【摘要】 目的：研究HSV-tk基因和IL-12基因抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達對鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用。方法：建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型，將42只成瘤鼠隨機分成IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組、空白對照組、每組6只。采用瘤內(nèi)注射分別給予相對應(yīng)的重組腺病毒液（AdKDR-tk）、重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12及生理鹽水，24 h后重復(fù)注射1次。次日起HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組連續(xù)10 d每天腹腔內(nèi)注射GCV 100 mg/（kg·d），連續(xù)10 d。各放射治療組第3周開始給予6MV-X照射，每天2 Gy，連續(xù)5 d。治療結(jié)束后處死裸鼠，檢測裸鼠腫瘤質(zhì)量及腫瘤生長抑制率，免疫組織化學法檢測腫瘤微血管密度及VEGF陽性細胞灰度值。結(jié)果：IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組的腫瘤生長抑制率最高，達71.7%。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于其他各組，VEGF陽性細胞灰度值均高于其他各組（Plt;0.05）。結(jié)論：HSV-tk基因和IL-12基因聯(lián)合應(yīng)用在鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放療中可抑制移植瘤的生長，為鼻咽癌的放療產(chǎn)生增敏作用。

【關(guān)鍵詞】 血管內(nèi)皮生長因子 鼻咽癌 放射治療 HSV-tk基因 IL-12基因

Experimental Study of HSV-tk Gene and IL-12 Gene Inhibiting VEGF Expression and Radiosensitization Effect on Nasopharyngeal Carcinoma Tumor Bearing Nude Mouse Models/ZHOU Yuhua， ZHU Qianyuan， ZENG Yougen， LI Baojin. //Medical Innovation of China， 2023， 20（19）： 0-027

[Abstract] Objective： To investigate the radiosensitization effect of HSV-tk gene and IL-12 gene on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in nasopharyngeal carcinoma tumor bearing nude mouse models. Method： A nude mouse model of nasopharyngeal carcinoma was established， and 42 tumor-forming mice were randomly divided into IL-12 group， IL-12 + radiotherapy group， HSV-tk/GCV group， HSV-tk/GCV + radiotherapy group， IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group， blank control group， and 6 mice in each group. The corresponding recombinant adenopathy venom （AdKDR-tk）， recombinant retrograde adenopathy venom IL-12

and normal saline were given by intratumoral injection， and the injection was repeated once 24 hours later. From the next day， the HSV-tk/GCV group， the HSV-tk/GCV + radiotherapy group， the IL-12 + HSV-tk/GCV group， and the IL-12 + HSV-tk/GCV+radiotherapy group were intraderally injected 100 mg/ （kg·d） of GCV every day for 10 consecutive days. Each radiotherapy group was given 6MV-X irradiation at 2 Gy per day for 5 consecutive days starting from the 3rd week. After treatment， the nude mice were killed， the tumor quality and tumor growth inhibition rate were detected， and the tumor microvascular density and positive expression of gray value of VEGF positive cells were detected by immunohistochemical methods. Result： The tumor mass of nude mice in IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group was significantly lower than those in IL-12 group， IL-12 + radiotherapy group， HSV-tk/GCV group and HSV-tk/GCV + radiotherapy group， with statistical significance （Plt;0.05）. The tumor growth inhibition rate of IL-12+HSV-tk/GCV + radiotherapy group was the highest， reaching 71.7%. The microvascular density and gray value of VEGF positive cells in IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group were lower than those in other groups （Plt;0.05）. Conclusion： The combined application of HSV-tk gene and IL-12 gene can inhibit the growth of transplanted tumor in the nude mouse model of nasopharyngeal carcinoma， and produce sensitization for the radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] VEGF Nasopharyngeal carcinoma Radiotherapy HSV-tk gene IL-12 gene

First-author's address： Ji’an Third People's Hospital， Jiangxi Province， Ji’an 343000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.19.006

鼻咽癌在我國南方地區(qū)常見，病理以低分化、未分化鱗癌為主，放療是鼻咽癌的首選。近年來，立體適形放療、立體定向放療等放療新技術(shù)的應(yīng)用，但其5年生存率仍改善不明顯。隨著腫瘤生物治療學的快速發(fā)展，基因-放射治療研究正成為抗惡性腫瘤對放療敏感的新策略[1-4]。本實驗探討HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因治療鼻咽癌的基礎(chǔ)上聯(lián)合放射治療，通過HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因通過阻止血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）來抑制VEGF的表達，從而增強鼻咽癌放射敏感性，為進一步開展鼻咽癌生物基因放射治療奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

帶有HSV-tk基因的重組腺病毒（AdKDR-tk）及含IL-12基因重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液由廣州醫(yī)科大學李寶金博士構(gòu)建并提供[5]。丙氧鳥苷（GCV）購自Roche公司。實驗動物SCID荷瘤裸鼠模型小鼠，4～6周齡，雌雄不分，20～25 g，購自中山大學動物實驗中心，SPF無菌條件下飼養(yǎng)，（25±5）℃，相對濕度40%～70%，自由攝取食物和水。S-P超敏試劑盒，DAB顯色試劑盒，蘇木素試劑盒，CD34抗體購自Maixin-Bio公司。取對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞CNE-2，制成單細胞懸液，荷瘤裸鼠單側(cè)腋部皮下植入5×105（0.2 mL）CNE-2細胞，每日觀察瘤體生長情況，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過0.7 cm為成瘤標準[6]。

1.2 方法

取成瘤荷瘤裸鼠42只，隨機分成IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+

HSV-tk/GCV+放射治療組、空白對照組，每組6只。IL-12組、IL-12+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12 0.1 mL；HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組腺病毒液AdKDR-tk 0.1 mL；IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組腺病毒液AdKDR-tk和重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12各 0.1 mL；空白對照組癌灶內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，24 h后重復(fù)注射1次。次日起HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組、分別在腹腔內(nèi)注射GCV 100 mg/（kg·d），連續(xù)10 d。IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組第3周開始給予6MV-X照射，每天2 Gy，連續(xù)5 d。照射后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，每天觀察荷瘤裸鼠腫瘤生長情況。

1.3 觀察指標與判定標準

（1）裸鼠瘤體質(zhì)量及腫瘤生長抑制率。飼養(yǎng)2周后處死裸鼠，裸鼠體內(nèi)取出腫瘤稱其質(zhì)量。腫瘤生長抑制率計算公式：腫瘤生長抑制率=（1-治療組瘤重量/空白對照組瘤重量）×100%。（2）腫瘤微血管密度及VEGF陽性細胞灰度值。腫瘤微血管密度檢測方法：CD34陽性反應(yīng)物為淺棕至深棕色顆粒，分布在血管內(nèi)皮細胞，采用免疫組織化學方法檢測CD34標記的腫瘤微血管密度[6]；VEGF陽性細胞灰度值判定：以PBS代替一抗作為陰性對照物，在胞核、胞膜或胞漿中呈現(xiàn)棕黃色為陽性。對免疫免疫組化的切片，按照分析系統(tǒng)測定的要求進行系統(tǒng)設(shè)置和操作，在20倍物鏡下，隨機測量100個陽性細胞的平均灰度值（背景灰度值-實測灰度值），顏色越深，灰度值越小[7]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤體質(zhì)量及腫瘤生長抑制率

HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組與IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量均較空白對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組的腫瘤生長抑制率最高，達71.7%。見表1。

2.2 各組腫瘤微血管密度及VEGF陽性細胞灰度值

IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于空白對照組（Plt;0.05）。IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組VEGF陽性細胞灰度值均高于空白對照組（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于其他各組，VEGF陽性細胞灰度值均高于其他各組（Plt;0.05）。見表2、圖1。

3 討論

腫瘤生物治療學相關(guān)研究在近年來取得了諸多進展，目前已用于增加腫瘤治療效果的靶基因主要集中于p53、Survivin、sKDR、ElA、mda-7、94、TRAIL、VEGF、以及自殺基因CD，TK等多個基因[8-10]。盡管各種基因在腫瘤治療中頗具前景，但單獨應(yīng)用的效果欠佳，聯(lián)合治療策略應(yīng)用是當下及今后腫瘤治療研究的趨勢[11]。

惡性腫瘤中VEGF及VEGFR的表達高低與腫瘤微血管密度相關(guān)密切。通過一系列生化反應(yīng)可導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌治療是以放療為主。腫瘤的輻射抗性是癌癥放療面對的難題，研究表明放療可阻止VEGF的表達，增加放療射線的殺傷力，增強放射敏感性[12-16]。鼻咽癌中VEGF表達率可達60%～80%，尋找影響鼻咽癌放療敏感性相關(guān)基因阻止VEGF的表達提高鼻咽癌的放療敏感性、降低其放療抵抗對改善鼻咽癌治療預(yù)后具有重要意義[17-18]。

自殺基因HSV-tk/GCV在腫瘤基因治療中應(yīng)用最為廣泛。利用HSV1-tk磷酸化GCV產(chǎn)生細胞毒性，從而殺傷腫瘤細胞。IL-12是腫瘤生物治療中的細胞因子，具有刺激NK細胞和T細胞的增殖活化，已用于多種腫瘤的臨床試驗治療。前期研究發(fā)現(xiàn)AdKDR-HSV-tk可靶向表達于鼻咽癌血管內(nèi)皮細胞，通過給予GCV可有效地破壞腫瘤血管內(nèi)皮細胞。結(jié)合注射攜帶IL-12基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒可使鼻咽癌腫瘤局部IL-12基因長期穩(wěn)定表達，增強腫瘤血管的破壞，促使腫瘤壞死退縮；本次研究通過HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因通過阻止VEGFR抑制VEGF的表達來增強鼻咽癌放射敏感性，通過檢測瘤體質(zhì)量、微血管密度、VEGF陽性細胞灰度值，IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組與其他組比較，有明顯差異。說明基因聯(lián)合應(yīng)用較單一應(yīng)用效果更好。下一步將深入探討HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因在鼻咽癌放療中增敏作用的感性發(fā)生、發(fā)展的分子機制，為鼻咽癌的治療提供新的治療途徑。

參考文獻

[1] SAWAN T，TOWERJ I，GORDONN A，et al.The submandibular gland and the aging neck：a longitudinal volumetric study[J].Aesthetic Plast Surg，2021，45（3）：987-991.

[2] MICHAELSEN S R，STABERG M，PEDERSEN H，et al.

VEGF-C sustains VEGFR2 activation under bevacizumab therapy and promotes glioblastoma maintenance[J].Neuro Oncol，2018：20（11）：1462-1474.

[3]張怡，潘敏，鄧志婷，等.聚焦超聲介導(dǎo)陽離子脂質(zhì)體攜帶HS V-TK增強基因轉(zhuǎn)染及聯(lián)合更普洛韋對大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2018，32（5）：417-421.

[4] HU C，JIANG D，WU M，et al.Ultrasound-mediated nanobubble destruction（LTMND）facilitates the delivery of VEGFR2-targeted CD-TK-loaded cationic nanobubbles in the treatment of bladder cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2020，146（6）：1415-1426.

[5]朱欠元，周玉梅，李寶金，等.HSV-TK基因和IL-12基因治療裸鼠鼻咽癌的實驗研究[J].第四軍醫(yī)大學學報，2008，30（16）：1461-1463.

[6]李寶金，鄺偉明，朱欠元，等.重組腺病毒AdKDR-TK聯(lián)合IL-12逆轉(zhuǎn)錄病毒血管靶向治療裸鼠皮下人肝癌細胞移植瘤的實驗研究[J].井岡山大學學報（自然科學版），2010，31（4）：87-90.

[7]王輝.塞來昔布聯(lián)合放療對乳腺癌裸鼠移植瘤中VEGF，MMP-9及HIF-1α表達的影響[D].衡陽：南華大學，2011.

[8] MATSUMOTO M，HAYASHI K，SUETAKE H，et al.

Identification and functional characterization of multiple interleukin 12 in amberjack（Seriola dumerili）[J].Fish Shellfish Immunol，2016，55：281-292.

[9] BEHZADI P，BEHZADI E，RANJBAR R.IL-12 family cytokines：general characteristics，pathogenic microorganisms，receptors，and signalling pathways[J].Acta Microbiol Immunol Hung，2016，63（1）：1-25.

[10] SUDAKA A，SUSINI A，LO NIGRO C，et al Combination of Bevacizumab and irradiation on uveal melanoma：an in vitro and in vivo preclinical study[J].Invest New Drugs，2013，31（1）：59-65.

[11] GU L，WANG Z，ZUO J，et al.Prognostic significance of NF-κB

expression in non-small cell lung cancer：a meta-analysis[J/OL].PLoS One，2018：13（5）：e0198223.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29813121/.

[12] MIAO J，WANG L，ZHU M，et al.Reprint of Long-term survival and late toxicities of elderly nasopharyngeal carcinoma（NPC）patients treated by high-total-and fractionated-dose simultaneous modulated accelerated radiotherapy with or without chemotherapy[J].Oral Oncol，2019，90：126-133.

[13] PARK Y H，JUNG A R，KIM G E，et al.GV1001 inhibits cell viability and induces apoptosis in castration-resistant prostate cancer cells through the AKT/NF-κB/VEGF pathway[J].

J Cancer，2019，10（25）：6269-6277.

[14] PAN H M，LANG W Y，YAO L J，et al.shRNA-interfering LSD1 inhibits proliferation and invasion of gastric cancer cells via VEGF-C/PI3 K/AKT signaling pathway[J].World Gastrointest Onco1，2019，11（8）：622-623.

[15] HAMMING L C，SLOTMAN B J，VERHEULH M W，et al.The clinical application of angiostatic therapy in combination with radiotherapy：past，present，future[J].Angiogene，2017，20（2）：217-232.

[16] ALIOUAT A，HATIN I，BERTIN P，et al.Divergent effects of translation termination factor eRF3A and nonsense-mediated mRNA decay factor UPF1 on the expression of uORF carrying mRNAs and ribosome protein genes[J].RNA Biol，2020，17（2）：227-239.

[17]劉亮，劉毅，夏鈾鈾，等.內(nèi)皮抑素對NSCLC細胞系中VEGF受體2表達的影響及其放射增敏效應(yīng)機制研究[J].中華放射腫瘤學雜志，2015，24（5）：593-597.

[18]朱欠元，曾友根，張愈延，等.腺病毒介導(dǎo)的KDR-HSV-tk系統(tǒng)對血管內(nèi)皮細胞殺傷作用及旁觀者效應(yīng)的實驗研究[J].中國老年學雜志，2015，35（15）：4131-4133.

（收稿日期：2022-12-20） （本文編輯：田婧）