摘要： 為了鑒定引起茄子斑駁皺縮病毒病的病原物，利用siRNA高通量測(cè)序技術(shù)（Small interfering RNA，siRNA），結(jié)合生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)2個(gè)表現(xiàn)斑駁和皺縮的茄子樣品中存在蠶豆萎蔫病毒2號(hào)（Broad bean wilt virus，BBWV2）、葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）。采用RT-PCR技術(shù)對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，2個(gè)樣品中均檢測(cè)到BBWV2和TMV，未檢測(cè)到GVA。通過對(duì)BBWV2外殼蛋白（Large coat protein，LCP）大亞基基因進(jìn)行測(cè)序和分子進(jìn)化分析，獲得了2條1 126 bp的BBWV2 LCP基因片段，2條BBWV2 LCP基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分別為99.6%和99.3%；與NCBI中已發(fā)表的23個(gè)BBWV2 LCP基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分別為79.9%～95.2%和80.5%～97.2%?；贚CP基因核苷酸序列進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，BBWV2可分為兩大支。不同寄主BBWV2 LCP基因的遺傳距離在0.049～0.332。

關(guān)鍵詞： 茄子；斑駁皺縮病毒??；蠶豆萎蔫病毒2號(hào)；煙草花葉病毒；LCP基因

中圖分類號(hào)： S641.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）03-0674-09

Identification and molecular evolutionary analysis of viruses causing eggplant mottle crinkle disease

SHAO Yu-chun， ZHONG Jian-xin， LU Yun-shuang， SONG Mei-na， CHEN Ya-han

（College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To identify the viruses causing eggplant mottle crinkle disease， the high-throughput sequencing of small interfering RNA （siRNA） and the bioinformatics methods were used to detect the potential viral pathogens， including the broad bean wilt virus 2 （BBWV2）， grapevine virus A （GVA） and tobacco mosaic virus （TMV）. The results were validated by RT-PCR. BBWV2 and TWV were detected in the samples， and GVA was not detected. Through sequencing and molecular evolutionary analysis of the large subunit gene of BBWV2 coat protein （LCP）， two 1 126 bp BBWV2 LCP gene fragments were obtained. The nucleotide and coding amino acid sequences identities of the two BBWV2 LCP genes were 99.6% and 99.3%， respectively. The nucleotide and amino acid sequences identities of the 23 BBWV2 LCP genes published in NCBI were 79.9%-95.2% and 80.5%-97.2%， respectively. The analysis of population structure and genetic diversity based on LCP gene nucleotide sequence showed that BBWV2 could be divided into two branches in the phylogenetic tree. The genetic distance of BBWV2 LCP gene between different hosts ranged from 0.049 to 0.332.

Key words： eggplant；mottle crinkle disease;broad bean wilt virus 2；tobacco mosaic virus;LCP gene

茄子（Solanum melongena L.）為茄科（Solanaceae Juss.），茄屬（Solanum L.）植物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)中國(guó)茄子種植面積約占7.4×105 hm2，產(chǎn)量約為2.0×108 t[2]，所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。隨著種植面積的不斷增加，病毒病嚴(yán)重影響了茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)。蠶豆萎蔫病毒2號(hào)（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）屬于豇豆花葉病毒科（Comoviriadae）蠶豆病毒屬（Fabavirus），在自然界主要通過多種蚜蟲非持續(xù)性傳播，可侵染44科186屬328種植物，被侵染后植物多表現(xiàn)為不同程度的變色、畸形、萎蔫且葉片多附有黑褐色壞死斑點(diǎn)，嚴(yán)重影響了植物的正常生長(zhǎng)[3-9]。BBWV2基因組由2段單鏈RNA分子組成，RNA1（5 800 nt）表達(dá)蛋白酶輔因子（Co-Pro）、解旋酶（Helicase）、NTP結(jié)合基序（NTBM）、蛋白酶（Pro）和RNA依賴性RNA聚合酶（RT）等5種功能蛋白質(zhì)，主要參與基因組的復(fù)制和表達(dá)；RNA2（3 300 nt）表達(dá)運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein，MP）、外殼蛋白大亞基（Large coat protein，LCP）和外殼蛋白小亞基（Small coat protein，SCP）等3種功能蛋白質(zhì)[10-12]。

目前，檢測(cè)植物病毒的方法有傳統(tǒng)病毒血清學(xué)鑒定法（Serological methods）、透射電鏡法（Transmission electron microscopy，TEM）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Polymerase chain reaction，PCR）等[13-15]。這些方法僅適用于對(duì)已知病原物的病毒檢測(cè)，而對(duì)未知病原物的檢測(cè)則受到了極大的限制。siRNA高通量測(cè)序技術(shù)（Small interfering RNA，siRNA）與傳統(tǒng)的病原檢測(cè)方法不同，是利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病毒產(chǎn)生的siRNA序列，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)從而篩選和鑒定病毒種類 [16-20]，其靈活性高，適用性強(qiáng)。本研究利用siRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2020年7月在甘肅省臨洮市采集到的2株表現(xiàn)斑駁和皺縮等疑似病毒病癥狀的茄子樣品進(jìn)行深度測(cè)序，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，旨在明確引起茄子斑駁皺縮病毒病的病毒種類，為茄子斑駁皺縮病毒病的快速診斷和防控提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年7月在甘肅省臨洮縣采集到2株表現(xiàn)斑駁和皺縮等疑似病毒病癥狀的茄子葉片（圖1），液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 樣品總RNA的提取及siRNA測(cè)序

按照Invitrogen TRIzolTM說(shuō)明書提取樣品總RNA，利用Unano-2000微量核酸分析儀（UMI，美國(guó)）測(cè)定RNA濃度，提取的RNA送至北京百邁客生物科技有限公司完成siRNA的分離、高通量測(cè)序以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2500。

1.3 病毒種類篩選

對(duì)測(cè)序得到的粗序列raw read進(jìn)行過濾，去除質(zhì)量值低、無(wú)3′接頭序列和插入片段的read，篩選長(zhǎng)度在18～35 nt的siRNA。使用velvet軟件對(duì)所得siRNA進(jìn)行拼接，將拼接所得contig進(jìn)行分類注釋。具體方法如下：（1）將獲得的contig與茄子基因組序列進(jìn)行比對(duì)，去除寄主基因組序列。（2）用BLASTN將剩余的contig與NCBI Nt（NCBI non-redundant nucleotide sequences）進(jìn)行比對(duì)，獲得高度同源的序列。（3）用BLASTX將2中未注釋到的contig與NCBI Nr（NCBI non-redundant protein sequences）進(jìn)行比對(duì)，獲得部分同源的序列。（4）選出高度同源和部分同源序列中e值最小的contig，分別與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（Virus RefSeq Nucletide）和GenBank Virus RefSeq蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Virus RefSeq Protein）進(jìn)行比對(duì)，篩選和鑒定病毒種類。

1.4 RT-PCR的檢測(cè)及克隆測(cè)序

siRNA高通量測(cè)序結(jié)果顯示樣品中存在BBWV2、葡萄A病毒（GVA）和煙草花葉病毒（TMV） 3種病毒。根據(jù)NCBI中收錄的BBWV2和GVA基因組全序列，使用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物。TMV的特異性引物（表1）參考已報(bào)道文獻(xiàn)，引物委托西安擎科生物科技有限責(zé)任公司合成。

按照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系（20 μl）：取1 μg RNA為模板，加入5×Prime Script Buffer 4 μl、Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1 μl、Oligo dT Prime 1 μl，Random 6mers 1 μl、RNase Free ddH2O補(bǔ)全至20 μl；反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 4 s。合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。

以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察結(jié)果并拍照。用膠回收試劑盒（TaKaRa）將目標(biāo)產(chǎn)物切膠回收，純化產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、單克隆挑選和搖菌后，PCR篩選陽(yáng)性克隆，鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒送至西安擎科生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.5 序列一致性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將獲得的兩段序列用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行校正和拼接，將得到的BBWV2 LCP基因序列提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，采用SDTv1.2軟件中的Clustal W算法進(jìn)行核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分析[22]。以南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）為外群，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇鄰近法（Neighbor-joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，自展校正值設(shè)定為1 000。

1.6 遺傳距離分析和基因交流分析

使用MEGA 7.0軟件中Max ximum Composite Likelihood模型計(jì)算BBWV2分離物不同分組之間的遺傳距離，Gamma參數(shù)默認(rèn)為1。使用DnaSP v5軟件分析BBWV2分離物不同分組之間的基因交流，以種群基因差異Fst值和基因流Nm值為參考來(lái)衡量種群間的遺傳分化程度和基因交流。一般|Fst|介于0至1，當(dāng)0≤|Fst|≤0.33，表明這兩個(gè)分組之間存在頻繁的基因交流；當(dāng)0.33≤|Fst|≤1，表明這兩個(gè)分組之間基因交流的頻率很低。當(dāng)Nm＜1，表明這兩個(gè)分組之間很容易發(fā)生遺傳漂變；當(dāng)Nm＞1，表明這兩個(gè)分組之間存在可以基因交流的渠道[23-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品siRNA高通量測(cè)序分析

經(jīng)測(cè)序得到的粗序列raw read進(jìn)行篩選后獲得的總RNA數(shù)為12 568 877（表2），其中，siRNA長(zhǎng)度分布結(jié)果如圖2，本研究中siRNA序列長(zhǎng)度主要集中于18～24 nt，表明樣本siRNA文庫(kù)質(zhì)量較高。使用velvet軟件將siRNA進(jìn)行拼接后，所組裝的contig數(shù)為3 624。將拼接所得的contig進(jìn)行分類注釋，篩選出與病毒同源的contig數(shù)目結(jié)果見表3，包括BBWV2、GVA和TMV 3種病毒，與BBWV2同源的contig數(shù)目最高，為64；與GVA和TMV同源的contig數(shù)目依次為2和3；其中，BBWV2、GVA和TMV的e-value值分別為8×10-51、7×10-13、2×10-28，表明BBWV2出現(xiàn)假陽(yáng)的概率最小，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證才能明確引起茄子斑駁皺縮病毒病的病毒種類。

2.2 樣品病毒檢測(cè)結(jié)果

以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示2份疑似病毒病的茄子樣品中，擴(kuò)增出2條大小約為1 100 bp和600 bp的目標(biāo)條帶（圖3），表明茄子樣品中含有BBWV2和TMV 2種病毒，并未檢測(cè)到GVA。

2.3 序列一致性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序后所獲得的BBWV2 LCP原始序列采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行了校正和拼接，獲得2條1 126 bp的序列，并將其命名為BBWV2-Q11、BBWV2-Q14后進(jìn)行序列一致性分析。結(jié)果表明本研究中所獲得的2條BBWV2分離物L(fēng)CP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分別為99.6%和99.3%。與NCBI中已發(fā)表的23個(gè)BBWV2分離物L(fēng)CP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分別為79.9%～95.2%和80.5%～97.2%（表4、表5）。其中，BBWV2-Q11、BBWV2-Q14與BBWV2新加坡分離物（GenBank登錄號(hào)NC003004）的核苷酸序列一致性最低，為79.9%；與中國(guó)分離物（GenBank登錄號(hào)KY606993）的核苷酸序列一致性最高，為95.2%；與BBWV2新加坡分離物（GenBank登錄號(hào)NC003004）的氨基酸序列一致性最低，為80.5%；與中國(guó)分離物（GenBank登錄號(hào)KY606993）的氨基酸序列一致性最高，為97.2%。說(shuō)明本研究所獲得的BBWV2 LCP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列與NCBI中已收錄的BBWV2 LCP核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列有較高的一致性。

將獲得的BBWV2-Q11、BBWV2-Q14 LCP核苷酸序列與NCBI中已發(fā)表的23個(gè)BBWV2 LCP核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以ArMV為外群，使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）表明，BBWV2 LCP核苷酸序列可分為兩大支，以來(lái)自中國(guó)的BBWV2-KY606993和BBWV2-AJ132844，韓國(guó)的BBWV2-JX183222、BBWV2-KT380023、BBWV2-JX183224、BBWV2-JX183230、BBWV2-KC625509、BBWV2-KC625510、BBWV2-KC625516、BBWV2-KC625517、BBWV2-KC625515、BBWV2-KC625514、BBWV2-KC625512和BBWV2-KC625518等為Ⅰ組，其他序列聚為Ⅱ組。BBWV2-Q11、BBWV2-Q14與BBWV2-KY606993親緣關(guān)系較近。

2.4 遺傳差異分析

不同寄主間BBWV2 LCP基因的遺傳距離介于0.049～0.332（表6），其中，寄主為紅辣椒（Chilli）和赤苞花（Megaskepasma erythrochlamys）的BBWV2 LCP遺傳距離最高為0.332，遺傳差異顯著；寄主為辣椒（Capsicum annuum）和菠菜（Pisum sativum）的BBWV2 LCP遺傳距離最低為0.049，遺傳差異不顯著。但由于本研究采集到的樣本數(shù)量較少，無(wú)法判斷不同的寄主是否會(huì)對(duì)鑒定到的BBMV遺傳有影響，還需進(jìn)一步研究。

不同寄主間BBWV2 LCP基因的遺傳差異（Fst）介于-0.019～0.920（表7），其中，寄主辣椒（C. annuum）和蠶豆（Vicia faba）BBWV2 LCP基因的遺傳差異（Fst）最低為-0.019，其數(shù)值介于0≤|Fst|≤0.33，表明這兩個(gè)寄主BBMV2病毒之間存在頻繁的基因交流；寄主茄子（S. melongena）和太子參（Pseudostellaria heterophylla）BBWV2 LCP基因的遺傳差異（Fst）最高為0.920，其數(shù)值介于0.33≤|Fst|≤1，表明這兩個(gè)寄主BBMV2病毒基因交流的頻率很低。不同寄主BBWV2 LCP基因之間基因流（Nm）介于0.02～13.41，其中，寄主茄子（S. melongena）和太子參（P. heterophylla）BBMV2病毒的基因流（Nm）最低為0.02，其數(shù)值Nm＜1，表明這2個(gè)寄主BBMV2病毒之間很容易發(fā)生遺傳漂變；寄主辣椒（C. annuum）和蠶豆（V. faba）BBMV2病毒的基因流（Nm）最高為13.41，其數(shù)值Nmgt;1，表明這兩個(gè)寄主BBMV2病毒之間存在可以基因交流的通道。

3 討論

為明確引起茄子斑駁和皺縮的病毒種類，本研究對(duì)表現(xiàn)出斑駁和皺縮的茄子樣品進(jìn)行siRNA高通量測(cè)序和RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明表現(xiàn)出斑駁和皺縮的茄子樣品中含有BBWV2和TMV，采用2種方法聯(lián)合鑒定病毒種類顯著提高了篩查的效率和準(zhǔn)確度。這與柴阿麗等[19]通過siRNA進(jìn)行高通量測(cè)序和RT-PCR技術(shù)鑒定出侵染茄子的煙草輕型綠花葉病毒（Tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）和番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）和陳雅寒等[27]利用siRNA高通量測(cè)序技術(shù)和RT-PCR技術(shù)鑒定出侵染杏的亞洲李屬病毒 1（Asian prunus virus1，APV 1）和亞洲李屬病毒 3（Asian prunus virus 3，APV 3）的研究方法相似。雖然siRNA高通量測(cè)序在茄子樣品中檢測(cè)出GVA，但是RT-PCR未檢測(cè)到GVA的存在，原因可能是siRNA高通量測(cè)序過程中添加多個(gè)核苷酸時(shí)，插入和刪除等測(cè)序錯(cuò)誤造成的假陽(yáng)性[28]。

本研究檢測(cè)出BBWV2和TMV，說(shuō)明甘肅省臨洮縣茄子斑駁皺縮癥狀是由多種病毒復(fù)合侵染造成的，原因可能是由于傳毒介體與病毒之間互作所致，也有可能是由于寄主感染其中一種病毒后，失去抵御另外一種病毒的能力[29]。

為明確BBWV2 LCP基因序列的遺傳多樣性和分子進(jìn)化關(guān)系，將獲得的BBWV2-Q11、BBWV2-Q14和23個(gè)寄主來(lái)源不同的BBWV2分離物L(fēng)CP基因核苷酸序列進(jìn)行一致性分析，核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列一致性分別為79.9%～95.2%和80.5%～97.2%。這表明，雖然BBWV2的LCP基因有很高的保守性，但仍具一定程度的分子變異[29]。以ArMV為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對(duì)不同寄主BBWV2分離物進(jìn)行遺傳距離和遺傳差異分析，結(jié)果顯示本研究寄主茄子（S. melongena）和太子參（P. heterophylla）BBWV2 LCP基因之間遺傳交流的頻率很低，這與系統(tǒng)發(fā)育樹中聚類結(jié)果顯示一致，說(shuō)明BBWV2的分離物之間有一定的寄主差異。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）

收稿日期：2022-08-15

基金項(xiàng)目：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210733027）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160628）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21JR7RA820）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2021B-117）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)人才啟動(dòng)資金項(xiàng)目（GAU-KYQD-2019-22）

作者簡(jiǎn)介：邵宇純（2001-），女，山西太原人，本科生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。（E-mail）1054030947@qq.com

通訊作者：陳雅寒，（E-mail）yhchen1018@nwafu.edu.cn