◎ 蔡桂珠，林岱濱，張敬鍇

（廣東億超生物科技有限公司，廣東 汕頭 515000）

目前，作為可以對人體產(chǎn)生治療或保健作用的維生素B12有氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺[1]。其中，甲鈷胺對神經(jīng)組織具有良好的傳遞性，可促進核酸－蛋白－脂肪的代謝，可修復(fù)損傷了的神經(jīng)組織，臨床上多用于糖尿病神經(jīng)障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎等周圍神經(jīng)疾病[2]。

當前，國內(nèi)的甲鈷胺片中甲鈷胺添加量大部分是0.5 mg/片，2020 版《中國藥典》也針對相應(yīng)的規(guī)格制定標準檢測方法[3]。

甲鈷胺在美國市場作為維生素B12缺乏癥的補充劑被廣泛使用[4-8]，國內(nèi)也有報道使用HPLC 方法測定類似添加級別的軟糖產(chǎn)品的含量測定方法[9]。因此，開發(fā)一個可用于產(chǎn)品中甲鈷胺低添加量的含量測定方法，對于國內(nèi)外貿(mào)出口膳食補充劑生產(chǎn)企業(yè)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有參考意義。

1 方法

1.1 儀器與試藥

QTRAP 4500 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（SCIEX）、多管式渦旋混合器；甲鈷胺對照品（93.9%）（中國食品藥品檢定研究院），批號：100692- 202006；乙腈（HPLC 級）（美國默克），含量≥99.90%；甲酸（HPLC 級）（美國默克），含量≥99.90%。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50 mm（1.7 μm），序列號：04223208 115169；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（見表1）；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

表1 梯度洗脫條件表

1.3 質(zhì)譜條件

離子源模式：ESI，正模式，MRM；IS：5500；TEM：500；GAS1: 50；GAS2：60；離子對信息見表2。

表2 離子對信息表

1.4 供試品溶液制備

稱取1.0 g 含有甲鈷胺的軟糖于50 mL 具塞塑料離心管中，加水至20 mL，密塞置于多管式渦旋混合器，2 500 rpm 渦旋10 min。然后置于高速離心機，10 000 rpm 離心2 min。上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液。

1.5 標準曲線制備

準確稱取適量甲鈷胺標準品加水溶解定容，配制成濃度為0.1 mg·mL-1的甲鈷胺標準儲備溶液，棕色瓶保存。分別吸取一定體積的甲鈷胺標準儲備溶液，加水稀釋，制備一系列標準溶液，標準工作曲線溶液濃度為10、20、100、200、1 000 ng·mL-1，按上述色譜條件，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，以濃度為橫坐標，以測得峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.6 測定方法

將供試品溶液按上述色譜條件進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，采用外標法通過上述標準曲線計算其濃度。

2 方法學(xué)驗證

照ICH Q2(R1)Validation of Analytical Procedures:Text and Methodology 開展方法學(xué)驗證活動。

2.1 專屬性

取甲鈷胺軟糖陰性樣品，依上述方法制備處理、檢測，測定圖譜如下所示。由圖1、圖2 可知，不存在干擾情況。因此，該色譜－質(zhì)譜條件可行。

圖1 對照品圖譜圖

圖2 甲鈷胺陰性樣品圖譜圖

2.2 線性范圍與檢測限、定量限

配制甲鈷胺濃度為10、20、100、200、1 000 ng·mL-1的曲線，擬合獲得回歸方程為y=76.461x-768.11，R2=0.999 8，表示在10～1 000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，有良好線性。

分別取甲鈷胺軟糖陰性樣品加標，信噪比法測定，結(jié)果顯示溶液濃度為10.91 ng·mL-1時，信噪比為13.31，即在供試品稱樣量為1 g，稀釋倍數(shù)為50 mL 時，測得甲鈷胺檢出限約為0.2 μg·kg-1，定量限約為0.5 μg·kg-1。

2.3 精密度與準確度

取甲鈷胺軟糖陰性樣品，分別加入一定量的甲鈷胺標準品溶液，依上述方法制備處理、檢測，使之成為理論濃度分別約為20、100、500 ng·mL-1的樣品，每個濃度平行操作3 份，照1.2 色譜條件、1.3 質(zhì)譜條件上機測定，計算各組樣品含量的RSD%（結(jié)果見表3）。

表3 測定甲鈷胺軟糖陰性樣品精密度和準確度表

試驗結(jié)果顯示，甲鈷胺軟糖陰性樣品3 個濃度水平加標準確度分別為1.7%、1.3%、1.2%，3 個濃度水平加標回收率在85.8%～98.9%，均達到可接受標準。

3 結(jié)語

實驗結(jié)果顯示，該方法在10～1 000 ng·mL-1有良好線性；在小于0.1 mg·kg-1的添加級別，精密度RSD 為1.2%～1.7%，符合RSD ≤5% 的要求；在小于0.1 mg·kg-1的添加級別，加標回收率為85.8%～98.9%，符合60%～120%的要求[10]。因此，該方法可為軟糖中較低含量的甲鈷胺測定提供參考依據(jù)。