摘 要：生物活性肽具有抗氧化、降血糖、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等作用，其中免疫活性肽的營養(yǎng)健康功能和疾病調(diào)節(jié)作用引起學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。目前諸多免疫活性肽被應(yīng)用到新型功能性食品研發(fā)和疾病的臨床治療中。本文就動物源性免疫活性肽，從其制備和篩選、免疫作用機制以及功能評價等三方面，綜述了目前國內(nèi)外相關(guān)的研究進展，并對動物源免疫活性肽的未來研究趨勢進行展望，旨在為免疫活性肽功能性產(chǎn)品的研究開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：動物源免疫活性肽；制備；功能評價

Progress in the Preparation and Functional Evaluation of Animal Derived Immune-Active Peptides

XI Liqin1， YANG Junna1， LI Jiapeng1， LIU Li1， FU Lijun1， ZHANG Xin1，*， WANG Shouwei1，2

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Centre， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China; 2. Henan Technical Innovation Center of Meat Processing and Research， Luohe 462000， China）

Abstract： Bioactive peptides have antioxidant， hypoglycemic， anticancer， and immunoregulatory effects. In particular， the nutritional and health benefits and disease regulatory effects of immune-active peptides have attracted widespread attention from researchers. At present， many immunoactive peptides are applied in the research and development of new functional foods and in the clinical treatment of diseases. This article reviews the current progress in the preparation and screening， immunoregulatory effect and functional evaluation of animal-derived immune-active peptides， and discusses future research trends， aiming to provide a reference for the research， development， and application of functional products based on immunoactive peptides.

Keywords： animal-derived immune-active peptides; preparation; functional evaluation

中圖分類號：TS201.4 " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）10-0049-08

引文格式：

席麗琴， 楊君娜， 李家鵬， 等. 動物源免疫活性肽的制備及功能評價研究進展[J]. 肉類研究， 2023， 37（10）： 49-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231007-092. " "http：//www.rlyj.net.cn

XI Liqin， YANG Junna， LI Jiapeng， et al. Progress in the preparation and functional evaluation of animal derived immune-active peptides[J]. Meat Research， 2023， 37（10）： 49-56. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231007-092. " "http：//www.rlyj.net.cn

生物活性肽通過蛋白質(zhì)體外水解、體內(nèi)胃腸道消化或微生物發(fā)酵釋放生物活性[1]，根據(jù)氨基酸的組成、序列及結(jié)構(gòu)的不同，其可發(fā)揮降血壓、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗炎、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[2-3]。免疫活性肽作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽，可以增強巨噬細胞吞噬能力、促進脾淋巴細胞增殖和調(diào)節(jié)細胞因子的分泌和活性等[4]，對先天免疫和適應(yīng)性免疫均可起到調(diào)節(jié)作用，還具備治療各種自身免疫疾病的潛力。由于其在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化妝品、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的適用性，免疫活性肽成為目前研究的焦點[5]。

免疫系統(tǒng)通過識別自身的組織和細胞建立免疫耐受，當(dāng)免疫耐受被破壞時，免疫系統(tǒng)便會對自身組織和細胞產(chǎn)生持續(xù)且強烈的免疫應(yīng)答，破壞機體細胞，形成組織損傷，繼而導(dǎo)致自身免疫性疾?。╝utoimmune diseases，AIDs）的發(fā)生[6]。目前針對AIDs的常規(guī)治療主要包括廣譜抗炎藥物或者皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢素等非特異性的免疫抑制藥物緩解臨床癥狀，或者器官切除、血漿置換等[7]。然而，長期且廣泛的使用免疫抑制劑和細胞毒性藥物會損害自身正常的免疫反應(yīng)，副作用明顯，甚至有潛在風(fēng)險（比如造成機體感染、罹患癌癥等）[8]。因此，研發(fā)具有特異性治療免疫系統(tǒng)疾病且副作用小的免疫抑制劑意義重大。目前有諸多研究表明生物活性肽可用于預(yù)防和治療肥胖、高血壓、II型糖尿病、高膽固醇血癥和相關(guān)疾病[9]，也有以提高免疫力為目的的免疫活性肽產(chǎn)品上市[10]，因此免疫活性肽在免疫疾病的預(yù)防和治療以及免疫藥物的研發(fā)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

免疫活性肽來源豐富，包括動物源、植物源以及微生物源。首次被發(fā)現(xiàn)可以提高小鼠免疫力的活性肽是人酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的[11]。動物源免疫活性肽具備食用安全性高、營養(yǎng)特性好以及發(fā)展前景廣闊等優(yōu)勢而占據(jù)重要地位。目前研究者已鑒定出大量動物蛋白源免疫活性肽，比如蠶蛹蛋白酶解片段PNPNTN[12]、蟹肉酶解肽段LGLGAAVL[13]等，然而免疫活性肽發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制尚未明確。本文擬對動物源免疫活性肽的制備和功能評價的研究進展進行綜述，以期為免疫活性肽的深入研究和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考，并對未來研究趨勢進行展望。

1 動物源免疫活性肽的制備技術(shù)

免疫活性肽的制備技術(shù)通常包括多肽的提取和分離純化。多肽的常用提取方法有微生物發(fā)酵法、酶解法，此外還有直接提取法和人工合成法。多肽的分離純化主要包括膜分離技術(shù)、色譜分離技術(shù)以及質(zhì)譜鑒定等（圖1）。

1.1 免疫活性肽的提取

1.1.1 微生物發(fā)酵法

提取免疫活性肽的微生物發(fā)酵法是利用微生物代謝活動中的蛋白酶在發(fā)酵過程中將蛋白質(zhì)降解為活性肽的過程[14]。根據(jù)發(fā)酵類型，可將微生物發(fā)酵分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵[15]。張奕[16]通過乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵新疆駝乳，在其上清液中提取的多肽對小鼠脾淋巴細胞增殖具有明顯的刺激作用，顯著增加干擾素γ（interferon γ，

IFN-γ）、白細胞介素12（interleukin 12，IL-12）、IL-23等細胞因子的表達，同時明顯降低核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）和IL-6的表達。在此研究中，研究者直接將發(fā)酵的駝乳上清液進行超濾制備多肽，避免了外部化學(xué)試劑的添加，在保證多肽純度的同時且節(jié)省制備時間，突顯了微生物發(fā)酵法制備多肽的優(yōu)勢。邢瀚文等[17]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚魚皮制備膠原蛋白肽，并超濾分離得到了具有最高抗氧化活性的多肽組分TSCP-c，為羅非魚皮的開發(fā)利用和膠原蛋白肽的技術(shù)生產(chǎn)途徑提供了理論指導(dǎo)。

此外，微生物發(fā)酵法制備免疫活性肽為提高副產(chǎn)物或下腳料的高值化提供了思路，侯銀臣等[18]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵羊胎盤的下腳料制備活性肽，當(dāng)料液pH 5.42、發(fā)酵43.45 h、碳源含量1.73%時，發(fā)酵產(chǎn)物對小鼠脾細胞增殖具有明顯的促進作用。微生物發(fā)酵法制備免疫活性肽工藝簡單、成本低，效率高，但是產(chǎn)物也受原料、菌種和工藝的影響[19]，發(fā)酵過程不易控制，產(chǎn)物不穩(wěn)定，因此如何利用微生物發(fā)酵制備出標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)品化的免疫活性肽亟待探究。

1.1.2 酶解法

提取免疫活性肽的酶解法是指通過蛋白酶水解使蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂，釋放出具有生物活性的肽段，酶解條件溫和，安全可控，已成為制備活性肽最常用的方

法[20]。蛋白酶的篩選、酶添加量、酶解時間、酶解溫度等都會影響產(chǎn)物活性。董曉澤等[21]比較了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解日本黃姑魚魚皮的產(chǎn)物對RAW264.7細胞相對增殖率的影響。結(jié)果選定中性蛋白酶為最優(yōu)酶，最佳酶解條件為pH值

為7、溫度45.5 ℃、時間5.5 h、酶添加量1 500 U/g，

液料比10∶1（V/m），在此工藝條件下所得魚皮酶解產(chǎn)物刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7的相對增殖率為57.47%。Qian Bingjun等[22]用胰蛋白酶、胃蛋白酶和脯氨酰內(nèi)肽酶酶解干牡蠣軟組織得到的4 種肽組分（PEP-1，PEP-2、TRYP-2和MIX-2）對RAW264.7細胞無細胞毒性，并且可以選擇性地抑制促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1β、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的產(chǎn)生。綜上所述，酶解法制備多肽需要對酶種進行篩選，

對酶解條件進行探索和優(yōu)化才能得到具有理想免疫功能的多肽。

然而，由于蛋白酶酶切位點具有隨機性和不確定性，導(dǎo)致篩選蛋白酶的工作量繁重且有一定盲目性，生物信息學(xué)的發(fā)展和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的完善為酶解法提供了有效模擬手段。趙貴琴等[23]在蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索鱸魚心肌的肌球蛋白得到可靠氨基酸序列，并通過PeptideCutter網(wǎng)站，選擇低特異性的胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶3 種酶組合作用于鱸魚肌球蛋白進行虛擬酶解，最后根據(jù)需要篩選出了所需的肽鏈。計算機模擬的利用為多肽的酶解制備節(jié)省時間、降低實驗成本、提高效率，但是目前該方法只能對已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)進行模擬酶切，對于未知序列的蛋白酶解依然需要靠傳統(tǒng)方法探索條件，所以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫亟需擴充和完善。

1.1.3 其他制備方法

除常用的微生物發(fā)酵法和酶解法外，免疫活性肽的制備方法還有直接提取法和人工合成法。直接提取免疫調(diào)節(jié)肽多應(yīng)用于發(fā)酵食品，如干腌火腿作為一種長周期發(fā)酵肉制品，經(jīng)過內(nèi)源酶和微生物酶的共同作用使蛋白質(zhì)降解形成大量的肽段和游離氨基酸[24]，經(jīng)研究表明具有較好的生物活性。Fu Lijuan等[25]用0.2 mmol/L鹽酸提取宣威火腿的生物活性肽，測得肽含量為8.49%，并且證明了該多肽可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)。直接提取法可以最大程度保留原材料中的多肽種類，體現(xiàn)原材料本身的多肽組成和營養(yǎng)價值。人工合成法通常是基于已知肽的氨基酸序列，從氨基酸C末端到N末端進行縮合反應(yīng)，大多數(shù)用于獲得肽序列后進行合成，從而對相應(yīng)的肽性質(zhì)進行驗證，比如Fu Lijuan等[25]用質(zhì)譜獲得肽序列后，人工合成了4 條多肽（GPPGL、GPAGPL、GPPGAP和FSGL），并測定其對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞分泌NO和IL-6的影響，結(jié)果顯示GPAGPL和GPPGAP通過減少NO和IL-6的分泌而具有更高的抗炎能力。

1.2 免疫活性肽的分離純化和鑒定

免疫活性肽的分離純化和鑒定對于探究其生物活性及作用機理十分必要，常用的分離純化鑒定技術(shù)包括膜分離技術(shù)、色譜分離技術(shù)以及質(zhì)譜鑒定等。膜分離主要是利用分子質(zhì)量的不同進行多肽分離，在分離多肽中最常用的方法是超濾。色譜分離技術(shù)主要有離子交換色譜、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。多肽的鑒定多采用質(zhì)譜法，質(zhì)譜儀將多肽轟擊成碎片離子，然后根據(jù)質(zhì)荷比對不同的成分和結(jié)構(gòu)進行分析[26]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）經(jīng)常被用于識別多肽序列，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）可用于分析生成蛋白質(zhì)水解物的肽譜，此外還有紅外基質(zhì)輔助激光脫附電噴霧電離質(zhì)譜（infrared matrix assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometry，IR-MALDESI-MS）法以及液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-QQQ-MS）法等。

多肽的分離純化和鑒定中通常會采用多種方法聯(lián)用。Li Zhiyong等[27]將超聲波預(yù)處理的蠶蛹蛋白溶液進行酶解，經(jīng)過Sephadex G-100凝膠色譜柱分離，篩選出脾淋巴細胞增殖活性最高的組分，繼續(xù)用G-15凝膠色譜柱分離，并用RP-HPLC進行純化，多肽的分子質(zhì)量和氨基酸序列通過離子阱質(zhì)譜法測定，最終得到氨基酸序列為Asp-His-Ala-Val的四肽（DHAV）。曾瑜等[28]將厚殼貽貝粗肽依次經(jīng)過Sephadex G-25、RP-HPLC分離純化，再經(jīng)過LC-MS/MS檢測并篩選得到免疫活性肽LVVLGH。分離純化的方法各有優(yōu)缺點，比如超濾法雖然操作簡單成本低，但是分子質(zhì)量相近的混合物不適用該方法，所以在分離純化前對粗肽的分子質(zhì)量進行測定有助于對后續(xù)分離純化方法的選擇，不同的粗肽需要綜合考慮采用合適的方法進行分離純化。

1.3 基于生物信息學(xué)的免疫活性肽的鑒定和分析

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，計算機分析在生物活性肽的篩選和預(yù)測、生物功能預(yù)測以及結(jié)構(gòu)功能分析中的應(yīng)用越來越廣泛，其高通量分析能力和預(yù)測精度極大地提高了分析效率[29]?；谏镄畔W(xué)的生物活性肽識別和分析主要包括酶和底物蛋白的選擇、模擬酶水解、生物活性肽的鑒定和預(yù)測、生物活性的體內(nèi)和/或體外驗證以及作用機制的探究、多肽生物活性的預(yù)測和修飾等[30]。目前線上分析生物活性肽的數(shù)據(jù)庫有BIOPEP（https：//www.uwm.edu.pl/biochemia/）、PepBank（https：//pepbank.mgh.harvard.edu/）、AHTpin（https：//crdd.osdd.net/raghava/ahtpin/）、NCBI（https：//www.ncbi.nl m.nih.gov/protein/）等[31]，此外還有用PeptideCutter和BIOPEP-UWM等分析平臺對已知蛋白序列進行模擬酶切等研究[32]。Chen Junbo等[33]使用ProtParam工具計算10 種兔肉蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基數(shù)量，利用BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫評估作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽前體的所有蛋白質(zhì)的圖譜，將選定的蛋白質(zhì)序列采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶同時進行模擬水解后，利用BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫中的“Enzyme action”工具評估蛋白質(zhì)對酶促消化的敏感性，使用PeptidRanker計算釋放二肽、三肽和四肽的活性得分，活性評分＞0.5的肽被認為是潛在生物活性肽，然后通過BIOPEP數(shù)據(jù)庫篩選出具有潛在ACE抑制活性的肽EACF和CDF。此外也有研究利用計算機模擬對蛋白酶酶種進行高效篩選。Bleakley等[34]采用PeptideCutter對燕麥蛋白進行模擬酶切，以生成的寡肽數(shù)量為指標(biāo)建立肽庫，從89 種蛋白酶中篩選出4 種優(yōu)勢酶，制備出了高二肽基肽酶抑制活性的酶解產(chǎn)物，同時顯著降低了實驗成本。計算機模擬水解和多肽生物活性預(yù)測網(wǎng)站的利用極大地提高了免疫活性肽的篩選效率，生物信息技術(shù)的快速發(fā)展與數(shù)據(jù)庫的不斷完善，為動物源免疫活性肽的鑒定和分析提供了新的思路和方法，可以加快推進免疫活性肽的發(fā)掘與活性研究。

2 動物源免疫活性肽的作用機制

動物源免疫活性肽本身不具有抗原性，其通過與抗原遞呈細胞中的MHC II類分子結(jié)合并被T細胞識別后參與免疫應(yīng)答，對非特異性免疫和特異性免疫均有調(diào)節(jié)作用[10]。

2.1 動物源免疫活性肽對非特異性免疫的影響

非特異性免疫又稱先天性免疫或固有免疫，是機體抵御不同病原微生物入侵的第一道防線，通過生理組織屏障、免疫細胞或固有免疫分子進行免疫應(yīng)答[35]。巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞作為主要細胞群在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[36]。巨噬細胞表面覆蓋的多種受體可以識別外源物質(zhì)，促進巨噬細胞的極化，通過分泌細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)[10]。有研究表明紫貽貝免疫活性肽對小鼠RAW264.7巨噬細胞無毒性作用，并且能顯著促進細胞的增殖能力，還可以有效激活細胞分化，提高細胞對中性紅的吞噬能力[37]。珍珠貝水解肽可以降低脂多糖誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細胞NO和IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子的分泌量[38]。DCs作為抗原呈遞細胞發(fā)揮作用，是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，同時還可以分泌細胞因子參與T細胞和B細胞的活化[39]，比如蜘蛛毒分離肽分子質(zhì)量小于3 kDa的部分可以激活DCs，增加激活依賴性表面標(biāo)志物和細胞因子的釋放（IL-1和TNF-α）[40]。NK細胞可以發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，從健康小牛脾臟中提取的肽LP通過NF-κB信號通路顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的促炎細胞因子的過表達水平，經(jīng)LP處理后的NK細胞和腹腔巨噬細胞的活化細胞百分比顯著增加，LP可作為治療免疫系統(tǒng)疾病患者的潛在候選藥物[41]。由此可見，動物源免疫活性肽主要通過激活免疫細胞、促進免疫細胞的增殖以及吞噬能力、調(diào)控細胞分泌細胞因子等途徑發(fā)揮非特異性免疫作用。

2.2 動物源免疫活性肽對特異性免疫的影響

特異性免疫也被稱為適應(yīng)性免疫或獲得性免疫，是機體被特定的抗原刺激后產(chǎn)生專一抗體所形成的免疫，可分為細胞免疫和體液免疫，發(fā)揮主要作用的細胞為

T淋巴細胞和B淋巴細胞[42]。T淋巴細胞通過釋放免疫調(diào)節(jié)因子和介導(dǎo)與抗原遞呈細胞相互作用的細胞免疫發(fā)揮免疫功能，B淋巴細胞通過被抗原刺激后分化為漿細胞，漿細胞產(chǎn)生特異性抗體即免疫球蛋白來發(fā)揮免疫保護

機制[43]。Yu Fangmiao等[44]分離出的青蛤多肽SCSP以劑量依賴性的方式上調(diào)了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠血清中TNF-α的含量，并且使CD4＋T細胞計數(shù)增加，血清中的IgA、IgG、IgM和溶血素水平顯著升高，表明SCSP增強免疫抑制小鼠的細胞和體液免疫。也有研究表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽具有免疫調(diào)節(jié)活性，其通過減少MHC II、CD83和CD86的表達以及TNF-α、IL-12 p70和趨化因子的產(chǎn)生抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠骨髓源性DCs的成熟，還可以影響脂多糖刺激的骨髓基質(zhì)干細胞誘導(dǎo)同種異體T淋巴細胞增殖的能力，并通過激活T細胞降低IFN-γ的

產(chǎn)生[45]。Cao Hui等[46]從雞胸骨軟骨II型膠原中分離免疫調(diào)節(jié)肽，發(fā)現(xiàn)P3-2-4組分具有最高的脾淋巴細胞增殖活性和與人類白細胞抗原-DRB1分子的結(jié)合能力，表明其具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。綜上所述，動物源免疫活性肽可通過調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖活性、T細胞亞群的數(shù)量變化、免疫細胞因子和免疫球蛋白的分泌水平等途徑發(fā)揮特異性免疫調(diào)節(jié)作用。

3 動物源免疫活性肽功能評價

動物源免疫活性肽的功能評價主要包括體外細胞模型評價和體內(nèi)動物模型評價，免疫細胞的增殖活性檢測、巨噬細胞吞噬能力檢測、細胞因子的分泌檢測等是體內(nèi)外免疫學(xué)檢測常用的功能評價方法，同時還可以通過測定細胞通路中的蛋白分子表達情況探究免疫調(diào)控信號通路（表1）。

3.1 體外模型免疫活性評價

免疫活性肽的體外功能評價通常采用細胞模型來檢測。巨噬細胞通過吞噬作用直接殺死病原體，或通過釋放NO及細胞因子（如TNF-α和IL-6）間接殺死病原體，被認為是評估生物活性化合物免疫調(diào)節(jié)活性的理想細胞模型[47]，小鼠巨噬細胞RAW264.7是最常用的細胞模型之一。此外，DCs、人單核細胞U937巨噬細胞、結(jié)腸癌細胞（Caco-2細胞）、結(jié)直腸癌細胞（HT-29細胞）等亦用于免疫活性評價[48]。

動物源免疫活性肽可以通過促進巨噬細胞的增殖活化及細胞因子的分泌進行免疫調(diào)節(jié)。姜爍琦等[49]以中華管鞭蝦的蝦頭為原料制備了低分子質(zhì)量活性肽SCHPs-F1，發(fā)現(xiàn)其在一定濃度范圍內(nèi)可以劑量依賴性的促進RAW264.7細胞增殖，并且使巨噬細胞活化，增強其吞噬和趨化能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，SCHPs-F1顯著促進NO、TNF-α和IL-1β的分泌。進一步聯(lián)合采用免疫熒光、免疫印跡技術(shù)分析SCHPs-F1對RAW264.7細胞中NF-κB通路和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）相關(guān)通路蛋白的表達情況，推測其可能通過這兩條信號通路激活巨噬細胞以及相關(guān)細胞因子的釋放，從而呈現(xiàn)一定的體外免疫調(diào)節(jié)活性。金槍魚輔料的胰蛋白酶水解物分離得到的肽段可以增強RAW264.7細胞的吞噬能力，并促進NO、

IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，此外還顯著增加了Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4的表達，并進一步激活NF-κB信號通路以促進RAW264.7細胞的免疫反應(yīng)[50]。動物源免疫活性肽也可以通過抑制免疫細胞中促炎細胞因子的釋放發(fā)揮抗炎功效，比如鴨肝蛋白酶解后的活性肽[51]對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中NO、TNF-α和IL-6等炎癥細胞因子的釋放具有不同的抑制活性，表現(xiàn)出一定的抗炎作用。

除上述傳代細胞外，原代細胞也可以用作免疫活性評價。一般在無菌條件下提取小鼠腹腔巨噬細胞或者脾淋巴細胞培養(yǎng)后用多肽進行孵育預(yù)處理，通過檢測對比細胞活性、形態(tài)變化或者細胞因子分泌水平，從而對多肽的免疫活性進行評估。孫瑞坤[52]通過提取小鼠脾淋巴細胞來體外評估方格星蟲酶解產(chǎn)物的免疫活性，結(jié)果顯示，在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)可以促進小鼠脾淋巴細胞的增殖活性。Gao Song等[53]制備的牦牛骨膠原蛋白的木瓜蛋白酶水解物可以促進脾淋巴細胞的增殖和抑制巨噬細胞NO產(chǎn)生。

此外，研究表明食源性免疫活性肽的生物功效可能會受到胃腸消化吸收和代謝等的影響。邢路娟等[54]實驗證明經(jīng)體外胃腸道模擬消化后，干腌火腿肽段數(shù)量顯著增加，小肽數(shù)量占比增高，多肽對巨噬細胞炎癥因子分泌的抑制作用增強，表明胃腸道模擬消化使火腿多肽降解產(chǎn)生了大量小分子肽，且增強了其抗炎作用。然而也有多肽的生物功效不受胃腸道消化的影響，但經(jīng)細胞轉(zhuǎn)運后生物功效明顯提高。Liang Qiufang等[55]研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物及其胃腸道模擬消化物均顯著降低了TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中促炎血管細胞黏附分子-1的表達，但是模擬消化前后的抗炎活性并無顯著性差異。然而經(jīng)過Caco-2細胞上皮轉(zhuǎn)運后獲得的多肽抗炎活性顯著提升，可能是由于轉(zhuǎn)運后抗炎肽的選擇性積累或在Caco-2細胞中肽酶的作用下形成具有高生物活性

的新肽。

3.2 動物模型免疫活性評價

免疫活性肽的體內(nèi)功能評價通常利用動物模型來評估，通常用多肽喂養(yǎng)正常小鼠或者免疫抑制的小鼠模型，分析小鼠體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、脾淋巴細胞增殖活性、細胞因子分泌和免疫球蛋白表達情況等來評估多肽的免疫活性。王敏等[56]用不同劑量的鮑魚水解肽喂養(yǎng)正常小鼠，體質(zhì)量無明顯變化，免疫器官胸腺和脾臟與體質(zhì)量的比值差異不顯著，表明水解肽對小鼠機體無明顯毒性作用，同時高劑量的水解肽顯著提高了小鼠的單核-巨噬細胞吞噬能力，對NK細胞的活性具有極顯著的促進作用，表明鮑魚水解肽具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。也有研究以免疫抑制小鼠為模型評估多肽的免疫活性。段毅超等[57]研究結(jié)果顯示黃牛骨肽可以緩解免疫抑制小鼠的體質(zhì)量下降，增加小鼠的相對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，并且多肽的中高劑量組小鼠比免疫抑制組小鼠的血清溶血素抗體水平顯著增加，表明黃牛骨肽具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。楊志艷等[58]通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型，探究毛蝦活性肽的免疫調(diào)節(jié)功能，結(jié)果顯示小鼠經(jīng)不同劑量組的活性肽灌胃后，免疫抑制小鼠的體質(zhì)量顯著增加，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著提高，血清中免疫球蛋白（IgA、IgG和IgM）以及細胞因子

（IL-2、IL-6和TNF-α）水平也明顯提升，外周血白細胞總數(shù)基本恢復(fù)正常水平，NK細胞活性顯著增強，表明毛蝦活性肽可以改善免疫抑制劑導(dǎo)致的免疫功能損傷，具有增強免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)的作用。此外，也有研究表明黃塘龜和三紋箱龜?shù)牡鞍酌附馕锟筛淖儹h(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫缺陷型小鼠體質(zhì)量增長曲線、胸腺和脾臟指數(shù)、血清超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶活性，具有良好的免疫增強效果[59]。除了上述常用的測定指標(biāo)外，也有學(xué)者通過探究活性肽對免疫抑制小鼠的腸道黏膜免疫功能的影響，揭示其免疫調(diào)節(jié)作用。劉銀媛等[60]研究表明鳀魚蛋白肽可以減輕環(huán)磷酰胺造成的小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，提高小腸絨毛長度，降低隱窩深度，同時還能夠改善環(huán)磷酰胺對小腸黏膜中免疫因子的抑制，上調(diào)免疫球蛋白的分泌和小腸中TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB基因表達，具有改善環(huán)磷酰胺對腸黏膜結(jié)構(gòu)造成的損傷和腸黏膜免疫功能的作用。

4 結(jié) 語

目前有大量研究者對動物源免疫活性肽的制備、作用機制以及功能評價進行了探討，免疫活性肽可以促進免疫調(diào)節(jié)，減輕炎癥反應(yīng)，在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但是仍有諸多方向亟待加強研究。一是創(chuàng)新免疫活性肽的制備方法，目前常用的是酶解法且研究多集中在探討酶解條件上，可以擴充活性肽的制備研究思路，比如通過物理技術(shù)（超高壓、超聲波等）輔助酶解，微生物-酶協(xié)同法等高效制備活性肽，開發(fā)新的活性肽制備工藝；二是提高免疫活性肽的篩選效率，目前常用的免疫活性肽分離純化方法耗時長且純度不高，可以充分利用計算機模擬、數(shù)據(jù)庫篩選并結(jié)合組學(xué)技術(shù)提高活性肽的篩選效率；三是動物源性免疫活性肽的作用機制有待深入研究，免疫調(diào)節(jié)與多種免疫疾病，如炎癥、高血壓和其他過敏性疾病密切相關(guān)，對作用機制的深入探討可以為活性肽預(yù)防和治療相應(yīng)疾病提供理論基礎(chǔ)；四是活性肽的功能評價目前多為細胞模型和動物模型，缺少臨床試驗或者人體試驗來驗證免疫調(diào)節(jié)作用。此外免疫活性肽功效評價相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)亟待完善，以促進評價指標(biāo)的規(guī)范性和科學(xué)性。

參考文獻：

[1] JAKUBCZYK A， KARA? M， RYBCZY?SKA-TKACZYK K， et al.

Current trends of bioactive peptides： new sources and therapeutic effect[J]. Foods， 2020， 9（7）： 846. DOI：10.3390/foods 9070846.

[2] MANZOOR M， SINGH J， GANI A. Exploration of bioactive peptides from various origin as promising nutraceutical treasures： in vitro， in silico and in vivo studies[J]. Food Chemistry， 2022， 373： 131395. DOI：10.1016/j.foodchem.2021.131395.

[3] SAMTIYA M， ACHARYA S， PANDEY K K， et al. Production， purification， and potential health applications of edible seeds’ bioactive peptides： a concise review[J]. Foods， 2021， 10（11）： 2696. DOI：10.3390/foods10112696.

[4] XU Z， MAO T M， HUANG L， et al. Purification and identification immunomodulatory peptide from rice protein hydrolysates[J]. Food and Agricultural Immunology， 2019， 30（1）： 150-162. DOI：10.1080/09540105.2018.1553938.

[5] PAVLICEVIC M， MARMIROLI N， MAESTRI E. Immunomodulatory peptides： a promising source for novel functional food production and drug discovery[J]. Peptides， 2022， 148： 170696. DOI：10.1016/j.peptides.2021.170696.

[6] 方心宇， 冷瑞雪， 范引光， 等. 自身免疫性疾病流行病學(xué)研究進展[J].

中華疾病控制雜志， 2021， 25（8）： 869-873. DOI：10.16462/j.cnki.zhjbkz.2021.08.001.

[7] 姬芳玲， 吳健， 賈凌云. 免疫吸附治療自身免疫疾病的研究進展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展， 2022， 49（1）： 139-148. DOI：10.16476/j.pibb.2021.0384.

[8] 羅仁幸， 王妍妍， 黃功華. 納米載藥技術(shù)在幾種常見自身免疫性疾病模型中的應(yīng)用研究進展[J]. 中南藥學(xué)， 2023（7）： 1890-1896.

DOI：10.7539/j.issn.1672-2981.2023.07.032.

[9] SINGH B P， ALUKO R E， HATI S， et al. Bioactive peptides in the management of lifestyle-related diseases： current trends and future perspectives[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2022， 62（17）： 4593-4606. DOI：10.1080/10408398.2021.1877109.

[10] 馬可兒， 李衛(wèi)靜， 何榮. 免疫調(diào)節(jié)肽的研究進展及開發(fā)現(xiàn)狀[J].

糧食科技與經(jīng)濟， 2022， 47（5）： 114-120. DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20220527.

[11] JOLLES P， PARKER F， FLOC’H F， et al. Immunostimulating substances from human casein[J]. Journal of Immunopharmacology， 1981， 3（3/4）： 363-370. DOI：10.3109/08923978109031067.

[12] LI Z Y， ZHAO S， XIN X D， et al. Purification and characterization of a novel immunomodulatory hexapeptide from alcalase hydrolysate of ultramicro-pretreated silkworm （Bombyx mori） pupa protein[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2019， 22（3）： 633-637. DOI：10.1016/j.aspen.2019.04.005.

[13] NARAYANASAMY A， BALDE A， RAGHAVENDER P， et al. Isolation of marine crab （Charybdis natator） leg muscle peptide and its anti-inflammatory effects on macrophage cells[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology， 2020， 25： 101577. DOI：10.1016/j.bcab.2020.101577.

[14] RAVESCHOT C， CUDENNEC B， COUTTE F， et al. Production of bioactive peptides by Lactobacillus species： from gene to application[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 2354. DOI：10.3389/fmicb.2018.02354.

[15] CHAI K F， VOO A Y H， CHEN W N. Bioactive peptides from food fermentation： a comprehensive review of their sources， bioactivities， applications， and future development[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2020， 19（6）： 3825-3885. DOI：10.1111/1541-4337.12651.

[16] 張奕. 新疆發(fā)酵駝乳免疫活性肽的分離鑒定及免疫調(diào)節(jié)機制研究[D].

烏魯木齊： 新疆醫(yī)科大學(xué)， 2016.

[17] 邢瀚文， 韓瑋， 施文正， 等. 固態(tài)發(fā)酵法制備羅非魚皮膠原蛋白肽及其抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2020， 46（19）： 104-110. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024123.

[18] 侯銀臣， 吳麗， 劉旺旺， 等. 羊胎盤免疫活性肽的制備及其活性[J].

中國食品學(xué)報， 2016， 16（1）： 123-129. DOI：10.16429/j.1009-7848.2016.01.017.

[19] 高博雅， 李平蘭. 微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)水產(chǎn)膠原蛋白肽的研究進展[J]. 中國釀造， 2023， 42（3）： 1-7. DOI：10.11882/j.issn.0254-5071.2023.03.001.

[20] 傅麗娟， 邢路娟， 張萬剛. 食源性抗炎活性肽的研究進展[J]. 中國食品學(xué)報， 2022， 22（8）： 343-352. DOI：10.16429/j.1009-7848.2022.08.037.

[21] 董曉澤， 徐書敏， 王麗君， 等. 日本黃姑魚魚皮免疫活性肽的酶解制備工藝研究[J]. 浙江海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2020， 39（2）： 110-116.

[22] QIAN B J， ZHAO X， YANG Y， et al. Antioxidant and anti-inflammatory peptide fraction from oyster soft tissue by enzymatic hydrolysis[J]. Food Science amp; Nutrition， 2020， 8（7）： 3947-3956. DOI：10.1002/fsn3.1710.

[23] 趙貴琴， 李婷婷， 宋敏杰， 等. 分子對接技術(shù)篩選鱸魚肌球蛋白中黃嘌呤氧化酶抑制肽[J]. 中國食品學(xué)報， 2021， 21（6）： 81-91. DOI：10.16429/j.1009-7848.2021.06.010.

[24] 李平， 楊婷， 周輝， 等. 干腌火腿中生物活性肽功能特性研究進展[J].

食品科學(xué)， 2021， 42（11）： 278-283. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20200418-238.

[25] FU L J， XING L J， HAO Y J， et al. The anti-inflammatory effects of dry-cured ham derived peptides in RAW264.7 macrophage cells[J]. Journal of Functional Foods， 2021， 87： 104827. DOI：10.1016/j.jff.2021.104827.

[26] 謝博， 傅紅， 楊方. 生物活性肽的制備、分離純化、鑒定以及構(gòu)效關(guān)系研究進展[J]. 食品工業(yè)科技， 2021， 42（5）： 383-391. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020050012.

[27] LI Z Y， ZHAO S， XIN X D， et al. Purification， identification and functional analysis of a novel immunomodulatory peptide from silkworm pupa protein[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics， 2020， 26： 243-249. DOI：10.1007/s10989-019-09832-4.

[28] 曾瑜. 厚殼貽貝活性肽的分離純化、表征及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D]. 舟山： 浙江海洋大學(xué)， 2022.

[29] FITZGERALD R J， CERME?O M， KHALESI M， et al. Application of in silico approaches for the generation of milk protein-derived bioactive peptides[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 64： 103636. DOI：10.1016/j.jff.2019.103636.

[30] TU M L， CHENG S Z， LU W H， et al. Advancement and prospects of bioinformatics analysis for studying bioactive peptides from food-derived protein： sequence， structure， and functions[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry， 2018， 105： 7-17. DOI：10.1016/j.trac.2018.04.005.

[31] GUO Q Y， CHEN P F， CHEN X G. Bioactive peptides derived from fermented foods： preparation and biological activities[J]. Journal of Functional Foods， 2023， 101： 105422. DOI：10.1016/j.jff.2023.105422

[32] 李富強， 張廷新， 朱麗萍， 等. 食物蛋白源免疫調(diào)節(jié)肽研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2022， 48（1）： 308-314. DOI：10. 13995/j.cnki.11-1802/ts. 028607.

[33] CHEN J B， YU X D， CHEN Q Z， et al. Screening and mechanisms of novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from rabbit meat proteins： a combined in silico and in vitro study[J]. Food Chemistry， 2022， 370： 131070. DOI：10.1016/j.foodchem. 2021.131070

[34] BLEAKLEY S， HAYES M， O’SHEA N， et al. Predicted release and analysis of novel ACE-I， renin， and DPP-IV inhibitory peptides from common oat （Avena sativa） protein hydrolysates using in silico analysis[J]. Foods， 2017， 6（12）： 108. DOI：10.3390/foods6120108.

[35] 尚麗君， 譙仕彥. 天然免疫調(diào)節(jié)肽的研究進展[J]. 飼料工業(yè)， 2022， 43（5）： 55-60. DOI：10.13302/j.cnki.fi.2022.05.010.

[36] TAK Y， KAUR M， AMAROWICZ R， et al. Pulse derived bioactive peptides as novel nutraceuticals： a review[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics， 2021， 27（3）： 2057-2068. DOI：10.1007/s10989-021-10234-8.

[37] 于瑩， 宿小杰， 周德慶， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化紫貽貝免疫活性肽的制備工藝[J]. 中國海洋藥物， 2021， 40（6）： 21-29. DOI：10.13400/j.cnki.cjmd.2021.06.001.

[38] 沈金鵬， 王珂雯， 黃潘鈿， 等. 珍珠貝水解肽的制備、氨基酸組成及抗炎活性[J]. 食品與機械， 2023， 39（2）： 132-139; 206. DOI：10.13652/j.spjx.1003.5788.2022.80425.

[39] 李琳琳， 朱珊， 陳京濤. 外泌體調(diào)控樹突狀細胞免疫功能的研究進展[J]. 中國免疫學(xué)雜志， 2023， 39（2）： 404. DOI：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.02.034.

[40] DE MATO F C， BARRETO N， CORDEIRO G， et al. Isolated peptide from spider venom modulates dendritic cells in vitro： a possible application in oncoimmunotherapy for glioblastoma[J]. Cells， 2023， 12（7）： 1023. DOI：10.3390/cells12071023.

[41] WANG J， ZHENG M Z， MIN Q X， et al. The dual regulatory function of lienal peptide on immune system[J]. International Immunopharmacology， 2018， 55： 245-253. DOI：10.1016/j.intimp.2017.12.005.

[42] 李欣茹， 趙永強， 薛長湖， 等. 海洋源活性多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2023， 14（2）： 138-145. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2023.02.017.

[43] 文李， 劉步青， 許宙， 等. 食源性免疫活性肽的篩選策略及作用機制研究進展[J]. 食品與機械， 2020， 36（2）： 7-11; 37. DOI：CNKI：SUN：SPJX.0.2020-02-002.

[44] YU F M， ZHANG Z W， YE Shengwang， et al. Immunoenhancement effects of pentadecapeptide derived from Cyclina sinensis on immune-deficient mice induced by cyclophosphamide[J]. Journal of Functional Foods， 2019， 60： 103408. DOI：10.1016/j.jff.2019.06.010.

[45] RATHNAPALA E C N， AHN D U， ABEYRATHNE S. Functional properties of ovotransferrin from chicken egg white and its derived peptides： a review[J]. Food Science and Biotechnology， 2021， 30（5）： 619-630. DOI：10.1007/s10068-021-00901-3.

[46] CAO H， CAO J F， ZHANG Y J， et al. Continuous preparation and characterization of immunomodulatory peptides from type II collagen by a novel immobilized enzyme membrane reactor with improved performance[J]. Journal of Food Biochemistry， 2019， 43（7）： e12862. DOI：10.1111/jfbc.12862.

[47] ZHANG M M， WANG G， LAI F R， et al. Structural characterization and immunomodulatory activity of a novel polysaccharide from Lepidium meyenii[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2016， 64（9）： 1921-1931. DOI：10.1021/acs.jafc.5b05610.

[48] 張芷萌， 倪策， 歐曉暉， 等. 食源性生物活性肽的免疫功能研究進展[J].食品與機械， 2023， 39（5）： 193-202. DOI：10.13652/j.spjx.1003.5788.2022.60156.

[49] 姜爍琦. 中華管鞭蝦蝦頭活性肽的免疫調(diào)節(jié)作用研究[D]. 舟山：

浙江海洋大學(xué)， 2021. DOI：10.27747/d.cnki.gzjhy.2021.000270.

[50] CAI B N， CHEN H， WAN P， et al. Isolation and identification of immunomodulatory peptides from the protein hydrolysate of tuna trimmings （Thunnas albacares）[J]. LWT-Food Science and Technology， 2022， 164： 113614. DOI：10.1016/j.lwt.2022.113614.

[51] 張來弟， 孫楊贏， 周昌瑜， 等. 鴨肝蛋白酶解產(chǎn)物中抗炎肽的分離鑒定及活性分析[J]. 食品科學(xué)， 2023， 44（12）： 150-156. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20211216-196.

[52] 孫瑞坤. 裸體方格星蟲活性肽的酶法制備及其免疫活性的研究[D]. 廣州： 廣東海洋大學(xué)， 2019.

[53] GAO S， HONG H， ZHANG C Y， et al. Immunomodulatory effects of collagen hydrolysates from yak （Bos grunniens） bone on cyclophosphamide-induced immunosuppression in BALB/c mice[J]. Journal of Functional Foods， 2019， 60： 103420. DOI：10.1016/j.jff.2019.103420.

[54] 邢路娟， 任曉鏷， 王紫旭， 等. 體外胃腸道消化及跨膜轉(zhuǎn)運對干腌火腿肽抗炎活性的影響[J]. 肉類研究， 2022， 36（10）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-120.

[55] LIANG Q F， CHALAMAIAH M， REN X F， et al. Identification of new anti-inflammatory peptides from zein hydrolysate after simulated gastrointestinal digestion and transport in Caco-2 cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2018， 66（5）： 1114-1120. DOI：10.1021/acs.jafc.7b04562.

[56] 王敏， 盧賽， 張曾亮. 鮑魚水解肽的抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品工業(yè)科技， 2021， 42（5）： 282-288. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020050062.

[57] 段毅超， 郭汝悅， 劉懷高， 等. 黃牛骨肽對巨噬細胞及免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品研究與開發(fā)， 2022， 43（24）： 58-65. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2022.24.009.

[58] 楊志艷， 惠婷婷， 祝寶華， 等. 中國毛蝦活性肽對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2023， 44（9）： 380-386. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022080148.

[59] LV Y B， ZHOU Q， FAN Y， et al. Preparation， structural identification and intervention on immunodeficiency mice of enzymatic peptides from Mauremys mutica and Cuora trifasciata[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2019， 241： 111920. DOI：10.1016/j.jep.2019.111920.

[60] 劉銀媛， 王寒梅， 逯良忠， 等. 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成和小腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性的比較[J]. 食品科學(xué)， 2023， 44（19）： 107-117. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230103-015.