徐婉瑩,查志敏,湯金梅

(1蘇州市第九人民醫(yī)院老年醫(yī)學科,江蘇 蘇州 215000;2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科,南京 210029)

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products,AGEs)是還原糖與核酸、蛋白質(zhì)之間經(jīng)過非酶促反應后進一步重排形成的不可逆終產(chǎn)物[1],參與了眾多疾病如糖尿病、癌癥、心血管疾病及衰老等過程,沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silentmatingtypeinformationregulation2homolog-3,Sirt3)是存在于線粒體內(nèi)與維持線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)的蛋白脫乙酰酶[2],和心臟肥厚、腎損傷、骨關(guān)節(jié)炎等發(fā)病機制相關(guān)[3],久坐不動的老年人與年輕人相比Sirt3水平減少了40%[4]。本實驗研究原代心肌細胞中Sirt3改變是否參與AGEs致心肌衰老的過程。黃山藥總皂苷(total saponins of dioscorea pathaica,TSDP)是薯蕷科植物黃山藥根莖中提取物,主要成分為甾體皂苷類,具有治療心肌缺血、降血脂和抗腫瘤等作用,本團隊前期研究其保護作用可能與Sirt3升高相關(guān),本實驗將進一步探討其中機制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

出生1～3d清潔級SD乳大鼠購于南京青龍山動物養(yǎng)殖場;高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)及Ⅱ型膠原酶購于美國Sigma公司;AGEs(ab51995)購于美國Abcam公司;胎牛血清,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)購于美國Gibco公司;p16、p53抗體購于中國Proteintech公司;SIRT3及超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2,SOD2)抗體購于美國CST公司;Sirt3 siRNA購于中國吉瑪基因公司;SA-β-Gal染色試劑盒及活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購于上海碧云天公司;TSDP提取物原粉購于成都地奧制藥公司。

1.2 方法

1.2.1 分離與培養(yǎng)原代心肌細胞 取SD乳大鼠,在無菌條件下剪開胸壁取出心臟,馬上放于無菌預冷的PBS中清洗3次,隨后剪碎,在0.1%的Ⅱ型膠原酶中反復消化7次,每次消化6min,把每次消化后的液體收集后滴入含有完全培養(yǎng)基和血清的終止液里。將所有收集溶液于4℃,1000轉(zhuǎn)/min離心機中離心10min,吸棄上清,加入含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中重懸,隨后鋪板在10cm培養(yǎng)皿中,放置在37℃溫箱中共1.5h,所收集的上清液含有心肌細胞,用槍吹勻,在6孔板中鋪板,繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.2 實驗分組與干預 為研究原代心肌細胞中Sirt3表達對AGEs誘導心肌老化的影響,把細胞分組如下:對照組(正常培養(yǎng)不轉(zhuǎn)染siRNA),陰性參照AGEs+NC siRNA組(轉(zhuǎn)染NC siRNA后加入100ng/ml AGEs刺激48h),AGEs+Sirt3 siRNA組(轉(zhuǎn)染Sirt3 siRNA后加入100ng/ml AGEs刺激48h)。隨后探討TSDP對心肌老化的影響,將細胞分為空白對照組(正常培養(yǎng)不轉(zhuǎn)染siRNA),AGEs+NC siRNA組(轉(zhuǎn)染NC siRNA后加入100ng/ml AGEs刺激48h),AGEs+TSDP+NC siRNA組(轉(zhuǎn)染NC siRNA后加入10ng/ml TSDP預干預細胞,2h后加入100ng/ml AGEs繼續(xù)刺激48h)及AGEs+TSDP+Sirt3 siRNA組(轉(zhuǎn)染Sirt3 siRNA后加入TSDP10ng/ml預干預心肌細胞,2h后加入100ng/ml AGEs繼續(xù)刺激48h)。

1.2.3Sirt3 siRNA干擾 在6孔板培養(yǎng)提取的原代心肌細胞,控制細胞密度約為每毫升5×105個。48h后觀察心肌細胞,密度達70%～90%,并顯示細胞已貼壁,搏動有力,換液培養(yǎng),過夜后干預。配制試劑:無菌操作下取EP管,以125μl DMEM稀釋7.5μl lipfectamine 3000,輕輕吹勻。取另一只EP管,以125μl DMEM稀釋100pmolSirt3 siRNA吹勻。放置于室溫5min。將上述兩種溶液加在一起后于室溫放置5min來形成siRNA/lipofectamin復合物。取出細胞吸棄培養(yǎng)基,加入上述配制好的復合物。用十字交叉法搖勻溶液,隨后放入37℃含CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后吸除溶液,洗滌細胞換液培養(yǎng)繼續(xù)實驗。Sirt3 siRNA序列信息:Sense為5′-CCAUCUUUGAACUAGGCUUTT-3′;Anti-sense為5′AAGCCUAGUUCAAAGAUGGTT-3′。陰性干擾序列信息:Sense為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;Anti-sense為5′-ACUUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.4 測定半乳糖苷酶SA-β-Gal活性 吸棄培養(yǎng)基,每孔加染色固定液1ml,靜置室溫15min。吸棄固定液后用PBS清洗3次,隨后每孔加染色工作液1ml,用保鮮膜包裹,隨后置于無CO2的溫箱中過夜。用光學顯微鏡觀察并拍照計數(shù)。

1.2.5 測定活性氧 棄培養(yǎng)基后,在避光條件下將DCFH-DA1ml(10μmol/ml)加入培養(yǎng)細胞。靜置于培養(yǎng)箱20min后,用DMEM溶液清洗3次,隨后用熒光顯微鏡觀察細胞并拍照,用image J軟件測熒光強度。

1.2.6 免疫印跡試驗檢測細胞內(nèi)蛋白表達水平 用裂解緩沖液(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)提取原代心肌細胞蛋白,用蛋白質(zhì)定量法(bicinchoninic acid,BCA)法測細胞所含蛋白濃度。隨后配膠與跑膠:分別配制好分離膠和濃縮膠,取出蛋白煮沸5min后室溫冷卻。加樣,電泳,直至溴酚藍到達分離膠的底部關(guān)閉電源。用100V電壓轉(zhuǎn)膜1h,4℃條件下在牛奶中封閉2h。加入一抗SOD2,β-actin,P53,P62 (1∶1000)過夜。第2天洗膜,放入二抗2h后,繼續(xù)洗膜3次,用增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)試劑盒發(fā)光,顯示蛋白目標條帶。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 Sirt3 siRNA干預AGEs誘導的心肌細胞后對老化的影響

原代心肌細胞中AGEs+NC siRNA組和AGEs+Sirt3 siRNA組分別同對照組相比,SIRT3蛋白表達水平減少,P53、P16蛋白表達水平升高,SA-β-Gal染色陽性的細胞百分比升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AGEs+Sirt3 siRNA組與AGEs+NC siRNA比較,P53表達水平進一步升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而P16表達水平及SA-β-Gal染色比例增高差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 Sirt3 siRNA對心肌老化的影響Figure 1 Effect of Sirt3 siRNA on cardiac senescence (n=3)A,B,C,D: expression level of p53, P16, and SIRT3 were determined by Western blot; E: SA-β-Gal positive cells were stained blue (indicated by red arrow; ×100). Con: control; AGEs: advanced glycation end products; NC: negative control; Sirt3: silent mating type information regulation 2 homolog-3; siRNA: small interferring RNA. Compared with control group, *P<0.05; compared with AGEs+NC siRNA group, #P<0.05.

2.2 Sirt3 siRNA及AGEs對抗氧化蛋白SOD2及氧化應激的影響

AGEs+NC siRNA組和AGEs+Sirt3 siRNA組分別同對照組相比,SOD2表達水平減少,ROS升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);AGEs+Sirt3 siRNA組與AGEs+NC siRNA比較,SOD2及ROS改變差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 Sirt3 siRNA減少SOD2表達增加ROS產(chǎn)生Figure 2 Sirt3 siRNA decreased SOD2 expression and increased ROS production (n=3)A: expression of SOD2 was determined by Western blot; B: green fluorescence intensity represented ROS expression level in cardiomyocytes (×100). Con: control; AGEs: advanced glycation end products; NC: negative control; siRNA: small interferring RNA; Sirt3: silent mating type information regulation 2 homolog-3; SOD2: superoxide dismutase-2. Compared with control group, *P<0.05.

2.3 TSDP保護AGEs誘導的心肌老化過程中Sirt3的作用

AGEs+NC siRNA組較空白對照組SA-β-Gal陽性細胞比例增加;AGEs+TSDP+NC siRNA組較AGEs+NC siRNA組,SA-β-Gal陽性細胞比例減少(P<0.05);AGEs+TSDP+Sirt3 siRNA較AGEs+TSDP+NC siRNA組相比,上述對SA-β-Gal陽性細胞比例減少的作用消失(圖3)。

圖3 TSDP干預AGEs誘導的心肌老化過程中Sirt3 siRNA干預后的影響Figure 3 Effect of TSDP on AGEs-induced cardiac senescence after Sirt3 siRNA intervention (n=3)A: SA-β-gal positive cells were stained blue (red arrow,×100); B: quantitative analysis was performed on the proportion of SA-β-Gal positive cells. Con: control; AGEs: advanced glycation end products; NC: negative control; siRNA: small interferring RNA; TSDP: total saponins of dioscorea pathaica; Sirt3: silent mating type information regulation 2 homolog-3. Compared with control group, *P<0.05; compared with AGEs+NC siRNA group ,#P<0.05; compared with AGEs+TSDP+NC siRNA group,△P<0.05.

3 討 論

AGEs隨著年齡的增長而急劇累積,通過氧化應激引發(fā)炎癥進展,導致心血管疾病、糖尿病、甚至癌癥等疾病進展。在心臟中,AGEs參與心力衰竭過程,尤其是在糖尿病心肌病和衰老過程中起著重要的作用[4]。我們的前期細胞水平研究發(fā)現(xiàn):老齡大鼠心肌的AGEs含量明顯升高,舒張功能下降,發(fā)生心肌重構(gòu),其機制與氧化應激、線粒體自噬功能異常相關(guān)。心臟是人體的生命之泵,它需要正常功能的線粒體來滿足心肌對能量的高需求,但線粒體同時也是重要的ROS來源,大約90%的細胞ROS在線粒體中產(chǎn)生。ROS生成與清除之間的不平衡對細胞功能不利,其過量產(chǎn)生影響線粒體DNA修復及細胞功能。本課題組前期研究也證明了AGEs致心肌細胞衰老可能是通過增加了氧化應激進而導致的線粒體功能損傷所致[5]。因此,尋找有效的抗氧化物,抑制氧化應激,維持線粒體正常功能成了延緩心肌衰老的思路。Sirt3是存在于線粒體的一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白脫乙酰酶,具有強大的脫乙酰酶活性,和維持線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[2]。本實驗旨在探討心肌老化機制,研究Sirt3在心肌老化中的作用,尋找老化干預靶點。

研究報道,在與氧化應激和線粒體相關(guān)的疾病如心臟肥厚、急性腎損傷、骨關(guān)節(jié)炎中均會出現(xiàn)Sirt3功能受損的現(xiàn)象[6],而通過靶向Sirt3-COX4I2軸重編程線粒體呼吸鏈復合體可減緩骨關(guān)節(jié)炎進展[6]。在阿爾茨海默癥模型中,Sirt3通過引起脫乙酰化蛋白的構(gòu)象變化,參與線粒體抗氧化防御,Sirt3的上調(diào)可維持線粒體穩(wěn)態(tài),因此它可能是包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的許多疾病的潛在治療靶點[7]。在內(nèi)皮祖細胞中,AGEs干預減少了Sirt3表達水平,而過表達Sirt3則保護了AGEs所誘導的細胞功能障礙并增強了細胞抗氧化能力[8]。眾多學者也研究了Sirt3對心臟的影響,有文獻指出Sirt3去乙?；筛纳凭€粒體過渡孔的通透性,避免如心肌肥厚、缺血再灌注、間質(zhì)纖維化和心力衰竭等疾病中的心肌細胞功能障礙[9]。然而,有爭議的是,也有文獻指出Sirt3升高可損傷細胞功能。在某些類型的癌癥如結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌中[10],Sirt3起到腫瘤啟動子的作用,另有研究稱在敲除Sirt3的年輕小鼠心臟中,心臟功能并未表現(xiàn)出任何缺陷[11]。此實驗發(fā)現(xiàn),AGEs可減少SIRT3的表達,降低SOD2蛋白表達水平,升高P16、P53水平,引起細胞活性氧產(chǎn)生增加,促進衰老進程;siRNA敲降Sirt3后AGEs干預組進一步增加了AGEs引起的P53升高幅度。我們分析,AGEs減少抗氧化蛋白SOD2的表達,加重線粒體氧化應激,促進AGEs誘導的心肌老化進程,可能與下調(diào)Sirt3的表達水平有關(guān)。但AGEs致心肌老化基礎上進一步敲降Sirt3后,P16蛋白表達水平及SA-β-Gal的陽性細胞比例較AGEs組改變差異無統(tǒng)計學意義,可能因老化涉及通路眾多,AGEs已較大程度致使心肌老化,這有待更多實驗驗證。

眾多文獻報道Sirt3與維持線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān),在心血管疾病方面,Sirt3激活了SOD2和過氧化氫酶,通過轉(zhuǎn)錄因子的去乙?；种苹钚匝鮎OS產(chǎn)生[12]。Sirt3基因敲除小鼠的肝細胞中可觀察到SOD2活性降低,線粒體ROS產(chǎn)生增加,進而影響細胞正常功能。而Sirt3的上調(diào)使SOD2去乙酰化并增強其活性,降低線粒體氧化應激[13];內(nèi)皮祖細胞中Sirt3/SOD2信號通路的上調(diào)可增強細胞的再內(nèi)皮化能力,保存線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)[14]。在此實驗中,采用Sirt3 siRNA預處理AGEs干預組、NC siRNA預處理AGEs干預組,并分別與對照組相比發(fā)現(xiàn),SIRT3下降同時伴隨著SOD2下降及線粒體ROS產(chǎn)生增加。結(jié)合既往文獻,考慮心肌細胞中SOD2可能是Sirt3影響細胞氧化應激的一個靶標。

一些天然產(chǎn)物已被證明可激活Sirt3活性,目前研究最多的藥物之一是白藜蘆醇。其保護機制可能是通過上調(diào)Sirt3活性提供多巴胺能神經(jīng)保護,從而激活SOD2活性減少體內(nèi)的氧化攻擊。高劑量茶多酚HBP能有效增加線粒體功能蛋白Sirt3的表達,抑制骨骼肌AGEs,減少骨骼肌的氧化應激[15]。與Sirt3相關(guān)的藥理學研究也表明,其激活劑如二甲雙胍,可以顯著降低動脈粥樣硬化AS的風險[16]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),TSDP預干預AGEs誘導的細胞后,增加Sirt3及SOD2蛋白的表達水平,減少了ROS的產(chǎn)生,并減少了衰老相關(guān)蛋白P53水平表達,其可能是通過增加Sirt3蛋白的表達水平而改善AGEs誘導的心肌老化進程[17]。在此實驗中,敲降Sirt3后,TSDP引起的老化心肌SA-β-Gal染色陽性細胞比例減少現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn);這種敲降Sirt3后心肌老化改善的現(xiàn)象被抵消,表明在一定程度上,TSDP可能是通過調(diào)控Sirt3表達水平來影響老化。后續(xù),我們將進一步完善Sirt3過表達對心肌細胞的影響,及Sirt3對線粒體功能的影響,找出其中聯(lián)系進一步探討老化機制。

綜上,AGEs減少心肌細胞抗氧化物蛋白SOD2的表達,加重線粒體氧化應激,促進AGEs誘導的心肌老化進程,可能與下調(diào)Sirt3的表達水平相關(guān)。TSDP可能是通過調(diào)控Sirt3的表達水平而影響老化。但進一步沉默Sirt3表達水平未明顯加重AGEs誘導的氧化應激及老化相關(guān)指標表達,可能與AGEs已較大程度減少了Sirt3表達進而致心肌細胞老化有關(guān)。目前的研究有一些局限性,我們僅研究了Sirt3及氧化應激信號通路,它不是老化的唯一通路;其次,細胞水平的研究相對單一,動物實驗需跟進,過表達Sirt3實驗未完善。然而此次研究也找到了一個影響心肌老化的切入點,未來我們將繼續(xù)研究過表達Sirt3對心肌老化的影響。上調(diào)Sirt3水平有望成為延緩AGEs誘導的心肌衰老的潛在靶點。