摘要： 鉀元素是植物生長發(fā)育過程中必需的主要礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有決定性影響，細(xì)胞內(nèi)K+含量水平在很大程度上受K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制。通過生物信息學(xué)方法從全基因組水平鑒定出蘿卜K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HAK/KUP/KT基因家族成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性、保守基序、染色體定位、啟動子順式作用元件、系統(tǒng)進(jìn)化及表達(dá)特性等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，鑒定出的17個蘿卜HAK/KUP/KT基因不均等地分布在蘿卜6條染色體及Scaffold00840上，根據(jù)與擬南芥的同源關(guān)系將其命名為RsHAK1～RsHAK17；RsHAKs基因結(jié)構(gòu)、保守基序、蛋白質(zhì)理化特性等均具有高度保守性，啟動子區(qū)域存在大量與環(huán)境因素、植物激素、逆境脅迫應(yīng)答等有關(guān)的順式作用元件；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，17個RsHAKs基因聚為4個亞家族，全基因組復(fù)制事件是RsHAKs基因擴(kuò)張的主要驅(qū)動力。轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR表達(dá)分析結(jié)果表明，除RsHAK5僅在蘿卜根部表達(dá)外，其他RsHAKs在蘿卜各器官及發(fā)育過程中均有特異性表達(dá)，且在高鉀滲透脅迫下在葉片中相對表達(dá)量顯著上調(diào)，RsHAK3、RsHAK9、RsHAK11和RsHAK12在根部呈現(xiàn)明顯的缺鉀誘導(dǎo)表達(dá)模式。研究結(jié)果為進(jìn)一步全面解析HAK/KUP/KT基因在蘿卜中的生物學(xué)功能以及提高蘿卜栽培品質(zhì)提供了一定理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 蘿卜；鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；基因家族；K+；表達(dá)分析

中圖分類號： S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0777-11

Identification and expression characteristics analysis of HAK/KUP/KT gene family in radish

CHENG Rui1，2， WANG Guo-lian1，2， SUN Yu-dong1，2， WANG Lin-chuang1，2， LUO De-xu1，2， WANG Wei1，2， ZHONG Xiu-juan1，2， ZHAO Jian-feng1，2

（1.Huaiyin Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Region of Jiangsu/Huaian Key Laboratory for Facility Vegetables， Huaian 223001， China;2.Huaiyin Normal University/Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology Around Hongze Lake， Huaian 223001， China）

Abstract： Potassium is one of the essential main mineral nutrient elements in the process of plant growth and development， and has a decisive impact on the yield and quality of crops. The level of intracellular K+ content is largely controlled by K+ transport proteins. Members of the radish K+ transport protein related HAK/KUP/KT gene family were identified from whole genome-wide level by bioinformatics methods， and the gene structure， protein properties， conserved motifs， chromosomal localization， promoter cis-acting elements， phylogenetic evolution and expression characteristics were analyzed. The results showed that the 17 radish HAK/KUP/KT genes were unequally distributed on six chromosomes and Scaffold00840， and were named RsHAK1-RsHAK17 according to their homology with Arabidopsis. The gene structure， conserved motifs， physicochemical properties of proteins of RsHAKs genes were highly conserved， and there were a large number of cis-acting elements related to environmental factors， plant hormones and responses to adversity stresses in the promoter region. Phylogenetic analysis showed that 17 RsHAKs genes clustered into four subfamilies， and whole genome-wide replication events were the main driver of the RsHAKs genes expansion. The results of transcriptome and qRT-PCR expression analysis showed that except for RsHAK5， which was only expressed in radish roots， other RsHAKs were specifically expressed in different organs and different development processes of radish， and the relative expression in leaves was significantly up-regulated under high potassium osmotic stress. RsHAK3， RsHAK9， RsHAK11 and RsHAK12 showed obvious expression patterns induced by potassium deficiency in roots. Overall， the results provide theoretical basis for further comprehensive analysis of the biological functions of HAK/KUP/KT gene and improving the cultivation quality of radish.

Key words： radish；potassium transport protein；gene family；K+；expression analysis

鉀元素是植物體內(nèi)新陳代謝所必需的主要礦質(zhì)營養(yǎng)之一，參與氣孔運(yùn)動、細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)和質(zhì)膜電位的維持等，在植物生長發(fā)育和抵御逆境脅迫中起重要作用[1-2]。植物吸收鉀離子（K+）有2套運(yùn)輸系統(tǒng)，即K+通道和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3-4]。HAK/KUP/KT（high-affinity K+/K+ uptake permease/K+ transporter）作為植物體內(nèi)最大的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在植物生長調(diào)控、養(yǎng)分代謝、逆境應(yīng)答等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5]。自1997年研究人員從大麥中克隆出第一個植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因HAK1[6]以來，迄今已有水稻[7]、小麥[8]、玉米[9]、大豆[10]、馬鈴薯[11]、油菜[12]、木薯[13]、番茄[14]、辣椒[15]、梨[16]、石榴[17]、香蕉[18]等作物通過全基因組分析鑒定出HAK/KUP/KT家族成員。HAK/KUP/KT基因一般含有10～15個跨膜區(qū)域，具有保守的K+轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（K+-trans）[19-20]，主要定位于細(xì)胞膜系統(tǒng)，在植物的根、莖、葉和果實(shí)等器官中均有表達(dá)[21]。已有研究結(jié)果表明，HAK/KUP/KT家族成員包含4個亞家族（Ⅰ～Ⅳ），每個亞家族均有較為保守的結(jié)構(gòu)和功能[7]。亞家族Ⅰ基因主要在根中表達(dá)，參與植物根系對環(huán)境中K+的吸收、運(yùn)輸[22-23]；亞家族Ⅱ基因主要參與植物的生長調(diào)節(jié)等生理過程[24]；亞家族Ⅲ和Ⅳ的功能研究報道較少[16]。

蘿卜（Raphanus sativus L.）是重要的十字花科蔬菜之一，其營養(yǎng)豐富，藥用價值高，被譽(yù)為“小人參”，在中國蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。中國是世界第一蘿卜種植大國，栽培面積近1.2×106 hm2，約占世界蘿卜栽培總面積的40%[25]。鉀元素對果蔬品質(zhì)的形成具有重要影響，然而，尚不清楚蘿卜對鉀的吸收利用機(jī)制。目前，HAK/KUP/KT在多種園藝作物中已有報道，但在全基因組水平對蘿卜HAK/KUP/KT基因的鑒定和分析未見報道。蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫的公布和不斷完善[26-27]為在全基因水平鑒定和分析蘿卜HAK/KUP/KT基因提供了重要基礎(chǔ)。本研究對蘿卜基因組中的HAK/KUP/KT基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特征、保守基序、染色體定位、啟動子順式作用元件、系統(tǒng)進(jìn)化及表達(dá)特性等進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究蘿卜HAK/KUP/KT基因家族成員的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蘿卜HAK/KUP/KT家族成員的鑒定

蘿卜基因組數(shù)據(jù)信息從已公布的蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//radish-genome.org）中獲取[28]。擬南芥和水稻的HAK/KUP/KT家族基因編碼的蛋白序列分別從擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（http：//www.arabidopsis.org）、水稻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中獲得。以擬南芥13個HAK/KUP/KT蛋白序列作為靶序列，在蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTP比對，篩選閾值為1×e-10，初步獲得蘿卜HAK/KUP/KT基因家族候選成員。采用ORF（Open Reading Frame，開放閱讀框）Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對候選基因序列ORF的完整性進(jìn)行分析，剔除沒有完整ORF的基因；進(jìn)一步通過Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進(jìn)行K+轉(zhuǎn)運(yùn)保守結(jié)構(gòu)域（PF02705）驗(yàn)證，并利用NCBI數(shù)據(jù)中CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件復(fù)篩，最終確定蘿卜HAK/KUP/KT家族成員，并統(tǒng)一使用RsHAK進(jìn)行命名。

1.2 蘿卜RsHAK蛋白理化特性及基因序列特征分析

利用在線軟件Expasy（http：//www.expasy.org）對蘿卜RsHAK蛋白序列的相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性（GRAVY）等進(jìn)行分析；利用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）對蘿卜RsHAK進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用軟件TMHMM Server.2.0（http：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ TMHMM-2.0）進(jìn)行RsHAKs跨膜結(jié)構(gòu)域分析；利用在線軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/tools/meme）分析蘿卜RsHAKs蛋白保守基序（Motif）[29]，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和Pfam數(shù)據(jù)庫對Motif序列進(jìn)行注釋分析。

染色體信息從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫獲得，蘿卜RsHAKs基因染色體定位圖利用軟件TBTools繪制[30]。基因內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分布利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進(jìn)行分析[31]。啟動子序列信息以起始密碼子上游2 000 bp的核酸序列進(jìn)行分析，利用PLACE平臺（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）進(jìn)行預(yù)測[32]。

1.3 蘿卜RsHAK系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及基因復(fù)制事件分析

利用軟件CLUSTALW和MEGA 7.0對蘿卜、擬南芥和水稻HAK/KUP/KT蛋白進(jìn)行多重比對，基于鄰接法（Neighbor-joining method，NJ method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)定為1 000。使用MCScanX軟件識別RsHAK基因的重復(fù)事件[33-34]。

Ka（非同義替換率）、Ks（同義替換率）和Ka/Ks值使用KaKs_Calculator 2.0軟件進(jìn)行計(jì)算[35]，并利用K值預(yù)算復(fù)制事件發(fā)生的時期（T）（T=Ks/2λ）[34]。本研究中，我們假設(shè)蘿卜同義替換的λ值為5.9×10-9[26-28]。

1.4 蘿卜RsHAK時空表達(dá)分析

為分析RsHAK在蘿卜生長發(fā)育過程中及各器官中的表達(dá)模式，從已公布的蘿卜參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)RNA-seq數(shù)據(jù)。每個RsHAK基因的表達(dá)水平通過FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）方法表示。RsHAKs基因時空表達(dá)熱圖利用R包pheatmap進(jìn)行分析繪制。

1.5 RsHAK在缺鉀和高鉀脅迫下的表達(dá)模式分析

以江蘇淮安地方蘿卜品種紫芽青為試驗(yàn)材料。使用50孔穴盤進(jìn)行育苗，待幼苗生長至2～3張真葉時，選取長勢相對一致的蘿卜幼苗，用清水小心沖洗根部基質(zhì)，開始水培。每7 d換１次營養(yǎng)液，調(diào)整pH值為7.0±0.1，采用改良的Hoagland營養(yǎng)液配方進(jìn)行水培[16，36]，以K+濃度0 mmol/L為缺K+處理，以3倍K+濃度（18 mmol/L）高滲Hoagland營養(yǎng)液為高K+脅迫處理，并保持氮、磷等其他營養(yǎng)元素一致，具體試驗(yàn)方法參照Wang等[16]的方法。處理15 d后分別收集蘿卜根部和葉片樣品備用。采用Trizol法提取樣品總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA?；虻奶禺愐铮ū?）利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫在線軟件Primer designing tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)，其中，RsHAK14和RsHAK15的編碼區(qū)序列完全一致，無法設(shè)計(jì)特異性引物。利用熒光定量PCR技術(shù)分析RsHAKs在正常培養(yǎng)、缺K+和高K+脅迫條件下，在紫芽青蘿卜地上部分及地下部分的相對表達(dá)量，試驗(yàn)具體參數(shù)參考孫小川等[25]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜RsHAK基因家族鑒定及理化特性分析

在蘿卜RsHAK基因家族中共鑒定出17個RsHAKs基因，通過NCBI和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證后，根據(jù)與擬南芥HAK/KUP/KT家族成員之間的同源關(guān)系將蘿卜RsHAK基因分別命名為RsHAK1～RsHAK17（表2）。17個RsHAKs基因分布在蘿卜染色體2、染色體3、染色體4、染色體6、染色體7、染色體8、染色體9和Scaffold00840（基因支架）上（圖1），具有高度保守性，均具有13～14個跨膜區(qū)，編碼區(qū)序列（CDS）長度為2 148～2 598 bp，編碼氨基酸數(shù)為715～865 aa，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為79 490～96 330，理論等電點(diǎn)為5.19～8.97，53%的成員為酸性蛋白質(zhì)；亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，除RsHAK2、RsHAK10、RsHAK11分布在液泡膜上外，其余RsHAK主要定位于質(zhì)膜上（表2）。此外，RsHAK14和RsHAK15的編碼區(qū)長度和蛋白質(zhì)序列長度完全一致，且位于2號染色體相鄰位置（圖1），來自于串聯(lián)復(fù)制事件。

2.2 蘿卜RsHAK系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

為研究蘿卜RsHAK的進(jìn)化關(guān)系，選擇與擬南芥、水稻HAK/KUP/KT共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，3個物種的HAK/KUP/KT可以聚為4個亞家族（Ⅰ～Ⅳ）；RsHAK主要分布在亞家族Ⅱ（6個）、亞家族Ⅲ（6個）、亞家族Ⅳ（4個），亞家族Ⅰ中僅含有RsHAK5?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，RsHAK基因結(jié)構(gòu)高度保守，除RsHAK5（9 434 bp）外，基因序列全長集中在3 030～4 497 bp，大部分含有7～10個外顯子（圖3）。其中，RsHAK16和RsHAK5含有較長的內(nèi)含子，尤其是RsHAK5， 可能為更古老的基因。保守基序分析確定了10個Motif為蘿卜RsHAK蛋白重要保守基序，這些Motif在RsHAK蛋白中均有分布，可能對RsHAK蛋白功能起重要作用（圖3）。

2.3 蘿卜RsHAK基因家族的擴(kuò)張

為確定蘿卜RsHAK基因的擴(kuò)張模式，從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫中提取染色體位置信息（圖1）。RsHAK基因家族成員中16個位于染色體，1個位于Scaffold00840。蘿卜3號、7號和9號染色體各包含1個RsHAK基因；4號和8號染色體各有2個RsHAK基因；6號染色體有3個RsHAK基因；2號染色體包含6個RsHAK基因。RsHAK在2號染色體（RsHAK14和RsHAK15）、4號染色體（RsHAK13和RsHAK16）上各有１對發(fā)生過串聯(lián)復(fù)制的基因?qū)?，表明蘿卜RsHAK家族基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了少量的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象。利用MCScanX軟件對蘿卜RsHAK基因進(jìn)行擴(kuò)張模式分析，結(jié)果顯示，蘿卜RsHAK基因有9個成員彼此間（11對）存在共線性關(guān)系（表3），表明蘿卜RsHAK基因家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了大量的基因復(fù)制現(xiàn)象，是蘿卜RsHAKs基因多樣性的主要驅(qū)動力。共線性基因?qū)Φ腒a和Ks計(jì)算結(jié)果（表3）表明，所有基因?qū)Φ腒a/Ks比值均lt;1.000 0，說明純化選擇在RsHAK基因擴(kuò)張過程中起主要作用。利用公式T=Ks/2λ計(jì)算RsHAKs基因?qū)χ貜?fù)事件的演化時間，結(jié)果表明，蘿卜RsHAK基因家族全基因組復(fù)制事件發(fā)生在5.55×106～10.90×106年前。

2.4 蘿卜RsHAK啟動子序列分析

基因的啟動子元件通過基因上游2 kb序列進(jìn)行分析，利用PLACE數(shù)據(jù)庫（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）對17個RsHAK基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行鑒定和分類。共鑒定出154個長度大于4 bp的順式作用元件，RsHAK基因啟動子區(qū)域除存在大量基本啟動子元件CAAT-box外，大多數(shù)RsHAK基因的啟動子包含多種與生長發(fā)育及抗性相關(guān)的調(diào)控元件，如光響應(yīng)、ABA（脫落酸）響應(yīng)、MeJA（茉莉酸甲酯）響應(yīng)、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等涉及光周期、對植物激素響應(yīng)及對環(huán)境壓力應(yīng)答的調(diào)控元件（表4）。結(jié)果表明，蘿卜RsHAK基因不僅參與K+吸收代謝，還在植株生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

2.5 蘿卜RsHAK家族基因表達(dá)模式及缺鉀/高鉀脅迫響應(yīng)分析

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，以FPKM值代表基因表達(dá)量對蘿卜中RsHAK基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并以此繪制相對表達(dá)量熱圖（圖4）。結(jié)果表明，除RsHAK14和RsHAK15外，其他15個基因在蘿卜根、葉、花等器官及各發(fā)育階段中均有表達(dá)（圖4）。RsHAK1主要在蘿卜成熟葉（播種后第28 d）中表達(dá)，RsHAK2主要在雌蕊中表達(dá)，RsHAK3、RsHAK5、RsHAK10和RsHAK13主要在根中表達(dá)。說明，RsHAK家族成員在蘿卜生長發(fā)育過程中及不同組織中表達(dá)存在特異性，可能在多個發(fā)育階段發(fā)揮多種調(diào)控作用。

通過qRT-PCR進(jìn)一步分析17個RsHAKs基因在K+缺失和K+高滲脅迫條件下的表達(dá)模式，結(jié)果（圖 5）顯示，RsHAK在缺K+和高K+脅迫下，地上部和地下部呈現(xiàn)出表達(dá)特異性。除RsHAK5僅在蘿卜根部組織中有表達(dá)外，其他RsHAKs基因在地上和地下部均有表達(dá)。RsHAK5在缺K+和高K+脅迫下在根部的相對表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)，在缺K+環(huán)境中更為顯著。RsHAK1、RsHAK2、RsHAK4和RsHAK17主要在蘿卜葉片中表達(dá)，其中，RsHAK2、RsHAK4和RsHAK17呈顯著的高K+脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)模式，其在葉片中的相對表達(dá)量在高K+脅迫處理下顯著上調(diào)；RsHAK3和RsHAK6～RsHAK16在蘿卜根和葉中均有較豐富的表達(dá)，RsHAK3、RsHAK6在缺K+和高K+處理下在葉中的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，且對高K+脅迫的響應(yīng)更顯著，而在根中的表達(dá)則受高K+脅迫抑制，僅在缺K+環(huán)境中上調(diào)表達(dá)；RsHAK9、RsHAK11、RsHAK12在缺K+環(huán)境中根部相對表達(dá)量顯著上調(diào)，而在高K+環(huán)境中葉部相對表達(dá)量顯著上調(diào)，RsHAK7、RsHAK8、RsHAK9、RsHAK14/RsHAK15在葉片中的相對表達(dá)量更易受高K+脅迫誘導(dǎo)。以上結(jié)果表明，不同RsHAK在蘿卜K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程及抗逆作用中發(fā)揮的功能可能存在較大差異，具有不同的分工。

3 討論與結(jié)論

HAK/KUP/KT基因家族作為植物體內(nèi)最大的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在植物生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、抵御逆境等過程中發(fā)揮重要作用，迄今已在多種作物中被鑒定，但在蘿卜中尚未見報道。本研究中，我們從蘿卜全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出17個RsHAK基因，蘿卜RsHAKs基因數(shù)量與擬南芥（13個）[22]、番茄（19個）[14]和桃（16個）[37]等相近，但低于水稻（27個）[7]、玉米（27個）[9]、大豆（29個）[10]、梨（27個）[16]等。將蘿卜RsHAK與擬南芥、水稻進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示聚為4個亞家族；RsHAKs基因主要分布在亞家族Ⅱ中，與水稻[7]相似。亞家族I中的成員，如擬南芥中的AtHAK5[22]、水稻中的OsHAK1[7]等都被報道與根系高親和力K+吸收有關(guān)，該亞家族中的RsHAK5基因可能在蘿卜根系中對K+具有高親和力。亞家族Ⅱ中的成員被報道主要參與了植物發(fā)育過程[38]，本研究中RsHAK1～RsHAK3和RsHAK9～RsHAK11分布在亞家族Ⅱ中，可能在蘿卜生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。蘿卜RsHAK基因家族編碼的氨基酸為715～865 aa，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為79 490～96 330，理論等電點(diǎn)為5.19～8.97，基因序列長度、內(nèi)含子/外顯子數(shù)目、保守基序類型及數(shù)量、跨膜結(jié)構(gòu)域等存在高度保守性，也是蘿卜RsHAK呈現(xiàn)高度保守性的重要原因，這些結(jié)果為研究蘿卜RsHAK基因功能奠定了基礎(chǔ)。

前人研究結(jié)果表明，HAK/KUP/KT基因家族并不只是簡單地介導(dǎo)了土壤中初級K+的吸收，還參與了植株的生長發(fā)育、抗逆調(diào)控等過程。擬南芥AtKUP2突變被證明會導(dǎo)致胚軸變短[39]，敲除AtKT3會導(dǎo)致根部根毛增加[40]。K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因還可能參與了鹽脅迫調(diào)控，如擬南芥中的AtHAK1、AtHAK2、AtHAK6 [41]等；部分水稻OsHAKs參與了激素調(diào)控，如OsHAK7、OsHAK8參與萘乙酸調(diào)控，OsHAK16參與赤霉素調(diào)控，OsHAK17、OsHAK27參與了萘乙酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素代謝等[7]。本研究在RsHAKs基因上游啟動子序列中發(fā)現(xiàn)了一系列參與光周期和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、植物激素反應(yīng)、應(yīng)答逆境脅迫等的順式作用元件。在這些調(diào)控元件中，光響應(yīng)元件Box-4分布在鑒定出的17個RsHAK基因中，大多數(shù)RsHAK基因的啟動子區(qū)域還包含G-box和AE-box等與光周期和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件。另外，啟動子區(qū)還包含：低溫響應(yīng)元件（LTR）；植物激素響應(yīng)元件TGACG（茉莉酸甲酯）、CGTCA（茉莉酸甲酯）、TGA（生長素）；干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件MBS等。上述結(jié)果說明，RsHAKs在光周期、激素調(diào)節(jié)、低溫響應(yīng)、抵抗干旱等方面起重要作用。

土壤溶液中的K+濃度通常在0.000 001%～0.000 200%[42]。因此，K+缺乏是植物必須面對的一種常見的非生物脅迫［43］，但由于近年來化肥的大量不合理施用，導(dǎo)致部分農(nóng)耕地出現(xiàn)鹽漬化等問題。HAK/KUP/KT基因?qū)+的吸收利用及非生物脅迫響應(yīng)均具有重要作用，本研究利用qRT-PCR分析了蘿卜幼苗在缺鉀和高鉀處理下的表達(dá)模式，以此篩選和鑒定可能在缺鉀和高鉀脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的RsHAK基因。結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹中唯一聚類在亞家族Ⅰ中的RsHAK5僅在蘿卜根中表達(dá)，且受到缺鉀和高鉀脅迫抑制；進(jìn)一步驗(yàn)證了HAK/KUP/KT基因家族亞家族Ⅰ中基因主要在根中表達(dá)，參與植物根系對環(huán)境中K+的吸收和運(yùn)輸[22-23]。與AtKUP6、AtKUP8同源的RsHAK8、RsHAK9、RsHAK10在缺鉀脅迫下在根中的相對表達(dá)量上調(diào)，且在高鉀環(huán)境下葉片中的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，擬南芥AtKUP6、AtKUP8已被驗(yàn)證參與根部K+的流出[44]，推測RsHAK8、RsHAK9、RsHAK10可能參與蘿卜根部的K+轉(zhuǎn)運(yùn)。RsHAK3與AtKUP3同源，而后者由K+饑餓強(qiáng)烈誘導(dǎo)[45]，RsHAK3在低鉀環(huán)境中葉片和根中的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)，證實(shí)RsHAK3也存在K+饑餓誘導(dǎo)表達(dá)模式。序列相似的直系同源蛋白質(zhì)通常具有相似的功能，本研究中RsHAKs基因表達(dá)模式與前人研究結(jié)果基本一致，說明HAK/KUP/KT基因家族在不同物種中具有高度保守性。

參考文獻(xiàn)：

[1] ASHLEY M K， GRANT M， GRABOV A. Plant responses to potassium deficiencies： a role for potassium transport proteins[J]. J Exp Bot， 2006， 57（2）： 425-436.

[2] MAATHUIS F J， SANDERS D. Plasma membrane transport in context — making sense out of complexity[J]. Curr Opin Plant Biol， 1999， 2（3）：236-243.

[3] MAATHUIS F J， SANDERS D. Mechanism of high-affinity potassium uptake in roots of Arabidopsis thaliana[J]. PNAS，1994， 91（20）： 9272-9276.

[4] MAATHUIS F J， SANDERS D. Regulation of K+ absorption in plant root cells by external K+： interplay of different plasma membrane K+ transporters[J]. J Exp Bot，1997， 48：451-458.

[5] LI W H， XU G H， ALLI A， et al. Plant KT/HAK/KUP K+ transporters： function and regulation[J]. Seminars in Cell and Developmental Biology， 2018， 74：133-141.

[6] SANTA-MARIA G E， RUBIO F， DUBCOVSKY J， et al. The HAK1 gene of barley is a member of a large gene family and encodes a high-affinity potassium transporter[J]. Plant Cell， 1997， 9（12）： 2281-2289.

[7] GUPTA M， QIU X， WANG L， et al. KT/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice （Oryza sativa） [J]. Molecular Genetics and Genomics， 2008， 280（5）： 437-452.

[8] 吳勝男， 楊 媛， 李英壯， 等. 小麥KUP/HAK/KT基因家族的全基因組鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2021， 30（3）： 351-364.

[9] ZHANG Z， ZHANG J， CHEN Y， et al. Genome-wide analysis and identification of HAK potassium transporter gene family in maize （Zea mays L.） [J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（8）： 8465-8473.

[10]晁毛妮，溫青玉，張晉玉，等. 大豆KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族的鑒定與表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報， 2017， 37（2）： 239-249.

[11]許賽賽，張 博，仲 陽，等. 馬鈴薯HAK/KUP/KT基因家族鑒定與表達(dá)分析[J].分子植物育種， 2021， 19（12）： 3878-3886.

[12]朱 樂，趙鑫澤，蔣立希. 甘藍(lán)型油菜鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體HAK/KUP/KT家族的全基因組鑒定與分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2021， 47（3）： 303-313.

[13]OU W， MAO X， HUANG C， et al. Genome-wide identification and expression analysis of the KUP family under abiotic stress in Cassava （Manihot esculenta Crantz） [J]. Front Physiol， 2018， 9： 17.

[14]HYUN T K， RIM Y， KIM E， et al. Genome-wide and molecular evolution analyses of the KT/HAK/KUP family in tomato （Solanum lycopersicum L.） [J]. Genes amp; Genomics， 2014， 36（3）： 365-374.

[15]MARTINEZ-CORDERO M A， MARTINEZ V， RUBIO F. Cloning and functional characterization of the high-affinity K+ transporter HAK1 of pepper[J]. Plant Mol Biol， 2004， 56（3）： 413-421.

[16]WANG Y Z， LV J H， CHEN D， et al. Genome-wide identification， evolution， and expression analysis of the KT/HAK/KUP family in pear[J]. Genome， 2018， 61（10）： 755-765.

[17]趙建榮，楊 圓，秦改花，等. 石榴HAK/KUP/KT家族基因鑒定及鉀轉(zhuǎn)運(yùn)功能分析[J].園藝學(xué)報， 2022， 49（4）： 758-768.

[18]金龍飛，張安妮，滕夢鑫，等. 香蕉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體HAK/KUP/KT家族鑒定及其在果實(shí)發(fā)育和低鉀脅迫下的表達(dá)分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2022， 50（2）： 30-36.

[19]RUBIO F， GUILLERMO E S， ALONSO R N. Cloning of Arabidopsis and barley cDNAs encoding HAK potassium transporters in root and shoot cells[J]. Physiologia Plantarum， 2010， 109（1）： 34-43.

[20]GOMEZ-PORRAS J L， RIAO-PACHóN D M， BENITO B， et al. Phylogenetic analysis of K+ transporters in bryophytes， lycophytes， and flowering plants indicates a specialization of vascular plants[J]. Frontiers in Plant Science， 2012， 3：167.

[21]柴薇薇，王文穎，崔彥農(nóng)，等. 植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KUP/HAK/KT家族研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報， 2019， 55（12）：1747-1761.

[22]GIERTH M， SCHROEDER P M I. The potassium transporter AtHAK5 functions in K+ deprivation-induced high-affinity K+ uptake and AKT1 K+ channel con to K+ uptake kontributiinetics in Arabidopsis roots[J]. Plant Physiology， 2005， 137（3）：1105-1114.

[23]QI Z， HAMPTON C R， RYOUNG S， et al. The high affinity K+ transporter AtHAK5 plays a physiological role in planta at very low K+ concentrations and provides a caesium uptake pathway in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（3）： 595-607.

[24]RIGAS S， DITENGOU F A， LJUNG K， et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex[J]. New Phytologist， 2012， 197（4）： 1130-1141.

[25]孫小川，段偉科，黃志楠，等. 蘿卜DHN基因家族的鑒定及表達(dá)模式分析[J/OL].分子植物育種，2022：1-8[2022-08-05]. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210922.1446.005.html.

[26]KITASHIBA H， LI F， HIRAKAWA H， et al. Draft sequences of the radish （Raphanus sativus L.） genome[J]. DNA Res， 2014， 21（5）： 481-490.

[27]MITSUI Y， SHIMOMURA M， KOMATSU K， et al. The radish genome and comprehensive gene expression profile of tuberous root formation and development[J]. Sci Rep， 2015， 5（1）：1-14.

[28]JEONG Y M， KIM N， AHN B O， et al. Elucidating the triplicated ancestral genome structure of radish based on chromosome-level comparison with the Brassica genomes[J]. Theor Appl Genet， 2016， 129（7）：1357-1372.

[29]BAILEY T L， WILLIAMS N， MISLEH C， et al. MEME： discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs[J]. Nucleic Acids Res， 2006， 34：369-373.

[30]CHEN C， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant， 2020， 13（8）：1194-1202.

[31]HU B， JIN J P， GUO A Y， et al. GSDS 2.0： an upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics， 2015， 31（8）： 1296-1297.

[32]HIGO K， UGAWA Y， IWAMOTO M， et al. Plant cis-acting regulatory DNA elements （PLACE） database[J]. Nucleic Acids Res， 1999， 27（1）： 297-300.

[33]WANG Y P， TANG H B， DEBARRY J D， et al. MCScanX： a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity[J]. Nucleic Acids Res， 2012， 40（7）： e49.

[34]QIAO X， LI M， LI L T， et al. Genome-wide identification and comparative analysis of the heat shock transcription factor family in Chinese white pear （Pyrus bretschneideri） and five other Rosaceae species[J]. BMC Plant Biol， 2015， 15：12.

[35]NEI M， GOJOBORI T. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions[J]. Mol Biol Evol， 1986， 3（5）： 418-426.

[36]SHUANG H， CHEN L S， JIANG H X， et al. Boron deficiency growth and photosynthesis， and increases starch and hexoses in leaves of citrus seedling[J]. Journal of Plant Physiology， 2008， 165（13）：1331-1341.

[37]SONG Z Z， MA R J， YU M L. Genome-wide analysis and identification of KT/HAK/KUP potassium transporter gene family in peach （Prunus persica） [J]. Genet Mol Res， 2015， 14（1）： 774-787.

[38]NIEVES-CORDONES M， RODENAS R， CHAVANIEU A， et al. Uneven HAK/KUP/KT protein diversity among angiosperms： species distribution and perspectives[J]. Front Plant Sci， 2016， 7：126.

[39]ELUMALAI R P， NAGPAL P， REED J W. A mutation in the Arabidopsis KT2/KUP2 potassium transporter gene affects shoot cell expansion[J]. Plant Cell， 2002， 14：119-131.

[40]RIGAS S， DEBROSSES G， HARALAMPIDIS K， et al. TRH1 encodes a potassium transporter required for tip growth in Arabidopsis root hairs[J]. Plant Cell， 2001， 13：139-151.

[41]MAATHUIS F J. The role of monovalent cation transporters in plant responses to salinity[J]. J Exp Bot， 2006， 57：1137-1147.

[42]WESTERMANN D T. Soil nutrient bioavailability： a mechanistic approach[J]. Soil Sci， 1996， 161（2）： 140-141.

[43]王 瑜，劉 揚(yáng)，卓座品，等. 高氮低磷中鉀配比對武夷巖茶產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，53（2）：391-400.

[44]OSAKABE Y， ARINAGA N， UMEZAWA T， et al. Osmotic stress responses and plant growth controlled by potassium transporters in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2013， 25（2）： 609-624.

[45]KIM E J， KWAK J M， UOZUMI N， et al. AtKUP1： an Arabidopsis gene encoding high-affinity potassium transport activity[J]. Plant Cell， 1998， 10（1）：51-62.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-08-11

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（21）2020]；江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)課題（17HZHL015）；淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院橫向課題（0012021028H）

作者簡介：程 瑞（1991-），男，安徽潛山人，博士，助理研究員，從事園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用與遺傳育種研究。（Tel）18762046231；（E-mail）chengrui@jaas.ac.cn

通訊作者：趙建鋒，（E-mail）350043736@qq.com