◎ 梁 輝

（海南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，海南 海口 570203）

糧食安全關(guān)系國計民生，糧食作物的品質(zhì)和安全是保障糧食安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。作為真菌類微生物的有害代謝產(chǎn)物，真菌類毒素是糧食作物中常見的一類有害物質(zhì)，嚴重威脅著人類和動物健康[2]。因此，對糧食作物中真菌類毒素的準確測定顯得尤為重要。

液相色譜法是一種基于液體為流動相的色譜技術(shù)，具有高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點。在毒素測定領(lǐng)域，液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于多種毒素的分析，如真菌類毒素、有機磷農(nóng)藥、重金屬等[3]。真菌類毒素是一類由真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是糧食作物中最常見的3 種真菌毒素[4-5]。本研究利用液相色譜串聯(lián)紫外和熒光檢測器，對3 種真菌類毒素進行檢測，旨在為糧食產(chǎn)品的檢驗檢測提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290 型高效液相色譜儀（配制熒光檢測器和紫外檢測器）；JOANLAB 軌道式振蕩器；SHZ-D (Ⅲ)型循環(huán)水真空泵；MS204S 型電子天平；Milli Q 超純水器；TG18G-Ⅱ型高速離心機；黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液購自國家標準物質(zhì)平臺；水為超純水；乙腈購自默克股份兩合公司。

1.2 樣品來源

在市場上購買所需糧食樣品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

稱取50.0 g 粉碎后糧食樣品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，加入80% 乙腈100 mL，振蕩提取30 min（300 r·min-1）；取濾液50 mL 置離心管中（5 000 r·min-1），離心5 min。取濾液10 mL，加水40 mL，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，備用。

取20.0 mL 上述提取濾液，以1.5～2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱。以10 mL 水淋洗柱子2 次，棄去全部流出液，并使部分空氣通過柱體。準確加入1.0 mL 乙腈洗脫，流速控制為1～2 mL·min-1，收集全部洗脫液于樣品瓶中，氮氣吹干。用20% 乙腈溶解混勻后，過0.22 μm 濾膜，待液相色譜測定。

1.3.2 標準溶液的配置

精密量取黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液適量，用色譜純乙腈稀釋制成含各標準品100 μg·mL-1的混合標準品溶液。

1.3.3 主要儀器參數(shù)

色譜條件：色譜柱選擇Diamonsil C18，250 ×4.6 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；VWD 檢測器波長為220 nm；熒光檢測器激發(fā)波長305 nm，發(fā)射波長460 nm；流動相：乙腈和0.1% 乙酸溶液。洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序表

1.3.4 標準曲線的繪制

分別用刻度管移取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.00 mL 混合標準品溶液于20 mL 的容量瓶中，分別用乙腈溶液定容，得到一系列不同濃度的標準溶液。濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg·mL-1的標準曲線系列溶液。分別精密量取各標準曲線系列溶液各20 μL，在擬定的液相色譜條件下進樣分析，記錄峰面積。以真菌毒素的濃度為橫坐標，以其峰面積為縱坐標進行線性回歸，獲得標準曲線。

1.3.5 檢測限與定量限

取混合標準品溶液擬定的色譜條件下進行分析，根據(jù)分析結(jié)果逐級稀釋樣品濃度，分別測定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。

1.3.6 加標回收率測定

稱取50.0 g 粉碎后糧食樣品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，分別加入混合標準品溶液。照“1.3.1”進行樣品處理，并將制備好的樣品進行液相色譜測定。

1.3.7 樣品的重復性的測定

照“1.3.1”項下方法，處理樣品并測定糧食樣品中的黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線、檢測限和定量限的測定結(jié)果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定結(jié)果見表2。在擬定的色譜條件下，黃曲霉毒素B1在1.01～50.30 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=12 139x-2 703.2，R2=0.999 8；玉米赤霉烯酮在1.02～50.75 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=495.28x-85.947，R2=0.999 9；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在1.02～51.15 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=26.292x+10.985，R2=0.998 4。

表2 標準曲線數(shù)據(jù)表

2.2 樣品的加標回收率測定結(jié)果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標回收率結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，本方法測定各添加劑的加標回收率在97.02%～101.95% 范圍內(nèi)，測定結(jié)果的RSD 值均小于5%。因此，用本方法測定糧食樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇準確度良好。

表3 糧食樣品的加標回收率測定結(jié)果表

2.3 樣品的重復性測定結(jié)果

采用本方法，對“1.3.8”中加標回收率樣品連續(xù)測定6 次，測定結(jié)果見表4。

表4 樣品的重復性測定結(jié)果表

從表4的測定結(jié)果看出，對同一樣品連續(xù)測定6次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定結(jié)果的RSD 分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%。因此，本方法測定樣品的重復性良好。

3 結(jié)語

本研究建立了一種同時測定糧食作物中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜方法。通過對定量分析方法的驗證，得到以下結(jié)論：①所測定的3 種真菌毒素類化合物的線性關(guān)系良好，R2均大于0.990。②3 種真菌毒素中，檢測限濃度最高為0.31 μg·mL-1，定量限濃度最高為0.93 μg·mL-1，表明該方法靈敏度較高。③本方法測定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標回收率為97.02%～101.95%，測定結(jié)果的RSD 值均小于5%。④對同一樣品連續(xù)測定6 次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定結(jié)果的RSD 分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%，表明該方法測定樣品的重復性良好。綜上所述，本研究結(jié)果能夠為糧食產(chǎn)品提供更好的安全保障，對于糧食作物中真菌類毒素的檢測和控制具有重要意義。