柯永鑫 林立建

（福州市長(zhǎng)樂區(qū)醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 福州 350005）

隨著我國人口的老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的發(fā)病率和死亡率逐年攀升。脂質(zhì)代謝改變、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的主要發(fā)病機(jī)制[1]?？刂粕踔聊孓D(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展，對(duì)于防治ASCVD具有重大的意義。環(huán)糊精是一種天然的由葡萄糖分子組成的環(huán)狀淀粉類物質(zhì)，可在水溶液中形成環(huán)狀的空腔結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精能夠與血液中的膽固醇和脂類相結(jié)合，形成水溶性的復(fù)合物，從而減少動(dòng)脈壁的脂質(zhì)物質(zhì)的沉積，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有一定的潛在益處[2]。本研究擬通過高脂誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，采用皮下注射環(huán)糊精，觀察其對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及內(nèi)膜斑塊面積、血清膽固醇以及血管功能的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 ApoE-/-小鼠，C57BL/6小鼠（體重20～22 g，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0022），羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，美國MCE公司），乙酰膽堿（Ach），去甲腎上腺素（NE），硝普納（SNP），RIPA蛋白裂解液、NO檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒，小鼠IL-6檢測(cè)試劑盒（云克?。?，Tris-base緩沖液，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Millipore公司），NFκB p65抗體、p66Shc抗體、p-p66Shc抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（美國CST公司），β-actin單克隆抗體和免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組方案 選取20只8周齡雄性小鼠做基因敲除，并被隨機(jī)分為2組：ApoE-/-組+安慰劑（安慰劑組）、ApoE-/-+環(huán)糊精2 g/kg（環(huán)糊精組），每組10只。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，人工光照明每天12 h，高脂飼料（在標(biāo)準(zhǔn)飼料配方中添加1%膽固醇，0.5%膽酸鈉，10%蛋黃粉、10%豬油）。自由飲水。另外選取10只8周齡雄性C57BL/6小鼠作為對(duì)照組，自由取食飲水。將HP-β-CD溶于生理鹽水中，每周皮下注射2次，連續(xù)12周，其他兩組小鼠均予注射等量生理鹽水。

1.3 蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin staining，HE染色）用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上，暴露腹主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈抽血處死動(dòng)物，立即行腹主動(dòng)脈插管，用0.1 mg/mL硝普鈉充分?jǐn)U張血管后，用加入伊紅的10%甲醛溶液在60 cm H2O～80 cm H2O柱壓下灌注固定血管6 h～12 h。取小鼠降主動(dòng)脈0.5 cm，PBS漂洗1～2 min，于10%福爾馬林浸泡24 h后自來水沖洗5～10 min，酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色，封片，顯微鏡下觀察拍照，采用自動(dòng)成像軟件系統(tǒng)(Image5.0）分析并計(jì)算胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積。

1.4 小鼠血清樣本制備 采用摘眼球法約取0.5 ml小鼠全血于1.5 ml的EP管中，在室溫下靜置10 min；離心10 min，取上清液在離心管中備用。

1.5 胸主動(dòng)脈血管環(huán)試驗(yàn) 采用Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀采集處理系統(tǒng)（ADInstruments，Australia），取胸主動(dòng)脈放入4 ℃飽和氧 Kreb’s液中，在解剖鏡下分離出動(dòng)脈周圍組織，顯微剪剪取3 mm血管環(huán)，掛鉤，連接張力換能器，調(diào)前負(fù)荷至0.5 g，加37℃Kreb's液5 ml并通入95% O2和5% CO2混合氣體；血管平衡20 min，通過PowerLab多導(dǎo)生理儀測(cè)血管環(huán)對(duì)Ach（10-9～10-5mmol/L）和硝普納（10-9～10-5mmol/L）的舒張反應(yīng)。血管舒張效應(yīng)=該血管舒張張力絕對(duì)值/ NE（10-5mmol/L）誘導(dǎo)血管收縮張力絕對(duì)值×100%表示，用Probit法計(jì)算半數(shù)最大效應(yīng)濃度（EC50），舒張反應(yīng)敏感性采用pD2值表示（pD2表示產(chǎn)生產(chǎn)生半數(shù)最大效應(yīng)的摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)）。

1.6 小鼠血脂水平的測(cè)定 使用全自動(dòng)血清生化分析儀測(cè)定各組小鼠的血脂水平，包括總膽固醇（TC）水平、甘油三酯（TG）水平、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平等。

1.7 硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)血清丙二醛（MDA）水平 根據(jù)試劑盒說明書準(zhǔn)備測(cè)量試劑，吸取0.6 ml試劑1加入0.2 ml樣本血清混勻；90 ℃水浴30 min，10000 g室溫離心10 min，取上清液，測(cè)定樣品在532 nm和600 nm下的吸光度（A532，A600），按試劑盒上的說明進(jìn)行MDA含量的計(jì)算：MDA含量（nmol/mL）＝[（A532-A600）×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣本＝25.8×（A532-A600）[6]。

V反總：反應(yīng)體系總體積；ε：MDA 摩爾吸光系數(shù)；V樣本：加入樣本體積；d：比色皿光徑。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)血清炎癥因子IL-6水平 應(yīng)用ELISA法測(cè)血清中IL-6水平。根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行測(cè)定。用酶標(biāo)儀（Thermo，USA）測(cè)定IL-6在450 nm處的吸光度。

1.9 硝酸還原酶法測(cè)血清NO含量 運(yùn)用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，通過Griess試劑檢測(cè)亞硝酸鹽，測(cè)定總一氧化氮的含量。遵循試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行測(cè)定，使用酶標(biāo)儀（Thermo，USA）測(cè)定一氧化氮在540 nm處的吸光度。

1.10 蛋白提取和免疫印跡法測(cè)定蛋白的氧化水平 選取ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈（隔肌上）長(zhǎng)約1 cm，剝?nèi)パ芡饽そM織，用PBS漂洗1～2次，加0.5 ml RIPA裂解緩沖液勻漿，根據(jù)等體積 2×SDS上樣緩沖液，震蕩15 s，在放入100℃水浴煮10 min，12000 g 4℃離心10 min，靜置后取上清-80℃保存?zhèn)溆?。?duì)蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)膜和封閉，加入一抗Total-p66Shc、p-p66Shc、NF-κB-P65、eNOS 抗體（1:1000）、β-actin（1:2000），二抗（1:5000）孵育、顯影，采用β-actin作為內(nèi)參照，蛋白表達(dá)水平采用目的蛋白/β-actin的比值。測(cè)定各組小鼠胸主動(dòng)脈促氧化銜接蛋白（p66Shc）磷酸化水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。針對(duì)單一因素多個(gè)組的比較采用單向方差分析（one-way ANOVA），而兩兩比較則使用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法。顯著性水平設(shè)定為P＜0.05，表明存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)糊精抑制ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊的形成 病理結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜表現(xiàn)為平滑，無增厚，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性良好且完整，中膜肌層的厚度均勻，平滑肌層的細(xì)胞排列整齊；安慰劑組小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)增厚和斑塊形成，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性中斷，中膜肌層的厚度不均勻且平滑肌層的細(xì)胞排列不規(guī)則；環(huán)糊精組小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)光滑，內(nèi)膜連續(xù)性相對(duì)較好且相對(duì)完整，中膜肌層的厚度相對(duì)均勻，平滑肌層的細(xì)胞排列規(guī)則。

斑塊面積及血管中膜厚度分析顯示：與對(duì)照組（無斑塊）相比，安慰劑組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積（205.48±23.61）μm2顯著增加；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積顯著減小[（78.06±9.03）μm2vs.（205.48±23.61）μm2，P＜0.01]（圖1）。

圖1 三組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣面積的比較

2.2 環(huán)糊精對(duì)高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 與對(duì)照組相比，安慰劑組和環(huán)湖精組小鼠空腹血TG、TC、LDL-C水平均增加（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組血TG、TC、LDL-C水平降低，環(huán)糊精可降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂水平（P＜0.01）；但HDL-C水平在三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 三組小鼠血脂水平的比較（mmol/L）

2.3 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈舒張功能的影響 與對(duì)照組相比，安慰劑組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性（Ach介導(dǎo)）與非內(nèi)皮依賴性（SNP介導(dǎo)）的舒張作用降低，當(dāng)Ach為10-7mol/L，SNP為10-7mol/L時(shí)，安慰劑組舒張功能pD2值較對(duì)照組均顯著降低（Ach：10.187±1.162vs.74.254±0.481，t=19.647，P=0.000；SNP：22.543±2.712vs.43.248±5.556，t=10.622，P=0.000）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性及非內(nèi)皮依賴性舒張功能（pD2值）均明顯增高（Ach：7.286±0.432vs.6.147±0.285，t=6.949，P＜0.001；SNP：8.453±0.456vs.6.864±0.483，t=7.570，P＜0.001（圖2）。

圖2 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈舒張功能的影響

2.4 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠血清MDA、IL-6及NO水平的影響 與對(duì)照組相比，安慰劑組小鼠血清MDA、IL-6水平均升高（P＜0.01），NO水平降低（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠血清MDA及IL-6均降低（P＜0.01），NO水平均升高（P＜0.01）（表2）。

表2 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠血清丙二醛、IL-6及一氧化氮水平的影響

2.5 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈促氧化銜接蛋白（p66Shc）磷酸化水平的影響 與對(duì)照組相比，安慰劑組小鼠胸主動(dòng)脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平增加（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠胸主動(dòng)脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平降低（P＜0.01），提示環(huán)糊精可抑制ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平（圖3）。

2.6 環(huán)糊精對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65及eNOS表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，安慰劑組小鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01），eNOS蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），而eNOS蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）（圖4）。

3 討論

高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化的經(jīng)典模型，已廣泛用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化的研究中[3]。本研究采用高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。安慰劑組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平升高。此外，ApoE-/-小鼠內(nèi)皮依賴性和非依賴性的血管功能下降。

環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖單體通過α-1，4-糖苷鍵相互連接而成的一類環(huán)狀化合物，環(huán)糊精內(nèi)腔疏水而外腔親水,具備剔除脂蛋白復(fù)合分子中或活細(xì)胞表面脂質(zhì)分子的能力。近年來環(huán)糊精在動(dòng)物模型中對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用已被大量研究所證實(shí)[4]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)糊精組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積及血管中膜厚度減小，內(nèi)皮依賴性和非依賴性血管功能顯著改善；環(huán)糊精可增加巨噬細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中氧化型低密度脂蛋白膽固醇的表達(dá)，增強(qiáng)膽固醇外流和抗炎作用，抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的病程進(jìn)展[5]。

氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化中起到至關(guān)重要因素，環(huán)糊精具有抗氧化作用，從而抑制氧化損傷動(dòng)脈壁[6]。本研究中，環(huán)糊精改善血管功能可能與其改善血脂水平、減輕血管炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激等因素有關(guān)。Xiao等[7]研究顯示p66Shc介導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮功能。p66Shc是Shc蛋白家族成員之一，可表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。在氧化應(yīng)激條件下，Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶Cβ和P53等激活，促進(jìn)線粒體產(chǎn)生活性氧，并且66Shc缺失抑制動(dòng)脈粥樣斑塊形成，其機(jī)制與p66Shc的氧化還原功能有關(guān)[8]。ox-LDL通過NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而激活PKCβ和JNK，促進(jìn)p66Shc磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)活性氧生成。ox-LDL亦通過p66Shc啟動(dòng)子去甲基化，促進(jìn)p66Shc轉(zhuǎn)錄及活性氧生成，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。與上述研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，安慰劑組胸主動(dòng)脈p-p66Shc水平顯著上調(diào)，MDA水平升高，SOD活性下降，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙；環(huán)糊精可能通過降低p-p66Shc介導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激，上調(diào)eNOS的表達(dá)水平，改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血管功能[9]。炎癥通路在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中起重要作用，NF-κB作為炎癥通路的關(guān)鍵成員，其激活可導(dǎo)致eNOS表達(dá)下降，引起血管內(nèi)皮功能障礙[10]。本研究結(jié)果顯示安慰劑組小鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著增加，IL-1β及IL-6水平升高，eNOS表達(dá)水平顯著下降；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠NFκB p65蛋白、IL-1β及IL-6水平降低，eNOS表達(dá)水平升高。

綜上所述，基于環(huán)糊精在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中環(huán)糊精能夠降低血脂水平、減少動(dòng)脈粥樣硬化面積、改善血管舒張功能等優(yōu)勢(shì)。因此，環(huán)糊精有望作為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療藥物。