嚴(yán)春榮，魏建強(qiáng)，張海瑞，黃子玉，孫夢(mèng)凡，劉祥義，侯 英**

(1.玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 玉溪 653100；2.云南華衡檢測(cè)技術(shù)有限公司，云南 昆明 650106；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

天麻(Gastrodia elata Blume)是名貴中藥材之一，隸屬蘭科天麻屬多年寄生草本植物，以干燥塊莖入藥，作為藥膳，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通路等藥理功效及保健、營養(yǎng)和食用價(jià)值[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天麻具有腦保護(hù)、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、抗暈眩、降壓、降血脂、保肝、增強(qiáng)免疫力等藥理活性[2-3]。游離氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，是構(gòu)成人體的最基本物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)人體氮平衡，增強(qiáng)免疫力和健體補(bǔ)虛的功效[4-5]。作為藥食同源的新食品原料，天麻中的游離氨基酸的含量能反映出天麻的營養(yǎng)價(jià)值。目前對(duì)天麻中游離氨基酸的相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)其開展分析評(píng)價(jià)研究，可以為天麻的營養(yǎng)與質(zhì)量評(píng)價(jià)及進(jìn)一步開發(fā)利用天麻資源提供理論基礎(chǔ)。

采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量已有報(bào)道[6-8]，但因儀器價(jià)格昂貴，所以采用柱前/柱后衍生結(jié)合液相色譜分析游離氨基酸含量，特別是柱前衍生化具有時(shí)間短、衍生物穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)受到研究者青睞[9]。殷嬌陽等[10]采用鄰苯二甲醛和9-氯甲酸芴甲酯聯(lián)用對(duì)靈芝孢子粉中的氨基酸進(jìn)行柱前衍生，然后采用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。楊衛(wèi)靈等[11]以異硫氰酸苯酯為柱前衍生劑，結(jié)合液相色譜法，測(cè)定黔產(chǎn)瑪咖氨基酸的組成及含量，發(fā)現(xiàn)瑪咖中氨基酸種類齊全且含量豐富。

本文將天麻中游離氨基酸經(jīng)6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯衍生化生成具有熒光的衍生物，經(jīng)超高效液相色譜(UPLC)分離，用保留時(shí)間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，建立天麻游離氨基酸含量的測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)區(qū)天麻中氨基酸含量進(jìn)行對(duì)比分析，可為天麻的品質(zhì)評(píng)價(jià)及種植基地選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

U3000高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器，美國熱電公司)；BSA224S電子天平(感量：0.1 mg，賽多利斯公司)；RD-C18色譜柱(Ф4.6 mm×250 mm，3 μm，中譜紅)；KQ-500DE型超聲波萃取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。Ф13 mm×0.45 μm 微濾膜過濾器(天津騰達(dá)過濾器件廠)；Milli-Q 純水儀(美國Millipore公司)；HMS-350渦旋振蕩器(天津市恒美科技發(fā)展有限公司)；電熱恒溫干燥箱(旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司)；衍生化試劑：6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(CAS：148757-94-2，w≥97%，上海源純生物科技公司)。

19種標(biāo)準(zhǔn)品：γ-氨基丁酸(CAS：56-12-2)、L-丙氨酸(CAS：56-41-7)、L-苯丙氨酸(CAS：63-91-2)、L-蛋氨酸(CAS63-68-3)、L-脯氨酸(CAS：147-85-3)、甘氨酸(CAS：46-40-6)、L-胱氨酸(CAS：56-89-3)、L-谷氨酸(CAS：56-86-0)、L-谷氨酰胺(CAS：56-85-9)、L-精氨酸(CAS：74-79-3)、L-賴氨酸(CAS：56-87-1)、L-酪氨酸(CAS：60-18-4)、L-亮氨酸(CAS：61-90-5)、L-蘇氨酸(CAS：72-19-5)、L-絲氨酸(CAS：56-45-1)、L-天冬氨酸(CAS：56-84-8)、L-天冬酰酸(CAS：70-47-3)、L-纈氨酸(CAS：72-18-4)、L-異亮氨酸(CAS：73-32-5)、L-組氨酸(CAS：71-00-1) (質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，購自上海源純生物科技公司)。

9個(gè)批次天麻樣品采自云南、四川、貴州和陜西等地。其中，云南昭通(A1-A3)、云南其他州市(B4-B6)、省外(C7-C9)。樣品采集后用自來水洗凈塊莖部位，再用蒸餾水沖洗3次，隔水蒸透心，60 ℃ 烘箱干燥。粉碎后過60目篩，存放于自封袋中備用。

1.2 溶液的配制

1.2.1 流動(dòng)相A的配制

準(zhǔn)確稱取 190.4 g 無水乙酸鈉置于燒杯中，加入適量水，超聲溶解后，加入 100 mL 質(zhì)量濃度為 1 mg/mL EDTA(100 mg 溶解至 100 mL 水中)溶液，加入三乙胺 24.0 mL，轉(zhuǎn)入容量瓶中加水定容至 1000 mL，搖勻。用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.95，加入 0.1 g NaN3過濾，使用時(shí)量取 100 mL 定溶至 1000 mL，搖勻備用。

1.2.2 衍生化溶液的配制

稱取 0.3 g 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯于 100 mL 乙腈中，渦旋振蕩 30 s，55 ℃ 加熱 5 min 至6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯全部溶解，配制成 3 mg/mL 的衍生化試劑。

1.2.3 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取γ-氨基丁酸 13.16 mg、L-丙氨酸 11.31 mg、L-苯丙氨酸 20.60 mg、L-蛋氨酸 18.89 mg、L-脯氨酸 15.65 mg、甘氨酸 10.4 1mg、L-谷氨酸 18.92 mg、L-谷氨酰胺 18.24 mg、L-精氨酸 21.37 mg、L-賴氨酸 18.87 mg、L-酪氨酸 22.54 mg、L-亮氨酸 16.81 mg、L-蘇氨酸 15.17 mg、L-絲氨酸 13.62 mg、L-天冬氨酸 16.84 mg、L-天冬酰胺 16.68 mg、L-纈氨酸 15.03 mg、L-異亮氨酸 14.58 mg、L-組氨酸 20.52 mg 各于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別精密移取 1 mL 的19種游離氨基酸儲(chǔ)備液于 25 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1；精密移取 8 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2；精密移取 5 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2；10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液3；精密移取 5 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液3，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液4；精密移取 5 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液4，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5；精密移取 5 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液6。

1.3 色譜條件

熒光檢測(cè)器激發(fā)波長 250 nm，發(fā)射波長 395 nm，PMT增益值為1；柱溫 40 ℃。流動(dòng)相流速為 1 mL/min；進(jìn)樣量為 2 μL；梯度洗脫條件見表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.4 樣品測(cè)定方法

稱取 0.2 g 制備好的樣品于 10 mL 具塞離心管中，加入 10 mL 的 0.1 moL/L 的鹽酸溶液，超聲萃取 30 min，取上層清液過 0.45 μm 濾膜，備用。

移取衍生用緩沖液 70 μL 于潔凈的玻璃內(nèi)插管中，移取樣品萃取液或標(biāo)準(zhǔn)工作液 10 μL 迅速渦旋混勻，然后加入衍生化試劑 20 μL，渦旋混勻 10 s，加蓋密封于進(jìn)樣瓶中，室溫靜置 1 min，轉(zhuǎn)移至 55 ℃ 烘箱中，加熱 10 min，取出進(jìn)行HPLC測(cè)定。用色譜工作站記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算游離氨基酸的含量。每份樣品重復(fù)檢測(cè)2次，取平均值為該樣品中游離氨基酸的含量。天麻樣品中19種游離氨基酸的色譜圖見圖1，色譜峰分離良好。

圖1 天麻樣品中19種游離氨基酸測(cè)定的色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

配制一系列不同質(zhì)量濃度的游離氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見表2)，各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)在0.9969～0.9997范圍，表明19種游離氨基酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。通過測(cè)定各游離氨基酸信噪比為3∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，計(jì)算各游離氨基酸的檢出限在1.41～75.42 μg/kg 范圍。

表2 天麻中游離氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2 重現(xiàn)性考察

稱取6份混合標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.4樣品測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.32 %～1.67 %之間，能夠滿足樣品分析的精密度要求。

2.3 加標(biāo)回收率

稱取相同的樣品6份，其中3份中分別加入一定質(zhì)量濃度的游離氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，3份作為對(duì)照，按“1.4樣品測(cè)定方法”進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率在91.99 %～114.59%之間，表明用該方法測(cè)定天麻中游離氨基酸具有較高的回收率，適用于天麻中游離氨基酸的定量測(cè)定。

2.4 不同產(chǎn)區(qū)天麻樣品游離氨基酸含量分析

不同產(chǎn)區(qū)的天麻樣品中游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果見表3。從來自不同產(chǎn)區(qū)的天麻樣品中檢測(cè)出7種人體必需游離氨基酸(纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)，10種人體非必需游離氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸)及2種其它游離氨基酸(天冬酰胺和γ-氨基丁酸)。結(jié)果表明，天麻中游離氨基酸種類及含量豐富，與其具有滋補(bǔ)功效相符。從測(cè)定數(shù)據(jù)看出，不同產(chǎn)地天麻中的游離氨基酸含量存在一定差異，天麻中19種游離氨基酸總量的平均值為 404.46 mg/100 g，總量范圍在362.12～644.95 mg/100 g 之間。19種游離氨基酸中含量較高的是谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等，含量較低的是蛋氨酸、氨基丁酸、組氨酸、亮氨酸和脯氨酸等。

表3 不同地區(qū)天麻樣品游離氨基酸平均含量測(cè)定結(jié)果 (n=2，mg/100 g)

從表3看出，天麻中19種游離氨基酸總量平均值是云南昭通天麻(517.41 mg/100 g)>省外天麻(507.68 mg/100 g)>云南省內(nèi)其他地州(444.56 mg/100 g)。云南昭通天麻中的天冬酰胺、天冬氨酸和精氨酸的含量高于其他產(chǎn)區(qū)；而省外天麻中的谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等含量高于云南省各產(chǎn)區(qū)，特別是在一個(gè)省外天麻樣品中測(cè)定出蛋氨酸，而其他產(chǎn)區(qū)的天麻樣品中未檢出。

3 結(jié)論

本文通過6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯為衍生化試劑，結(jié)合HPLC法建立天麻中19種游離氨基酸的測(cè)定方法。該方法具有精密度好、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，適宜于天麻中多種游離氨基酸的含量測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，天麻中游離氨基酸種類及含量豐富，不同產(chǎn)地的天麻中游離氨基酸含量存在一定差異。天麻作為我國重要的藥食同源藥材，游離氨基酸為其滋補(bǔ)作用的主要成分之一，對(duì)其研究有助于為天麻的品質(zhì)評(píng)價(jià)及種植基地選擇提供科學(xué)依據(jù)。