摘 要：采用2 g/100 mL的氯化亞鐵溶液處理羅非魚片，定期取樣測定魚片的感官評分、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和三甲胺（trimethylamine，TMA）含量，結(jié)合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析亞鐵離子對魚片上細菌生長的影響。結(jié)果表明，氯化亞鐵處理魚片的感官較好，菌落總數(shù)、TVB-N和TMA含量較對照魚片明顯降低，對照魚片和氯化鈉處理魚片在4 ℃冷藏9 d，菌落總數(shù)、TVB-N和TMA含量超過國家標準規(guī)定限量，而氯化亞鐵處理魚片的菌落總數(shù)、TVB-N和TMA含量未超標。通過PCR-DGGE分析可知，氯化亞鐵處理魚片在冷藏初期的菌相復雜，冷藏6 d后，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）數(shù)量增多，假單胞菌（Pseudomonas）數(shù)量減少，但Pseudomonas在整個菌相中依舊數(shù)量最多，仍是優(yōu)勢菌。

關(guān)鍵詞：魚片；亞鐵離子；細菌；變性梯度凝膠電泳

Influence of Ferrous Ions on Bacterial Growth on Tilapia Fillets

MENG Xiaohua

（Hebi Polytechnic， Hebi 458030， China）

Abstract： After being treated with 2 g/100 mL ferrous chloride solution， tilapia fillets were sampled at regular intervals during storage for measurement of sensory score， total bacterial count， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content， and trimethylamine （TMA） content. Using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）， the effect of ferrous ions on bacterial growth on tilapia fillets was studied. Fillets treated with ferrous chloride solution had better sensory quality and significantly lower total bacterial count， TVB-N and TMA content compared to control fillets treated with distilled water. After storage at 4 ℃ for 9 days， the total bacterial count， TVB-N and TMA content of control samples and those treated with sodium chloride all exceeded the national limits， while those of ferrous chloride treated fillets did not. PCR-DGGE analysis showed that the bacterial flora of ferrous chloride treated fillets was complicated in the early stage of cold storage. After 6 days， the number of Shewanella putrefaciens and Psychrobacter increased， while the number of Pseudomonas decreased， but was still the largest in the whole microflora; it remained the dominant bacterium.

Keywords： fish fillet; ferrous ion; bacteria; denaturing gradient gel electrophoresis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231007-093

中圖分類號：TS254.4 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）10-0016-06

引文格式：

孟曉華. 亞鐵離子對羅非魚片細菌生長的影響[J]. 肉類研究， 2023， 37（10）： 16-21. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231007-093. " "http：//www.rlyj.net.cn

MENG Xiaohua. Influence of ferrous ions on bacterial growth on tilapia fillets[J]. Meat Research， 2023， 37（10）： 16-21.

（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231007-093. " http：//www.rlyj.net.cn

羅非魚片含水量高，容易受到微生物污染，失去食用價值和經(jīng)濟價值。假單胞菌（Pseudomonas）是一類好氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性細菌，廣泛分布在土壤[1]、

水[2]及水產(chǎn)品[3-4]中，是羅非魚片的特定腐敗菌[5]，抑制Pseudomonas等微生物的生長是魚片保鮮的目標和方向。目前關(guān)于魚片保鮮的物理和化學方法有很多，真空

保鮮[6]、氣調(diào)保鮮[7]、輻照保鮮[8]和防腐劑保鮮[9]，往往出現(xiàn)不易被接受、口感差、保鮮效果不佳、成本高[10]等問題，難以滿足實際需要。近年來，金屬離子的抑菌作用研究及其在食品保鮮中的應用逐漸興起。李瑜珍等[11]研究不同濃度葡萄糖、氯化鈉及氯化鐵對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響。魯重等[12]闡述了致腐Pseudomonas生物被膜形成的調(diào)控機制，揭示生鮮食品來源的Pseudomonas致腐機制。楊靜[13]以乳酸亞鐵為保鮮劑處理羅非魚，并加入0.5%的檸檬酸，置于8 ℃下冷藏，結(jié)果顯示，經(jīng)噴淋乳酸亞鐵的羅非魚其感官評分、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reaction substances，TBARs）值及pH值均低于對照，證實亞鐵離子對羅非魚具有保鮮效果。

鐵離子作為微生物生長所必需的微量元素之一，是細胞色素、細胞呼吸酶、過氧化氫酶、氮酸還原酶等物質(zhì)的重要組成部分[14-15]，通常會與酶蛋白質(zhì)共價結(jié)合，促進細胞呼吸和生物遺傳因子的合成等[16]。為抑制細菌侵染，宿主會進入“鐵限制”狀態(tài)[17-18]，大部分細菌會因缺鐵而生長受到抑制。但某些競爭力強的細菌，如Pseudomonas能夠在低鐵的環(huán)境下產(chǎn)生鐵螯合蛋白——嗜鐵素，從宿主細胞內(nèi)將鐵“爭奪”出來[19]，適應環(huán)境中鐵離子含量變化，從而在整個微生物菌相中處于優(yōu)勢地位。但當宿主環(huán)境中含有足夠的鐵離子時，菌群間對鐵離子競爭的拮抗作用即會削弱，原來競爭性弱的細菌也會得到生長繁殖，呈現(xiàn)多菌相狀態(tài)。在固定營養(yǎng)基質(zhì)的前提下，優(yōu)勢腐敗菌的生長是否會受到其他細菌生長的影響而失去優(yōu)勢地位，從而減少腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，延緩產(chǎn)品貨架期，是值得探討的問題。除此之外，亞鐵離子還可以與過氧化氫、超氧陰離子等反應生成強氧化劑羥自由基，破壞包括糖、脂質(zhì)、脫氧核糖核酸鏈等幾乎所有的生物分子，對微生物具有極大的損害效應[20]。目前關(guān)于應用氯化亞鐵保鮮羅非魚片鮮見研究報道。

因此，本實驗通過氯化亞鐵溶液浸泡羅非魚魚片的方式，研究其對魚片特定腐敗菌Pseudomonas生長代謝特性的影響，旨在為魚片冷藏保鮮提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚片 茂名市海名威水產(chǎn)科技有限公司提供；細菌基因組DNA快速提取試劑盒 廣州東盛生物科技公司；

Goldview染料（含量≥95%） 上?？￡缮锟萍加邢薰?；DNA Marker DL2000 南京生興生物技術(shù)有限

公司；溴化乙錠溶液、6×上樣緩沖液 北京百奧萊博科技有限公司；2×GoTaq Green Master Mix 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；氯化亞鐵 青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2001-220DGGE電泳儀 美國CBS Scientific公司；T196 DNA擴增儀 德國Biometra公司；DYCP-31CN水平電泳儀 北京六一儀器廠；DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器 太倉實驗設(shè)備廠；TPX-20MC紫外

觀察儀 法國Vilber Lourmat公司；TGL-16G型臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚片處理

根據(jù)孫紅啟[20]、楊靜[13]的研究，以滿足微生物生長所需及微生物細胞對金屬離子的耐受性為參考，選擇一定的鹽含量進行實驗。分別配制質(zhì)量濃度2 g/100 mL的氯化亞鐵溶液、1.84 g/100 mL的氯化鈉溶液，高壓滅菌后冷卻。無菌操作下將新鮮羅非魚片浸泡在氯化亞鐵溶液和氯化鈉溶液中30 min左右（浸泡后魚片中亞鐵離子質(zhì)量濃度為

8.84 mg/mL），以浸泡無菌蒸餾水的魚片作對照，魚片撈出瀝干，覆保鮮膜后于4 ℃冰箱中保藏，每隔3 d取樣進行分析。

1.3.2 感官評定

選擇6 位有鑒定能力的感官評價員，按照感官評定標準（表1）對樣品的色澤、氣味、質(zhì)地、黏液外觀四方面進行評定打分，對評價結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 菌落總數(shù)的測定

按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法，無菌條件下取魚肉10 g至無菌錐形瓶中，加入滅菌生理鹽水90 mL，120 r/min振蕩器振搖30 min。取1 mL上清液進行梯度稀釋，用計數(shù)培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)48 h，計算菌落總數(shù)。

1.3.4 TVB-N含量的測定

按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中的微量擴散法，以每100 g魚片中所含氮含量（mg）表示。

1.3.5 三甲胺（trimethylamine，TMA）含量的測定

采用微量擴散法，取適量魚漿液（魚肉∶水=

1∶3，m/V）和0.5 mL甲醛溶液于康衛(wèi)皿外室，取2.0 mL質(zhì)量分數(shù)2%硼酸吸收液于皿內(nèi)室，皿口涂凡士林，外室加1 mL質(zhì)量分數(shù)40%碳酸鉀溶液，迅速蓋好皿蓋，微傾斜，使碳酸鉀溶液和樣品混勻，于37 ℃恒溫箱中反應3 h，取出樣品冷卻，用0.01 mol/L的鹽酸標準溶液滴定內(nèi)室硼酸吸收液至藍紫色為終點。TMA含量按下式計算。

式中：V為滴定樣品消耗鹽酸標準溶液體積/mL；

V0為滴定空白消耗鹽酸標準溶液體積/mL；m為樣品液所含樣品質(zhì)量/g；14為每克當量氮質(zhì)量/g；0.01為鹽酸標準溶液濃度/（mol/L）。

1.3.6 細菌總DNA的提取

無菌取10 g魚肉樣品于盛有90 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，加入10 g玻璃珠，置于振蕩器上120 r/min振蕩30 min，靜置5 min，移取20 mL上清液于無菌離心管中。然后以10 000 r/min離心20 min，棄上清液得菌體沉淀[21]。按試劑盒操作步驟將所得沉淀加入DS緩沖液200 μL，劇烈渦漩振蕩后加入蛋白酶K溶液20 μL，55 ℃條件下水浴30 min。加入裂解液220 μL，漩渦混勻，65 ℃水浴10 min，再加入無水乙醇220 μL，上下混勻后將溶液及絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移到純化柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液，繼續(xù)按試劑盒說明進行。將提取的細菌總DNA溶于60 μL Tris-EDTA洗脫液中，用質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及純度后于－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 細菌總DNA的16S rDNA的V3可變區(qū)的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

本實驗所用引物序列見表2，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。采用巢氏PCR法，先用引物8F/798R進行第1輪PCR，擴增約800 bp的細菌16S rDNA序列[22]。

25 μL PCR體系：GoTaq Green Master Mix（2×）12.5 μL，細菌DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR程序[23]：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個循環(huán)；最后72 ℃再延伸2 min。用含Goldview染料的質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物產(chǎn)量及特異性后進行第2輪PCR。

以第1輪PCR產(chǎn)物為模板進行第2輪PCR，采用引物GC338F/518R，對細菌16S rDNA的V3區(qū)片段進行降落PCR擴增。50 μL PCR體系：GoTaq Green Master Mix（2×）25 μL，DNA模板1 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min，然后進行降落PCR程序，20 個循環(huán)（94 ℃變性1 min；退火溫度從65 ℃到55 ℃，退火30 s；72 ℃延伸3 min），再于恒定退火溫度下進行10 個循環(huán)（94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min），最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于－20 ℃冰箱中凍存。

1.3.8 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析

參照Muyzer等[24]方法，進行細菌16S rDNA的V3區(qū)擴增產(chǎn)物的DGGE分析。質(zhì)量濃度80 g/L聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺與甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為37.5∶1），40%～60%變性劑梯度（100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺），在1×TAE緩沖溶液中，60 ℃恒溫，150 V電壓電泳5 h。電泳結(jié)束后，用1×TAE（含0.5 mg/L

EB）將DGGE膠片染色30 min。棄去染色液，用ddH2O漂洗10 min。染色后的DGGE膠片用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.9 DGGE條帶的切割、重擴增及PCR產(chǎn)物純化

將DGGE膠片放在紫外觀測臺上，參照Toffin等[25]方法，切下各泳道中的主要條帶，溶于30 μL ddH2O中，4 ℃下過夜。以10 μL回收的DNA溶液為模板，338F（無GC夾）/518R為引物，采用1.3.7節(jié)的PCR體系和程序進行擴增。取4 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，檢查其產(chǎn)量及特異性。采用割膠純化法進行PCR產(chǎn)物純化。

1.3.10 DGGE條帶的克隆、測序

DNA測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細胞，對陽性克隆株進行測序，測序得到細菌16S rDNA片段序列，用NCBI中的BLAST命令與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，找出相似度最高的序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖表，用SPSS 18.0軟件分析方差。所有實驗均平行測定3 次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞鐵離子對冷藏羅非魚片感官評分的影響

小寫字母不同，表示組間差異顯著（P＜0.05）。下同。

由圖1可知，4 ℃冷藏條件下，隨冷藏時間延長，氯化亞鐵溶液、氯化鈉溶液、無菌蒸餾水3 種處理方式的魚片的感官評分逐漸下降。冷藏到第9天時，無菌蒸餾水、氯化鈉溶液、氯化亞鐵溶液浸泡的魚片的感官評分分別為4.38、4.69、6.42 分。方差分析可知，不同溶液浸泡處理對羅非魚片的感官評分影響顯著（P＜0.05）。

2.2 亞鐵離子對冷藏羅非魚片菌落總數(shù)的影響

由圖2可知，4 ℃冷藏條件下，隨冷藏時間延長，氯化亞鐵溶液、氯化鈉溶液、無菌蒸餾水3 種處理溶液浸泡的魚片的菌落總數(shù)均呈遞增趨勢。參照

SC/T 3116—2006《凍淡水魚片》規(guī)定[26]，菌落總數(shù)須不超過1.0×107 CFU/g。冷藏到第9天，無菌蒸餾水和氯化鈉溶液浸泡的魚片菌落總數(shù)分別達到2.5×109、2.1×108 CFU/g，均超過標準規(guī)定；而氯化亞鐵溶液浸泡的魚片的菌落總數(shù)僅為2.6×105 CFU/g，沒有超標。這可能是由于亞鐵離子雖然能夠提升Psychrobacter等細菌的生長，但其生長增量卻低于Pseudomonas的生長減量。這與樊潔敏等[27]的研究結(jié)果一致，金屬離子對食品致腐熒光Pseudomonas生物被膜形成會產(chǎn)生影響。方差分析發(fā)現(xiàn)，不同溶液浸泡處理對羅非魚片的菌落總數(shù)影響顯著，由多重比較得，氯化亞鐵溶液最能有效抑制羅非魚片上菌落總數(shù)的增加。

2.3 亞鐵離子對冷藏羅非魚片TVB-N含量的影響

由圖3可知，4 ℃冷藏條件下，隨冷藏時間延長，氯化亞鐵溶液、氯化鈉溶液、無菌蒸餾水3 種處理方式的魚片的TVB-N含量均增加。參照SC/T 3116—2006規(guī)定TVB-N含量≤20 mg/100 g。冷藏到第9天時，無菌蒸餾水浸泡魚片的TVB-N含量為20.58 mg/100 g，氯化鈉溶液浸泡魚片的TVB-N含量為20.69 mg/100 g，2 種處理方式均超過標準規(guī)定；而氯化亞鐵溶液浸泡的魚片的TVB-N含量為17.42 mg/100 g，沒有超標。方差分析可知，不同溶液浸泡處理對羅非魚片的TVB-N含量影響顯著（P＜0.05），經(jīng)多重比較，氯化亞鐵溶液最能有效抑制羅非魚片上TVB-N含量增加。

2.4 亞鐵離子對冷藏羅非魚片TMA含量的影響

由圖4可知，4 ℃冷藏條件下，隨冷藏時間延長，氯化亞鐵溶液、氯化鈉溶液、無菌蒸餾水3 種溶液浸泡的魚片的TMA含量均呈上升趨勢，冷藏到第12天時，無菌蒸餾水、氯化鈉溶液、氯化亞鐵溶液浸泡魚片的TMA含量分別達到5.08、4.92、2.54 mg/100 g。方差分析可知，不同溶液浸泡處理對羅非魚片的TMA含量影響顯著（P＜0.05），多重比較結(jié)果表明，氯化亞鐵溶液最能有效抑制羅非魚片上TMA含量的增加。

2.5 亞鐵離子對冷藏羅非魚片上細菌生長的影響

細菌總DNA提取及PCR擴增結(jié)果分別如圖5所示，3 種不同溶液浸泡處理的魚片的細菌總DNA均擴增出目的片段。

A. 魚片上提取的細菌總DNA；B. 魚片細菌16S rDNA V3可變區(qū)PCR產(chǎn)物。泳道0. Marker DL2000；泳道1～5.冷藏0、3、6、9、12 d對照魚片；泳道6～10.冷藏0、3、6、9、12 d氯化亞鐵溶液浸泡魚片；泳道11～15.冷藏0、3、6、9、12 d氯化鈉溶液浸泡魚片。圖6同。

由圖6和表3可知，從1～5號泳道、6～10號泳道、11～15號泳道，f條帶的亮度逐漸增大，說明隨冷藏時間延長，對照、氯化亞鐵溶液、氯化鈉溶液浸泡處理魚片上的Pseudomonas數(shù)量均逐漸增加；6號和11號泳道類似，其c、d、e、h、i條帶強度均比1號泳道大，說明氯化亞鐵溶液和氯化鈉溶液浸泡處理魚片在冷藏初期的菌相較為復雜，Shewanella putrefaciens、Psychrobacter sp.、Acinetobacter sp.、Brevibacterium sp.等微生物的數(shù)量較對照魚片多，這與初期魚片狀態(tài)有關(guān)；8號、9號泳道的d、e條帶均比3號和4號、13號和14號的亮度大，說明氯化亞鐵溶液浸泡處理魚片上的Shewanella putrefaciens和Psychrobacter數(shù)量比對照和氯化鈉溶液浸泡處理魚片多，即亞鐵離子的存在提高了Shewanella putrefaciens、Psychrobacter等細菌在此特定生態(tài)系統(tǒng)中的競爭力，這種情況可能是因為外加的亞鐵離子改善了其他細菌對鐵的攝取情況，使其不至于因Pseudomonas分泌嗜鐵素導致鐵離子缺乏而死亡[28-29]。但外加的亞鐵離子并未根本改變Pseudomonas的優(yōu)勢地位。其原因可能是亞鐵離子含量不適當，不足以維持Psychrobacter等細菌在冷藏后期的生長所需。11～15號泳道中c、d、e、h條帶從有到無，表明隨冷藏時間延長，氯化鈉溶液浸泡處理魚片的菌相趨向單一，Pseudomonas優(yōu)勢菌地位越來越突出。

有研究[30-31]表明，Pseudomonas為冷藏魚類的特定腐敗菌，抑制其生長能有效延緩魚類的腐敗速度。本研究中亞鐵離子的添加提升了Shewanella putrefaciens、Psychrobacter等細菌在此特定生態(tài)系統(tǒng)中的競爭力，雖未根本改變Pseudomonas的優(yōu)勢地位，但從菌落總數(shù)、TVB-N、TMA含量的結(jié)果來看，氯化亞鐵處理羅非魚片后卻能夠有效抑制羅非魚片上菌落總數(shù)、TVB-N和TMA含量的增加，這也為后續(xù)研究提供了方向。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，以質(zhì)量濃度2 g/100 mL的氯化亞鐵溶液處理羅非魚片，能夠提升Psychrobacter等細菌的競爭力，有效降低魚片菌落總數(shù)、TVB-N和TMA含量。通過改變亞鐵離子含量或動態(tài)添加并監(jiān)控亞鐵離子含量是否能夠改變魚片冷藏過程中（特別是冷藏后期）Pseudomonas的優(yōu)勢地位，有待進一步研究。

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