摘要：目的觀察塞來昔布對肝星狀細胞增殖及膠原分泌的影響，探討塞來昔布抗肝纖維化的作用機制。方法將體外培養(yǎng)的肝星狀細胞分為正常組、模型組和治療組，模型組細胞給予PDGF刺激生長，治療組細胞給予PDGF刺激后加入塞來昔布治療，采用MTT法檢測肝星狀細胞的增殖，放射免疫法檢測I、III型膠原含量。WesternBlot法檢測CyclinD1蛋白表達。結果PDGF能夠顯著刺激肝星狀細胞增殖和分泌I、III型膠原蛋白，塞來昔布不僅能夠抑制經PDGF刺激的肝星狀細胞的增殖，而且能夠顯著抑制肝星狀細胞分泌I、III型膠原蛋白。塞來昔布抑制肝星狀細胞CyclinD1蛋白表達。結論塞來昔布可能通過下調CyclinD1蛋白表達抑制肝星狀細胞的增殖和分泌膠原發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

關鍵詞：塞來昔布，肝星狀細胞，肝纖維化，細胞增殖，膠原蛋白

中圖分類號：R735.34

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9545（2023）02-0099-（00）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.02.021

肝纖維化是指各種慢性因素所致損傷后在修復過程中肝臟細胞外基質異常增多和過度沉積的過程[1]。在肝纖維化的發(fā)生過程中，肝星狀細胞、肝細胞、內皮細胞、血小板源性生長因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、轉化生長因子（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）等多種細胞、細胞因子參與其中，其中肝星狀細胞增殖和膠原分泌起核心作用[2]。目前，在國內，僅有諸如扶正化瘀膠囊、鱉甲軟肝片等少數幾種中成藥用于治療肝纖維化，尚無一種化學藥物批準用于肝纖維化的治療[3]。因此，研究一種能夠在臨床上用于治療肝纖維化的化學藥物具有重要意義。

很多科研單位在研究新型化學藥物在肝纖維化中的作用，比如吡非尼酮、氟非尼酮等[4]。實際上，一些在臨床上使用的藥物也不乏具有抗肝纖維化作用。塞來昔布是一種選擇性的環(huán)氧化酶2（COX-2）抑制劑，研究表明塞來昔布在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中具有抗肝纖維化作用[5]，但有關它在抗肝纖維化作用機制尚不清楚。因此，本研究通過觀察塞來昔布對肝星狀細胞增殖及分泌膠原的作用，探討其抗肝纖維化的作用機制。

1材料和方法

1.1材料

四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma-aldrich公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco技術公司，PDGF購自美國Sigma-aldrich公司，胰蛋白酶購自Hyclone公司，I型、III型膠原放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術公司，DMSO購自中國江萊生物科技有限公司，CycllinD1抗體購自美國CellSignaling公司，塞來昔布購自輝瑞制藥公司，肝星狀細胞系購自青旗生物技術發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)肝星狀細胞系貼壁生長在含10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，用0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，3～4d傳代1次。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖將對數生長期的肝星狀細胞系用0.25%胰酶-EDTA溶液消化后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將細胞制成3×10⁴/mL的均勻細胞懸液，加入96孔板中（每孔100μL）培養(yǎng)24h后，將細胞分為正常組、模型組及治療組（終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L），其中，在模型組及治療組中加入2μLPDGF（終濃度為10ng/mL），將細胞置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后，在治療組中加入含塞來昔布（終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)12、24、48h后取出96孔板，棄去培養(yǎng)基，于每孔中加入100μLMTT，在培養(yǎng)箱中放置4小時。吸出MTT，加入150μLDMSO，室溫下放置10min。酶聯免疫檢測分析儀測定A_490nmOD值。

1.2.3放射免疫法檢測I、III型膠原分泌將對數生長期的肝星狀細胞系制成3×105/mL的細胞懸液，接種于6孔板中，將細胞分為正常組、模型組和治療組（20μmol/L），培養(yǎng)24h后，棄去原有培養(yǎng)基，更換不含FBS的DMEM溶液同步化處理細胞，同步化12小時后，在模型組和治療組中加入2μLPDGF（終濃度為10ng/mL），置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后在治療組中加入含塞來昔布（終濃度為20μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)上清液，用放射免疫法檢測I、III型膠原蛋白含量。

1.2.4WesternBlot法檢測CyclinD1蛋白表達將細胞分為正常組、模型組和治療組（20μmol/L），各組細胞相應處理后，收集培養(yǎng)皿中肝星狀細胞，用預冷的PBS液沖洗2次，加入1mLRIPA裂解液吹打混勻，提取細胞總蛋白，經電泳、轉膜后，放入脫脂奶粉溶液中封閉2h，加入1∶1000稀釋后的CyclinD1抗體，4℃孵育過夜，用TBST液洗一抗后加入1∶5000兔二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜3次。加入電化學發(fā)光液顯色后，在自動顯影機中曝光、顯影。應用ImageJ軟件分析各組細胞中CyclinD1蛋白相對表達量。

1.2.5統(tǒng)計分析計量資料采用x±s表示，運用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析。p＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2結果

2.1塞來昔布對肝星狀細胞增殖的影響

通過MTT法分析塞來昔布對肝星狀細胞增殖的影響。與正常組比較，PDGF刺激12h、24h及48h后，模型組的OD值均顯著增加（p＜0.05）；加入不同濃度（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）塞來昔布處理后，治療組的OD值較模型組顯著降低（p＜0.05），見表1。

2.2塞來昔布對I、III型膠原蛋白分泌的影響

用放射免疫法檢測I、III型膠原蛋白含量法來分析塞來昔布對膠原蛋白分泌的影響。與正常組比較，模型組的I、III型膠原顯著增加（p＜0.05）；與模型組比較，治療組的I、III型膠原顯著降低（p＜0.05），見表2、圖1。

2.3塞來昔布對CyclinD1蛋白表達的影響

通過WesternBlot法檢測塞來昔布對CyclinD1蛋白表達的影響，結果顯示，與正常組比較，模型組的CyclinD1蛋白表達顯著增加（p＜0.05）；與模型組比較，治療組（20μmol/L）的CyclinD1蛋白表達顯著降低（p＜0.05），見圖2a、圖2b。

3討論

肝星狀細胞在TGF-β等細胞因子的刺激作用下活化后發(fā)生表形轉化，在PDGF等的刺激作用下不斷增殖和分泌以I、III型膠原蛋白為主的細胞外基質[6-7]。I、III型膠原蛋白的大量分泌和降解減少導致細胞外基質在肝臟內不斷沉積，引起肝小葉結構重建，最終發(fā)展為肝硬化。因此，抑制肝星狀細胞的增殖和膠原分泌在抗肝纖維化中具有重要作用。

PDGF是一種能夠顯著刺激細胞增殖的細胞因子。在各種損傷因素的作用下，肝細胞、巨噬細胞（Kupffercell）等細胞可釋放大量的PDGF等細胞因子[8-9]，促使靜息狀態(tài)的肝星狀細胞活化為肌成纖維樣細胞，并且不斷增殖和分泌I、III型膠原蛋白。該實驗中，選擇PDGF刺激肝星狀細胞增殖造模，在PDGF的刺激作用下，模型組肝星狀細胞的增殖數量較正常組顯著增加，并且分泌的I、III型膠原蛋白數量也較正常組顯著增加，說明PDGF刺激肝星狀細胞造模成功。

塞來昔布是一種選擇性的環(huán)氧化酶2（COX-2）抑制劑，在臨床上廣泛用于解熱鎮(zhèn)痛作用。塞來昔布可以通過COX-2依賴和非依賴途徑參與疼痛、炎癥反應、細胞增殖、血管增生、腫瘤發(fā)生等重要生理和病理過程的調節(jié)[10]。研究表明，慢性肝纖維化病人肝臟組織上調表達COX-2，使用C0X-2抑制劑塞來昔布可以降低COX-2表達水平[11-12]。在實驗中，MTT結果表明塞來昔布可以顯著抑制經PDGF刺激的肝星狀細胞增殖，說明塞來昔布可能通過抑制肝星狀細胞的增殖來發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

I、III型膠原是肝纖維化形成過程中的起主要作用的細胞外基質，I、III型膠原蛋白的合成增加，降解減少是肝纖維化形成的基礎。抑制I、III型膠原蛋白的合成能夠發(fā)揮抗肝纖維化的作用。各種抗肝纖維化藥物都可以不同意程度的抑制肝臟內I、III型膠原蛋白的分泌。研究結果表明，塞來昔布可以顯著降低肝星狀細胞分泌I、III型膠原蛋白。因此，塞來昔布可以通過抑制肝星狀細胞分泌膠原蛋白發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

細胞的增殖是受細胞周期蛋白（Cyclins），細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子（CKIs）等細胞周期調節(jié)因子調控的精細過程[13]。細胞周期蛋白包括CyclinD、CyclinE等，它們是細胞通過G1/S期檢查點的必須調節(jié)者，它們與相應的CDK結合形成CyclinD1-CDK4、CyclinE-CDK2等復合物后，磷酸化Rb蛋白，釋放轉錄因子E2F，啟動細胞增殖相關基因的轉錄，推動細胞通過限制點從G1期進入S期，進而促進細胞增殖[14]。當細胞周期蛋白CyclinD和CyclinE的表達受抑制時，細胞的增殖受阻。在塞來昔布可以顯著抑制經PDGF刺激的肝星狀細胞增殖的基礎上，進一步研究塞來昔布抑制肝星狀細胞增殖的機制。酶聯免疫研究結果顯示，塞來昔布顯著抑制CyclinD和CyclinE的表達，表明塞來昔布可能通過抑制CyclinD和CyclinE的表達來調控肝星狀細胞的增殖。

研究表明塞來昔布可以通過激活ERK/MAPK信號通路，抑制血管緊張素II誘導心肌細胞肥大[15]。塞來昔布可以激活PI3K/AKT信號通路抑制人肺腺癌細胞增殖[16]。此外，塞來昔布也可以抑制選擇性環(huán)氧化酶2、受體型酪氨酸磷酸酶J的表達[17]。因此，塞來昔布可以通過多靶點調節(jié)信號通路，研究表明塞來昔布可以下調肝星狀細胞CyclinD1表達、降低I、III型膠原蛋白分泌。但是，有關塞來昔布抑制肝星狀細胞的增殖和分泌的具體信號通路尚不清晰，仍有待進一步研究。

總之，該研究結果表明塞來昔布可能通過下調CyclinD1蛋白表達抑制肝星狀細胞的增殖和分泌膠原發(fā)揮抗肝纖維化的作用。但是，有關塞來昔布抑制肝星狀細胞的增殖和分泌的具體信號通路仍有待進一步研究。

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CelecoxibInhibitstheProliferationandCollagenSecretionofHepatic

StellateCellsThroughDown-regulationofCyclinD1Expression

LIWenhao，LIAOTing，HUANGJiaming

（DepartmentofGastroenterology，GanzhouPeople'sHospital，Ganzhou，Jiangxi，341000，China）

ABSTRACTObjectiveTodiscusstheroleofcelecoxiontheanti-fibrosisthroughobservationoftheeffectofcelecoxiontheproliferationandcollagensecretionofhepaticstellatecells.MethodHepaticstellatecellswereculturedinvitroanddividedintonormalgroup，modelgroupandtreatmentgroup.ModelgroupcellswerestimulatedwithPDGF，treatmentgroupcellswerestimulatedwithPDGFandthentreatedwithcelecoxib.MTTwasusedtodetecttheproliferationofHSC，radioimmunoassaywasusedtoanalysethesecretionofcollagenIandIII.WesternBlotwasusedtodetecttheexpressionofCyclinD1.ResultPDGFsignificantlystimulatedthegrowthofHSCandsecretionofcollagenIandIII.CelecoxibnotonlydramaticallyinhibitedthegrowthofHSCstimulatedbyPDGF，butalsoreducedthesecretionofcollagenIandIII.CelecoxibreducedtheexpressionofCyclinD1inhepaticstellatecell.ConclusionCelecoxibmaybeexertanti-fibrosiseffectthroughdown-regulationofCyclinD1expressionandinhibitionofHSCgrowthandcollagensecretion.

KEYWORDScelecoxib；hepaticstellatecell；hepaticfibrosis；cellproliferation；collagenprotein

（責任編輯胡安娜）