摘要：目的研究慢性乙型肝炎患者肝組織鐵的表達(dá)及分布，并在體外細(xì)胞初步探討鐵代謝異常在乙肝病毒感染慢性化中的作用機(jī)制。方法以普魯氏藍(lán)鐵染色檢測27例不同程度的慢性乙型肝炎（CHB）患者及3例非CHB患者肝組織鐵表達(dá)情況并分析肝組織中鐵的表達(dá)與CHB嚴(yán)重程度的關(guān)系；比較分析HepG2細(xì)胞和含有完整的HBV病毒顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)和上清中鐵代謝相關(guān)指標(biāo)含量的差異；運(yùn)用檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞，熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞上清HBV-DNA的水平，化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg含量。結(jié)果普魯氏藍(lán)鐵染色結(jié)果顯示，CHB患者肝組織中鐵的表達(dá)量顯著高于非CHB患者肝組織，且與肝臟炎癥等級呈顯著正相關(guān)；HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)及上清液中鐵蛋白的含量顯著高于HepG2細(xì)胞（p＜0.01）；檸檬酸鐵可促進(jìn)HepG2.2.15分泌HBV-DNA及乙肝抗原的表達(dá)。結(jié)論HBV感染可誘導(dǎo)肝組織的鐵沉積，引起鐵代謝紊亂；而鐵可促進(jìn)HBV的復(fù)制及抗原的分泌。

關(guān)鍵詞：乙肝病毒，炎癥，鐵沉積，鐵蛋白

中圖分類號：R575.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9545（2023）02-0095-（05）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.02.020

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）是一種嗜肝性病毒，通過與肝細(xì)胞上特異性受體結(jié)合，進(jìn)入肝細(xì)胞完成病毒復(fù)制的同時(shí)，引起局部肝組織免疫炎癥與損傷，部分患者肝臟在持續(xù)炎癥處理下，逐步發(fā)展為慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[1-2]。據(jù)估，現(xiàn)階段約有2.57億人攜帶HBV病毒并呈慢性感染，每年死亡人數(shù)高達(dá)100萬，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[3]。目前研究認(rèn)為，HBV感染與宿主相互作用關(guān)系決定HBV感染結(jié)局，研究表明[4-5]，CHB患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞耗竭或功能下降是維持肝細(xì)胞內(nèi)HBV持續(xù)復(fù)制和感染慢性化的重要機(jī)制之一。

鐵是維持人體正常生命活動(dòng)的基本元素之一，在造血細(xì)胞生成、氧化代謝轉(zhuǎn)化和基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制中扮演重要角色。近年來，國內(nèi)外研究報(bào)道器官或組織內(nèi)鐵含量過多，出現(xiàn)鐵過載現(xiàn)象，能通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧自由基繼而發(fā)生局部炎癥反應(yīng)[6-7]。Sebastiani團(tuán)隊(duì)[8]發(fā)現(xiàn)意大利HBV感染患者肝臟較易出現(xiàn)鐵過載，但與HDV合并感染患者肝臟鐵過載更為嚴(yán)重；無獨(dú)有偶，我國學(xué)者M(jìn)ao等研究證實(shí)[9]，相較健康人群，HBV感染患者血清鐵蛋白含量顯著升高且與肝臟炎癥呈正相關(guān)。盡管國外報(bào)道HBV感染患者肝組織鐵沉積情況，但關(guān)于我國HBV患者肝組織鐵沉積研究報(bào)道卻較為鮮見。為此，該研究擬以普魯氏藍(lán)鐵染色方法分析CHB患者肝組織鐵沉積情況；在此基礎(chǔ)上，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究肝細(xì)胞內(nèi)鐵與HBV相互作用在病毒感染慢性化中的可能機(jī)制。

1研究對象和方法

1.1研究對象

收集2016年1月-2018年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院患者肝組織穿刺標(biāo)本30例，分別來自27例確診的CHB患者和3例非CHB患者。CHB臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會和肝病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》，患者均已知情同意。

1.2試劑與儀器

HepG2和HepG2.2.15由安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生化檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室保存；普魯士藍(lán)染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司；鐵和鐵蛋白測定試劑盒購自德國西門子；兔抗人鐵蛋白抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔IgG（FITC）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；檸檬酸鐵購自美國Sigma公司；HBV核酸提取試劑盒購自上海復(fù)星醫(yī)藥公司；HBsAg和HBeAg檢測發(fā)光試劑盒購自瑞士羅氏公司。熒光顯微鏡（BA410E）購自Motic；全自動(dòng)蛋白分析儀（BNProSpec）購自德國西門子公司；電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀（Cobase601）購自瑞士羅氏公司；熒光定量PCR儀（Mx3000P）購自美國AgilentStrataGene公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與爬片制作HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并制作細(xì)胞爬片，具體方法如下：將24mm的專用細(xì)胞爬片置于6孔板中，以1×10⁵/孔的細(xì)胞濃度接種傳代生長良好的細(xì)胞，待細(xì)胞80%融合時(shí)，改為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，倒去培養(yǎng)基，PBS洗滌蓋玻片3次，預(yù)冷的4%多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。

1.3.2普魯士藍(lán)染色分析鐵在肝組織中的沉積選取肝組織切片（4μm），經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蒸餾水水化后與普魯士藍(lán)鐵染色：PBS清洗石蠟片1min，與滴加新鮮配置的5%鹽酸與5%亞鐵氰化鉀等體積混合液，常溫孵育染30min，蒸餾水充分沖洗5min后加入核固紅染色液復(fù)染細(xì)胞核10min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，鏡檢拍照。

1.3.3細(xì)胞免疫熒光分析鐵蛋白在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)將固定好的細(xì)胞爬片用0.5%TritonX-100室溫通透20min；PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min；PBS浸洗玻片3次，滴加1∶200的兔抗人鐵蛋白抗體，37℃孵育1h；PBS浸洗玻片3遍，加入3%BSA稀釋的熒光二抗，37℃避光孵育20min；滴加1ug/mLDAPI避光復(fù)染5min，PBS沖洗3次；抗熒光猝滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.4HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBVDNA和乙肝抗原的檢測收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測HBsAg和HBeAg的含量，運(yùn)用熒光定量PCR試劑盒檢測上清液中HBVDNA的含量，操作步驟均按配套試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

該研究數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1慢性乙型肝炎患者（CHB）肝組織鐵沉積

肝組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，非CHB人群肝組織無鐵沉積，CHB患者肝組織出現(xiàn)明顯鐵沉積，呈彌散性分布；隨著肝臟炎癥和纖維化等級的升高，肝臟鐵沉積程度顯著上升，詳見圖1。

2.2HBV感染影響肝細(xì)胞鐵代謝

HepG2.2.15細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV全基因組的HepG2，也是常用的HBV感染細(xì)胞模型。通過分析HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清鐵代謝相關(guān)指標(biāo)，以研究HBV感染對肝細(xì)胞鐵代謝的影響。結(jié)果顯示，相較于HepG2細(xì)胞，HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清中鐵蛋白含量明顯升高（plt;0.001），細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白含量也較HepG2細(xì)胞升高，見圖2。

2.3鐵促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制及抗原分泌

為進(jìn)一步探討HBV與鐵的相互作用，運(yùn)用檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞，以研究鐵對HBV復(fù)制及抗原分泌的影響。結(jié)果顯示，未處理的HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV-DNA含量為（5.66±0.31）IU/ml，而經(jīng)檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞上清液中HBV-DNA含量為（6.77±0.35）IU/ml，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣經(jīng)檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞上清液中病毒抗原HBsAg和HBeAg也顯著升高，見圖3。

3討論

鐵是生命的必需元素，它是輔助因子、細(xì)胞色素和鐵和硫蛋白的一部分。盡管如此，鐵的生物學(xué)功能就像一把“雙刃劍”，鐵含量減少或鐵過量會導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)功能改變[10-11]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者血清血清鐵和鐵蛋白顯著增加，而血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平和總鐵結(jié)合力降低，推測該現(xiàn)象可能是由于病毒感染所致的肝細(xì)胞損傷繼而導(dǎo)致細(xì)胞釋放鐵增加[12]。另有報(bào)道[13]，HBV相關(guān)性慢加急性肝衰竭（hepatitisBvirus-relatedacuteonchronicliverfailure，HBV-ACLF）患者血清鐵蛋白升高與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示HBV-ACLF患者可能存在鐵沉積現(xiàn)象，并且這種鐵代謝異常可能參與HBV相關(guān)性肝病疾病進(jìn)程及進(jìn)展。然而，至今為止，關(guān)于鐵與HBV相關(guān)作用關(guān)系卻尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者肝組織存在明顯的鐵沉積，表明HBV慢性感染能誘導(dǎo)患者肝組織出現(xiàn)鐵沉積病理性改變，肝臟炎癥損傷和繼發(fā)肝纖維化是CHB疾病進(jìn)展的重要特征及標(biāo)志[14-15]。此外，進(jìn)一步分析肝臟鐵沉積程度與肝組織炎癥及纖維化等級的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著肝臟炎癥及纖維化等級的升高，肝臟鐵沉積程度顯著增加，該研究結(jié)果與Sebastiani等報(bào)道基本一致[16]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞兩種細(xì)胞模型，后者是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV全基因組的HepG2，因此能支持HBV復(fù)制并分泌病毒抗原HBsAg和HBeAg。有趣的是，鐵蛋白在HepG2.2.15細(xì)胞上清液中含量是HepG2細(xì)胞50倍，然而鐵離子卻在兩者細(xì)胞上清液中含量無顯著差異。鑒于鐵蛋白是反映機(jī)體鐵儲存的重要指標(biāo)之一，也是臨床監(jiān)測鐵代謝異常的常用檢測指標(biāo)，表明HBV感染并持續(xù)復(fù)制影響肝細(xì)胞內(nèi)鐵代謝穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致肝細(xì)胞可能出現(xiàn)鐵沉積，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證CHB患者肝臟鐵沉積與HBV感染密切相關(guān)。檸檬酸鐵是無血清培養(yǎng)基的可溶性鐵源，通過檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞，以模擬鐵沉積對HBV感染的肝細(xì)胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬酸鐵處理HepG2.2.15細(xì)胞24h后，細(xì)胞上清液中HBV-DNA及病毒抗原HBsAg和HBeAg含量顯著升高，提示鐵可以促進(jìn)肝細(xì)胞HBV復(fù)制及抗原分泌。據(jù)此，可以認(rèn)為CHB患者肝臟鐵沉積可能是維持HBV在肝細(xì)胞持續(xù)復(fù)制的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究HBV感染與肝臟鐵沉積的關(guān)系，初步揭示HBV感染能誘導(dǎo)肝臟鐵沉積，而鐵含量過多有利于HBV在肝細(xì)胞中持續(xù)復(fù)制，因此HBV感染與肝臟鐵沉積相互作用可能是治療CHB潛在靶點(diǎn)。

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APilotStudyontheMechanismofAbnormalIronMetabolism

intheChronicHepatitisBVirusInfection

PANYing YANGKai SUNBeibei

（1.AnhuiMedicalCollege，AnhuiHefei230601;2.TheSecondAffiliatedHospitalOfAnhuiMedicalUniversity，Hefei，Anhui230601，China）

ABSTRACTObjectiveTostudytheexpressionanddistributionofironinlivertissuesinpatientswithchronichepatitisB，andthemechanismofabnormalironmetabolisminthechronichepatitisBvirusinfectionwaspreliminarilydiscussedinvitrocells.MethodPerl'sPrussianBluestainwasusedtodetecttheironexpressioninthelivertissuesof27patientswithdifferentdegreesofchronichepatitisB（CHB）and3non-CHBpatients，andanalyzedtherelationshipbetweentheironexpressioninthelivertissuesandtheseverityofliverinflammation.Analysisofthecontentofironmetabolism-relatedindicatorsinHepG2cellsandHepG2.2.15cellscontainingintactHBVvirusparticlesandinthesupernatant.HepG2.2.15cellsweretreatedwithferriccitrate，thenthelevelofHBV-DNAinthecellsupernatantwasdetectedbyfluorescencequantitativePCR，andthesecretionofHBsAgandHBeAginthecellsupernatantwasdeterminedbyelectrochemiluminescence.ResultPerl'sPrussianBluestainshowedthattheexpressionofironinlivertissuesofCHBpatientswassignificantlyhigherthanthatofnon-CHBpatients，anditwassignificantlypositivelycorrelatedwiththegradeofliverinflammation；thecontentofferritininHepG2.2.15cellsandinthesupernatantwassignificanthigherthanHepG2cells（plt;0.001）；ferriccitratepromotedthelevelsofHBV-DNAandthesecretionofhepatitisBantigen.ConclusionHBVinfectioncaninduceirondepositioninlivertissuesandcauseironmetabolismdisorders；whileironcanpromoteHBVreplicationandantigensecretion.

KEYWORDSHepatitisBvirus；inflammation；irondeposition；ferritin

（責(zé)任編輯 胡安娜）