成玉潔，劉貞汝，譚志同，沈亞龍，王守信，盛 筱

(濟寧醫(yī)學院 藥學院，山東 日照 276826)

酪氨酸酶(tyrosinase，Tyr，EC 1.14.18.1)又稱為多酚氧化酶，是一種含有多亞基結構的含銅金屬氧化酶，主要存在于動物、植物、微生物和人體中，具有重要的生理功能[1]。在哺乳動物中，Tyr是參與黑色素生物合成的關鍵酶，Tyr的過度表達會導致雀斑、褐斑等色素沉著性疾病的發(fā)生，嚴重者可能會導致惡性黑色素瘤[2]。而當Tyr的活性降低，又會造成黑色素的缺失，引起白癜風、白化病等疾病[3]。此外，Tyr還與昆蟲的蛻皮、傷口愈合以及水果蔬菜的酶促褐變直接相關[4-5]。因此，開發(fā)高效、低毒的 Tyr抑制劑和激活劑在化妝品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域備受關注，已成為當今研究的熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞在正常代謝過程中會產生自由基[6]，而當自由基濃度過高時會攻擊生物體內的生物大分子，損害機體的組織和細胞，加快人體衰老，并會誘發(fā)心血管疾病、冠心病及癌癥等[7]?？寡趸瘎┛梢郧宄羧梭w內多余的自由基，從而起到預防衰老和疾病發(fā)生的作用。所以，設計合成高活性的抗氧化劑一直是醫(yī)藥、食品、保健等領域的熱門課題。

酚類化合物往往具有較好的Tyr抑制活性和抗氧化活性，其在Tyr抑制劑和抗氧化劑的研發(fā)中一直備受關注[8]。此外，酰腙類化合物因具有多樣的藥理活性，在藥物研發(fā)中占有重要地位。研究發(fā)現(xiàn)，相比普通的Schiff堿，酰腙類Schiff堿具有穩(wěn)定性更高、生物活性更好、化學毒性更低、更容易被生物降解等優(yōu)點[9]?；诖耍狙芯繑M將兩個苯酚結構通過酰腙活性片段進行拼接，設計合成一系列含酚結構的酰腙類化合物，并初步測試它們對Tyr的抑制活性及抗氧化活性，為開發(fā)更多類型的酚類Tyr抑制劑與抗氧化劑提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

DNM-9602G酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司)；Bruker Avance NEO 400 MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、各種羥基取代苯甲醛(分析純，上海薩恩化學技術有限公司)；各種羥基取代苯甲酸甲酯、抗壞血酸、曲酸(分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司)；水合肼、L-多巴、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)、過硫酸鉀(分析純，天津希恩思生化科技有限公司)；酪氨酸酶(合肥巴斯夫生物科技有限公司)，其余試劑均為市售分析純。

1.2 合成路線

本文共合成16種含酚酰腙類化合物，合成步驟如圖1所示。

圖1 化合物D1-D16的合成路線

1.2.1 中間體B1～B4的合成

取 100 mL 圓底燒瓶，將 3 mmoL 取代苯甲酸甲酯(A1-A4)和 0.5 mL 80%水合肼溶于 10 mL 甲醇中，在 80 ℃ 下加熱回流，TLC監(jiān)測反應完全后，室溫下靜置或放冰箱中冷凍，析出大量固體。抽濾后用冷的甲醇洗滌，室溫干燥后得到純的中間體羥基取代苯甲酰肼B1-B4。

1.2.2 目標化合物D1-D16的合成

將 0.89 mmol 羥基取代苯甲酰肼(B1-B4)、1.30 mmol 羥基取代苯甲醛(C1-C4)、10 mL 甲醇置于 100 mL 圓底燒瓶中，滴加兩滴醋酸，于 80 ℃ 的油浴中加熱回流，TLC監(jiān)測反應完全。冷卻后將反應液置于冰箱中冷凍過夜，然后抽濾，用冷的甲醇洗滌，室溫干燥后得純的目標化合物。如若反應液冷凍后無固體析出或析出固體較少，可旋干反應液后，將粗產物用甲醇/水重結晶，則得到純的目標化合物。

4-羥基-N′-(4-羥基苯亞甲基)苯甲酰肼(D1)，淺黃色固體，收率88%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.47(s，1H)，10.12(s，1H)，9.92(s，1H)，8.33(s，1H)，7.80(d，2H，J=8.0 Hz)，7.54(d，2H，J=8.0 Hz)，6.82～6.87(m，4H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.58，160.56，159.27，147.26，129.57，128.72，125.51，124.08，115.71，114.99。

N′-(2，4-二羥基苯亞甲基)-4-羥基苯甲酰肼(D2)，黃色固體，收率63%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.73(s，1H)，11.61(s，1H)，10.14(s，1H)，9.93(s，1H)，8.47(s，1H)，7.81(d，2H，J=8.4 Hz)，7.27(d，1H，J=8.4 Hz)，6.87(d，2H，J=8.5 Hz)，6.32～6.37(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.31，160.87，160.64，159.59，148.63，131.49，129.71，123.53，115.21，110.73，107.72，102.81。

N′-(3，4-二羥基苯亞甲基)-4-羥基苯甲酰肼(D3)，褐色固體，收率80%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.40(s，1H)，10.08(s，1H)，9.34(s，1H)，9.26(s，1H)，8.24(s，1H)，7.79(d，2H，J=8.7 Hz)，7.24(s，1H)，6.91(d，1H，J=7.7 Hz)，6.85(d，2H，J=8.6 Hz)，6.78(d，1H，J=8.1 Hz)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.62，160.62，147.89，147.54，145.82，129.65，126.10，124.26，120.51，115.68，115.09，112.74。

N′-(3，5-二羥基苯亞甲基)-4-羥基苯甲酰肼(D4)，褐色固體，收率92%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.55(s，1H)，10.16(s，1H)，9.47(s，2H)，8.23(s，1H)，7.80(d，2H，J=12.0 Hz)，6.86(d，2H，J=8.0 Hz)，6.59(s，2H)，6.26(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.72，160.70，158.71，147.27，136.22，129.68，123.91，115.06，105.12，104.34。

2，4-二羥基-N′-(4-羥基苯亞甲基)苯甲酰肼(D5)，黃色固體，收率93%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.49(s，1H)，11.56(s，1H)，10.24(s，1H)，9.98(s，1H)，8.34(s，1H)，7.81(d，1H，J=12.0 Hz)，7.56(d，2H，J=8.0 Hz)，6.84(d，2H，J=8.0 Hz)，6.36(d，1H，J=8.0 Hz)，6.32(d，1H，J=4.0 Hz)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.36，162.61，162.37，159.55，148.47，129.52，128.99，125.19，115.77，107.37，106.17，102.89。

N′-(2，4-二羥基苯亞甲基)-2，4-二羥基苯甲酰肼(D6)，淺黃色固體，收率76%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.34(s，1H)，11.78(s，1H)，11.42(s，1H)，10.26(s，1H)，10.00(s，1H)，8.53(s，1H)，7.80(d，1H，J=12.0 Hz)，7.31(d，1H，J=8.0 Hz)，6.35～6.39(m，2H)，6.33(s，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：164.95，162.77，162.31，160.83，159.52，149.33，131.35，129.55，110.54，107.77，107.51，105.86，102.89，102.69。

N′-(3，4-二羥基苯亞甲基)-2，4-二羥基苯甲酰肼(D7)，白色固體，收率92%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.50(s，1H)，11.49(s，1H)，10.22(s，1H)，9.43(s，1H)，9.31(s，1H)，8.25(s，1H)，7.79(d，1H，J=8.6 Hz)，7.25(s，1H)，6.96(d，1H，J=7.8 Hz)，6.80(d，1H，J=8.2 Hz)，6.37(dd，1H，J=1.9 Hz，J=8.7Hz)，6.32(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.46，162.69，162.51，148.81，148.23，145.87，129.57，125.77，120.89，115.74，112.89，107.47，106.30，103.01。

N′-(3，5-二羥基苯亞甲基)-2，4-二羥基苯甲酰肼(D8)，灰色固體，收率88%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.36(s，1H)，11.57(s，1H)，10.23(s，1H)，9.47(s，2H)，8.23(s，1H)，7.78(d，1H，J=8.6 Hz)，6.60(s，2H)，6.36(dd，1H，J=2.3 Hz，J=8.7 Hz)，6.31(d，1H，J=2.2 Hz)，6.26～6.28(m，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.57，162.83，162.41，158.85，148.54，136.03，129.81，107.60，105.44，104.74，103.02。

3，4-二羥基-N′-(4-羥基苯亞甲基)苯甲酰肼(D9)，黃色固體，收率90%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.38(s，1H)，9.88(s，1H)，9.58(s，1H)，9.21(s，1H)，8.31(s，1H)，7.52(d，2H，J=8.3 Hz)，7.34(s，1H)，7.27(dd，1H，J=1.9 Hz，J=8.2 Hz)，6.80～6.84(m，3H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.69，159.20，148.84，147.08，145.02，128.67，125.57，124.60，119.43，115.69，115.36，114.96。

N′-(2，4-二羥基苯亞甲基)-3，4-二羥基苯甲酰肼(D10)，淺褐色固體，收率55%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.67(s，2H)，9.58(s，3H)，8.46(s，1H)，7.36(s，1H)，7.30(d，1H，J=8.2 Hz)，7.25(d，1H，J=8.4 Hz)，6.83(d，1H，J=8.2 Hz)，6.31～6.37(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.48，160.61，159.60，149.25，148.60，145.23，131.55，124.00，119.66，115.43，115.19，110.75，107.72，102.82。

N′-(3，4 -二羥基苯亞甲基)-3，4-二羥基苯甲酰肼(D11)，褐色固體，收率69%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.32(s，1H)，9.29(s，4H)，8.22(s，1H)，9.23(s，2H)，8.21(s，1H)，7.34(d，1H，J=4.0 Hz，J=8.0 Hz)，7.27(dd，1H，J=4.0 Hz，J=8.0 Hz)，7.21(s，1H)，6.91(dd，1H，J=4.0 Hz)，6.76～6.82(m，2H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.60，148.78，147.70，147.25，145.67，144.97，126.02，124.63，120.31，119.37，115.54，115.31，114.93，112.60。

N′-(3，5-二羥基苯亞甲基)-3，4 -二羥基苯甲酰肼(D12)，深褐色固體，收率90%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.45(s，1H)，9.63(s，1H)，9.44(s，1H)，9.23(s，2H)，8.21(s，1H)，7.34(d，1H，J=4.0 Hz)，7.28(q，1H，J=12.0 Hz)，6.81(d，1H，J=8.0 Hz)，6.57(s，1H)，6.24～6.27(m，3H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.85，158.68，149.00，147.11，145.05，136.27，124.41，119.56，115.40，115.00，105.10，104.29。

3，5-二羥基-N′-(4 -羥基苯亞甲基)苯甲酰肼(D13)，棕色固體，收率86%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.47(s，1H)，9.90(s，1H)，9.54(s，2H)，8.31(s，1H)，7.53(d，2H，J=8.0 Hz)，6.83(d，2H，J=8.0 Hz)，6.73(s，2H)，6.41(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.07，159.32，158.35，147.80，135.72，128.77，125.41，115.68，105.69，105.44。

N′-(2，4-二羥基苯亞甲基)-3，5-二羥基苯甲酰肼(D14)，紅棕色固體，收率93%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.77(s，1H)，11.55(s，1H)，9.98(s，1H)，9.62(s，2H)，8.47(s，1H)，7.26(d，1H，J=8.4 Hz)，6.75(s，2H)，6.83(d，2H，J=8.0 Hz)，6.43(s，1H)，6.35(d，1H，J=8.5 Hz)，6.32(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.9，160.80，159.68，158.59，149.34，135.14，131.66，110.68，107.83，105.87，102.84。

N′-(3，4-二羥基苯亞甲基)-3，5-二羥基苯甲酰肼(D15)，褐色固體，收率89%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.42(s，1H)，9.54(s，2H)，9.36(s，1H)，9.26(s，1H)，8.22(s，1H)，7.21(d，1H，J=1.6 Hz)，6.89(dd，1H，J=1.7 Hz，J=8.1 Hz)，6.77(d，1H，J=8.1 Hz)，6.71(d，2H，J=2.0 Hz)，6.40(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.22，158.51，148.21，148.03，145.84，135.90，126.02，120.6，115.72，112.83，105.85，105.60。

N′-(3，5-二羥基苯亞甲基)-3，5-二羥基苯甲酰肼(D16)，褐色固體，收率67%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.54(s，1H)，9.57(s，2H)，9.44(s，2H)，8.21(s，1H)，6.72(s，2H)，6.57(s，2H)，6.41(s，1H)，6.26(s，1H)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：163.24，158.68，158.39，147.87，136.10，135.54，105.75，105.60，105.16，104.42。

1.3 化合物D1-D16與Tyr作用的實驗步驟

參照文獻[10]的方法并稍作調整。實驗中以L-多巴為底物，曲酸為陽性對照。具體測試步驟如下：DMSO溶解待測化合物得到 20 mmol/L 的儲備液，然后用pH=7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成所需濃度的溶液。反應在96 孔培養(yǎng)板中進行，總反應體系 300 μL。在測試體系中依次加入 111 μL PBS，6 μL Tyr，3 μL 待測樣品，混勻后加入 60 μL MBTH(5 mmol/L)溶液，120 μLL-多巴(2.5 mmol/L)溶液，充分混勻后室溫反應 10 min，然后往體系中加入 300 μL 乙腈終止反應；取 200 μL 混合溶液用酶標儀于 492 nm 波長下測量其吸光度，每次實驗重復測試三次。最后根據(jù)下列公式計算對Tyr的抑制率。

Tyr 抑制率=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

其中，A1為加入樣品和酶時混合液的吸光度；A2為加入樣品而未加酶時混合液的吸光度；A3為未加樣品加酶時混合液的吸光度；A4為未加樣品亦未加酶時混合液的吸光度。

1.4 清除ABTS自由基(ABTS+·)實驗

參照文獻[11]并稍作調整。在兩個 50 mL 容量瓶里分別用蒸餾水配制成 7 mmol/L 的ABTS溶液與 4.9 mmol/L 的K2S2O8溶液，然后將二者混合均勻，于室溫避光條件下儲存 12 h，得到ABTS+·儲備液。不斷用乙醇稀釋儲備液使其在 734 nm 處吸光度為0.70±0.02。移取 0.1 mL 不同濃度的樣品溶液和 1.9 mL 的ABTS+·溶液，使樣品終濃度在0.1～20 μmol/L 之間，混勻后避光反應 30 min。測定 734 nm 處的吸光度，以抗壞血酸作為陽性對照。

ABTS+·清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%

式中：A樣品為樣品反應后溶液的吸光度；A對照為樣品對照溶液的吸光度；A空白為空白的ABTS+·溶液的吸光度。

1.5 清除DPPH自由基(DPPH·)實驗

參照文獻[11]并稍作調整。在 50 mL 容量瓶里配制 0.2 mmol/L 的DPPH·溶液，避光保存。移取 0.1 mL 不同濃度的樣品溶液和 1.9 mL 的DPPH·溶液，使樣品終濃度在1～200 μmol/L 之間，混勻后避光反應 30 min。測定 517 nm 處的吸光度，以抗壞血酸作為陽性對照。

DPPH·的清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%

式中：A樣品為樣品反應后溶液的吸光度；A對照為樣品對照溶液的吸光度；A空白為空白的ABTS+·溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 目標化合物與Tyr的作用結果

化合物D1-D16對Tyr活性的測試結果見表1。

表1 目標化合物D1～D16對Tyr活性的抑制率

由表1可知，化合物D1-D16對Tyr表現(xiàn)出不同的作用效果?；衔顳3、D5、D7、D9、D11、D13與D16在不加L-多巴時，自身就能夠被Tyr氧化而與MBTH結合成粉紅色的產物，說明這些化合物本身就可以作為Tyr的底物。化合物D1、D8、D12和D15在濃度 20 μmol/L 和 200 μmol/L 時對Tyr均有一定的抑制效果，但在濃度 200 μmol/L 時它們的對Tyr的抑制率均明顯低于對照藥物曲酸，其中的化合物D12和D15在濃度 20 μmol/L 時具有優(yōu)于曲酸的Tyr抑制活性?；衔顳2和D6在濃度 20 μmol/L 對Tyr無作用，而在濃度 200 μmol/L 時對Tyr的抑制率分別為-25.6%與-17.4%，說明這兩個化合物在高濃度時對Tyr有一定的激活作用?；衔顳10和D13在低濃度(20 μmol/L)時對Tyr顯示與曲酸相當?shù)囊种菩Ч诟邼舛?200 μmol/L)時卻具有一定的Tyr激活活性。從構效關系上初步分析發(fā)現(xiàn)，當目標化合物結構中一個苯環(huán)上的間位和對位同時含有羥基時，因與L-多巴結構相似，大多可作為Tyr的底物；當目標化合物結構中一個苯環(huán)上的兩個間位同時含有羥基時，大多具有一定的Tyr抑制活性；當目標化合物結構中一個苯環(huán)上的鄰位和對位同時含有羥基時，大多對Tyr有一定的激活活性。

2.2 目標化合物清除ABTS+·和DPPH·的結果

化合物D1-D16清除ABTS+·和DPPH·的IC50值見表2。

表2 化合物D1-D16對ABTS+·和DPPH·的清除效

由表2可知，所有目標化合物均有具較好的清除ABTS+·的活性，IC50值均優(yōu)于對照藥物抗壞血酸，其中的化合物D7、D9、D10、D11、D12、D16的活性尤為突出，大約是對照藥物抗壞血酸活性的4.5～8倍。相比于ABTS+·，化合物D1-D16清除DPPH·的能力則表現(xiàn)出較大的差異，其中的化合物D3、D9、D10、D11、D12和D15具有優(yōu)異的清除DPPH·活性，IC50值明顯優(yōu)于抗壞血酸；化合物D2、D6、D7的活性與抗壞血酸相當；而化合物D1、D4、D5、D8、D13、D14與D16活性則相對較差。構效關系初步分析表明，當D1-D16的結構中含有單羥基取代的苯環(huán)時，清除ABTS+·和DPPH·的活性大多較差；當D1-D16結構中一個苯環(huán)上的間位和對位同時被羥基取代時，具有優(yōu)異的清除ABTS+·和DPPH·的活性；當D1-D16結構中一個苯環(huán)上的兩個間位同時被羥基取代時，大多具有較差的清除DPPH·的活性，而對清除ABTS+·活性影響不大。

3 結論

以羥基取代苯甲酸甲酯、水合肼，以及羥基取代苯甲醛為原料，通過肼解、縮合兩步反應，合成了16個含酚酰腙類化合物(D1-D16)，并初步測試了其與Tyr的作用以及清除ABTS+·和DPPH·的能力。結果表明，目標化合物D1-D16對Tyr表現(xiàn)出抑制和激活不同的作用效果，部分化合物自身可作為Tyr的底物。所有目標化合物均具有優(yōu)異的清除ABTS+·的活性，IC50均強于對照藥物抗壞血酸；部分化合物具有優(yōu)異的清除DPPH·的活性，明顯強于對照藥物抗壞血酸。初步構效關系分析表明，目標化合物結構中苯環(huán)上羥基的數(shù)目和取代位置對活性有較大影響。該研究設計合成的部分含酚酰腙類化合物具有優(yōu)異的抗氧化活性，可作為先導結構進一步深入研究。