摘要：目的評估硫酸吲哚酚對紅細(xì)胞衰亡及其特征性改變的影響，進(jìn)一步探討其促進(jìn)腎性貧血發(fā)展的作用機(jī)制。方法收集深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院2019年2月-2020年2月之間的20例健康志愿者靜脈血，體外孵育紅細(xì)胞，以不同濃度白蛋白結(jié)合的IS刺激體外培養(yǎng)的紅細(xì)胞；檢測紅細(xì)胞形態(tài)、紅細(xì)胞體積（FSC）、紅細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸標(biāo)記率及紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度。結(jié)果隨著硫酸吲哚酚刺激紅細(xì)胞濃度升高，實(shí)驗(yàn)組患者紅細(xì)胞體積，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（plt;0.05）；當(dāng)硫酸吲哚酚濃度增加時(shí)，紅細(xì)胞的膜磷脂酰絲氨酸（PS）標(biāo)記率隨之增加；紅細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度上升（plt;0.05）。結(jié)論硫酸吲哚酚通過誘導(dǎo)紅細(xì)胞衰亡，縮短了紅細(xì)胞的壽命，該機(jī)制可能參與了腎性貧血的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：硫酸吲哚酚，腎性貧血，紅細(xì)胞壽命，紅細(xì)胞衰亡

中圖分類號：R692.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9545（2023）02-0117-（04）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.02.026

腎性貧血普遍存在于慢性腎臟?。╟hronickidneydisease，CKD）患者[1]。資料顯示，貧血是增加CKD患者心血管風(fēng)險(xiǎn)和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，貧血加速了CKD病程的進(jìn)展，是導(dǎo)致CKD患者生活質(zhì)量降低的一個(gè)重要因素[3]?；颊哓氀又?，生活質(zhì)量下降。

硫酸吲哚酯（indolsulfate，IS）是色氨酸在腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物，是一種與蛋白高度結(jié)合的毒素，在尿毒癥患者血清濃度是正常人50～90倍[4]。血液透析難以將其清除。盡管IS廣泛參與了CKD進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，但I(xiàn)S對腎性貧血的影響及其機(jī)制尚不明確[5]。

該研究擬體外以不同濃度IS培養(yǎng)健康紅細(xì)胞，通過觀察紅細(xì)胞形態(tài)、紅細(xì)胞表面PS外露，紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變，評估IS對紅細(xì)胞衰亡的影響，以及對紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和Ca2+代謝的影響，進(jìn)一步探討其促進(jìn)腎性貧血發(fā)展的作用機(jī)制。

1臨床資料與方法

1.1一般資料

收集深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科2019年2月-2020年2月腎性貧血住院患者40例，其中男21例，女19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：成年非吸煙健康志愿者的臨床資料，抽取外周靜脈血10ml，分離得到正常紅細(xì)胞，血常規(guī)，尿常規(guī)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除地中海貧血、G-6PD缺乏癥、自身免疫性溶血性貧血（AIHA）、骨髓增生異常綜合征（MDS）、多發(fā)性骨髓瘤（MM）、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）等[6]。對照組40例來自深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院體檢中心，其中男23例，女17例，均無貧血等疾病。所有參與對象均簽署了知情同意書，并得到了深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料人血白蛋白（humanserumalbumin，HSA）（美國GIBCO產(chǎn)品）；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、鈣離子熒光探針（Fluo₃/AM）、HBSS（Sigma公司）；NaCl、KCl、MgSO₄等來自晶美公司進(jìn)口分裝，其余試劑為國產(chǎn)分析純。IS濃度參考?xì)W洲尿毒素研究組（EUTox）尿毒素清單中CKD患者血清濃度[7]。血球分析儀：日本sysmex2100，流式分析儀：BD公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法①標(biāo)本采集：分別采集腎內(nèi)科患者及成年非吸煙健康志愿者清晨空腹靜脈血10mL，以3000r/min離心10min，取上清，生理鹽水反復(fù)洗滌分離得到正常紅細(xì)胞，林格液孵育紅細(xì)胞使其終濃度為0.4%紅細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞分成4組（n=10）：4%人血白蛋白組（對照組），4%人血白蛋白+IS組（62.5、125、500μmol/L）。②流式細(xì)胞儀檢測PS標(biāo)記率和紅細(xì)胞體積。③流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度。④全自動的血液分析儀檢測紅細(xì)胞參數(shù)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒均購自日本sysmex公司。

1.3觀察指標(biāo)

紅細(xì)胞衰亡檢測標(biāo)準(zhǔn)：流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞的體積，檢測PS標(biāo)記率，用Fluo3fluorescence法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示并x2檢驗(yàn)、計(jì)量資料用（x-±s）表示予以t檢驗(yàn)。p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1紅細(xì)胞形態(tài)變化

紅細(xì)胞在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下孵育48h后，PBS洗滌，各孔加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC室溫避光孵育10min后1000r/min離心5min，棄上清，加入190μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長530nm進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測PS標(biāo)記率和紅細(xì)胞體積。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫酸吲哚酚刺激，實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞體積膨脹（見圖1）。

2.2硫酸吲哚酚與紅細(xì)胞壽命之間的關(guān)系

對實(shí)驗(yàn)組分析發(fā)現(xiàn)，隨著硫酸吲哚酚濃度升高，紅細(xì)胞的PS標(biāo)記率增加，紅細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度上升，plt;0.05，見（表1及圖2）。

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)硫酸吲哚酚體外共培養(yǎng)，紅細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，并且隨著硫酸吲哚酚刺激濃度增加，紅細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遞增。

3討論

腎性貧血是指指因慢性腎功能衰竭（chronicrenalfailure，CRF）所導(dǎo)致的貧血。其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，由于腎臟疾病致腎功能損害，腎臟促紅細(xì)胞生成因子和紅細(xì)胞生成素減少，以及毒素物質(zhì)干擾紅細(xì)胞的生成和代謝而導(dǎo)致的貧血。貧血加速了CKD病程的進(jìn)展，是導(dǎo)致CKD患者生活質(zhì)量降低的一個(gè)重要因素[4]。腎性貧血會增加慢性腎衰患者心血管風(fēng)險(xiǎn)、腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，影響預(yù)后。

紅細(xì)胞壽命縮短并被清除，是CKD患者貧血的重要原因之一。正常成熟紅細(xì)胞在血液循環(huán)中的壽命為70～140d，平均約為115d，而慢性腎衰竭患者紅細(xì)胞壽命僅40～60d，血液循環(huán)中衰老的RBC在通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)時(shí)被清除，詳細(xì)機(jī)制尚無定論。目前公認(rèn)的是RBC在衰老過程中，表面會出現(xiàn)一些特征性的變化[8]。例如：膜磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外露。正常RBC的PS包裹于細(xì)胞膜內(nèi)，隨著紅細(xì)胞的衰老，PS逐步翻轉(zhuǎn)暴露在RBC膜表面，可以被巨噬細(xì)胞識別并吞噬。近年研究還發(fā)現(xiàn)[9]，紅細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象是指紅細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜囊泡化引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及功能的改變，導(dǎo)致紅細(xì)胞變性，脆性增加，紅細(xì)胞溶血和壽命縮短，其潛在機(jī)制包括胞內(nèi)Ca2＋濃度異常升高、氧化應(yīng)激水平加劇及神經(jīng)酰胺胞內(nèi)過多堆積等。

該研究目的是探討IS影響紅細(xì)胞壽命促進(jìn)腎性貧血發(fā)展過程中的作用。CKD3～5期患者循環(huán)中紅細(xì)胞PS外露顯著增加，細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜囊泡化引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及功能的改變，研究發(fā)現(xiàn)，患者紅細(xì)胞PS的外露程度與紅細(xì)胞壽命之間呈負(fù)相關(guān)，提示PS在CKD患者紅細(xì)胞衰亡的發(fā)生機(jī)制中起重要作用[10]。血液透析并不能改善慢性腎衰竭患者細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜囊泡化引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及功能的改變的程度，紅細(xì)胞溶血和壽命縮短推測這些毒素可能是血透不能清除的大分子物質(zhì)或者與蛋白高度結(jié)合的小分子物質(zhì)，大量研究證實(shí)，過多的紅細(xì)胞凋亡參與了微循環(huán)障礙、局部血栓形成、貧血等諸多病理狀態(tài)，紅細(xì)胞的內(nèi)在遺傳缺陷性、某些疾病經(jīng)內(nèi)、外途徑造成機(jī)體抗氧化機(jī)制缺陷、氧化壓力、高滲透壓、能量不足、前列腺素（PG）及血小板活化因子（PAF）的合成與釋放、補(bǔ)體活化等損傷機(jī)制均可能觸發(fā)紅細(xì)胞凋亡，從而引起不同程度的貧血癥狀及微循環(huán)障礙[11]。硫酸吲哚酚是目前臨床公認(rèn)的一種腸源性毒素，其在慢性腎臟?。–KD）患者的機(jī)體內(nèi)蓄積，廣泛參與了CKD進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡又叫細(xì)胞編程性死亡，是受基因嚴(yán)格控制的，紅細(xì)胞衰亡（Eryptosis）之前，會出現(xiàn)類似于有核細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。硫酸吲哚酯（IS）是色氨酸在腸道菌群作用下的代謝產(chǎn)物，是一種與蛋白高度結(jié)合的毒素，在尿毒癥患者血清濃度是正常人50～90倍[12]。血液透析難以將其清除。盡管IS廣泛參與了CKD進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，但I(xiàn)S對腎性貧血的影響及其機(jī)制尚不明確。該研究以IS體外共培養(yǎng)健康紅細(xì)胞，觀察到紅細(xì)胞膨脹、紅細(xì)胞表面PS外露，紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，提示IS促進(jìn)紅細(xì)胞衰亡。

改研究以紅細(xì)胞壽命為切入點(diǎn)，體外以不同濃度IS刺激健康紅細(xì)胞，觀察到紅細(xì)胞膨脹、紅細(xì)胞表面PS外露，紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變，提示IS縮短了紅細(xì)胞壽命，為深層次解讀腎性貧血提供具有指向性的、有力的數(shù)據(jù)，為CKD合并貧血的治療提供新的思路。

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（責(zé)任編輯胡安娜）