺染料生成的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生特定的吸收峰。這些峰的強(qiáng)度與β-葡聚糖的含量相關(guān)聯(lián)。通過(guò)比較樣品的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)曲線，可以確定β-葡聚糖的含量。

3.2 定量結(jié)果計(jì)算

從燕麥樣品中精確稱取所需質(zhì)量的樣品，在康寧酶標(biāo)板中的不同孔中加入樣品、試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)孔用于容納一個(gè)樣品或一個(gè)控制，以確保實(shí)驗(yàn)的可比性。康寧酶標(biāo)板的高質(zhì)量保證了每個(gè)孔之間的吸光度差異極小，要求孔間差異小于0.002，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。最終的吸光度測(cè)定通過(guò)將樣品置于510 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值。這個(gè)波長(zhǎng)通常是與β-葡聚糖反應(yīng)生成昆亞胺染料的波長(zhǎng)，吸光度值反映了樣品中β-葡聚糖的含量。

樣品中β-葡聚糖含量可根據(jù)以下公式計(jì)算：

β-Glvcao cpoueou (%)=（ΔA×F×FV×0.9）/W

ΔA: Absorbance（reaction）read against the reagent blank

F=［100 (μg of D-glucose)］/（absorbance for 100 μg of glucose）

FV=Final volume

?A為A測(cè)定管-A對(duì)照管，測(cè)定管吸光度值減去對(duì)照管吸光度值；F為將吸光度值轉(zhuǎn)換為葡萄糖含量（μg）的因子；FV為最終體積，mL；0.9 為游離D－葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫水D－葡萄糖的換算因子；W為樣品質(zhì)量，g。

通過(guò)將實(shí)際測(cè)得的ΔA、已知的F、FV、0.9 和樣品的質(zhì)量W代入上述公式，就可以計(jì)算出樣品中β-葡聚糖的含量，以百分比表示。這個(gè)計(jì)算過(guò)程可確保研究者準(zhǔn)確地定量分析樣品中的β-葡聚糖含量，為科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供可靠的數(shù)據(jù)依據(jù)。