胡昱顓，王全興，張金藝，宋水林，蔣軍喜,2，熊桂紅,2*

南方水稻黑條矮縮病毒基因的克隆與原核表達(dá)

胡昱顓1，王全興1，張金藝1，宋水林1，蔣軍喜1,2，熊桂紅1,2*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省薯芋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

【目的】為克隆獲得南方水稻黑條矮縮病毒(，SRBSDV)的基因并實(shí)現(xiàn)其原核表達(dá)?！痉椒ā坷肦T-PCR技術(shù)從感染SRBSDV的水稻葉片中擴(kuò)增出基因。利用Gateway重組技術(shù)將基因整合到原核表達(dá)載體pDEST17上，獲得重組原核表達(dá)載體pDEST17-。隨后將原核表達(dá)載體pDEST17-轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株中。利用IPTG誘導(dǎo)P7-2蛋白表達(dá)并優(yōu)化其誘導(dǎo)條件?！窘Y(jié)果】利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到基因，其大小為930 bp。測序結(jié)果表明獲得原核表達(dá)載體pDEST17-。菌液PCR鑒定了原核表達(dá)陽性菌株。在溫度為28 ℃、IPTG濃度為0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h，可獲得大量大小約為42 kDa含HIS標(biāo)簽的融合蛋白?！窘Y(jié)論】克隆獲得了SRBSDV的基因序列，實(shí)現(xiàn)了該基因的原核表達(dá)并探索其最佳誘導(dǎo)條件，為南方水稻黑條矮縮病的田間診斷、預(yù)測預(yù)報(bào)及的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）；RT-PCR；基因；原核表達(dá)

【研究意義】近年在我國南方稻區(qū)大面積發(fā)生的南方水稻黑條矮縮病是由南方水稻黑條矮縮病毒（，SRBSDV）引起的，是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一[1]。由于南方水稻黑條矮縮病發(fā)生后缺乏直接高效的防控方法，因此預(yù)測預(yù)報(bào)在該病的防治中顯得尤為重要。而該病害預(yù)測預(yù)報(bào)的關(guān)鍵在于傳毒介體帶毒率和水稻植株發(fā)病率的檢測。SRBSDV基因組包含10條dsRNA，共編碼13個(gè)蛋白[1-3]。其中P7-2的功能未知。因此克隆SRBSDV基因并進(jìn)行原核表達(dá)，可為南方水稻黑條矮縮病的診斷及P7-2功能的研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SRBSDV是斐濟(jì)病毒屬（）的成員[1-3]。該病害廣泛分布在東亞稻區(qū)的大部分國家[4]。在中國，SRBSDV的分布與爆發(fā)主要集中在南部稻區(qū)，包括江西等地[5-6]。SRBSDV田間主要的傳毒介體為遷飛性昆蟲白背飛虱[7-10]，以持久性增殖型方式進(jìn)行傳毒[11-12]。該病毒除感染水稻、玉米、高粱等糧食作物外，還可以侵染牛筋草、稗草等多種禾本科雜草[7,13]。南方水稻黑條矮縮病的主要初侵染源是春季遷入的帶毒白背飛虱，再由帶毒白背飛虱傳入稻田為害水稻，因此白背飛虱的帶毒率及水稻的發(fā)病率是預(yù)測南方水稻黑條矮縮病發(fā)生程度的重要依據(jù)[14]。水稻病毒病的檢測方法主要有RT-PCR[15-16]、血清學(xué)技術(shù)和核酸分子雜交等，其中較常用的方法是血清學(xué)技術(shù)[17]。如張玉陽等[18]利用大豆癥青相關(guān)病毒的外殼蛋白制備多克隆抗體用于大豆癥青的快速檢測。林麗明等[19]利用水稻草狀矮化病毒A蛋白酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測并比較了水稻不同品種、不同部位和不同發(fā)病時(shí)期的RGSV含量。Gao等[20]利用DAS-ELISA和Dot-ELISA檢測植物中的番茄斑萎病毒。Sum等[21]利用間接ELISA和點(diǎn)印跡的方法檢測水稻東格魯?。≧TD），該方法具有高靈敏度和特異性，可用于田間現(xiàn)場檢測?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以SRBSDV基因?yàn)橹饕芯繉ο?，通過RT-PCR技術(shù)獲取基因片段；利用Gateway重組技術(shù)將基因整合到原核表達(dá)載體pDEST17上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲取該基因的原核表達(dá)蛋白。【擬解決的關(guān)鍵問題】獲取完整的基因序列，并實(shí)現(xiàn)該基因在原核生物中的表達(dá)，為SRBSDV的田間檢測與P7-2的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

感病水稻采自江西南昌。大腸桿菌DH5α、表達(dá)菌株入門載體pDONR221以及原核表達(dá)載體pDEST17均為本實(shí)驗(yàn)室保存；Gateway BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix購自Invitrogen；植物總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、2×PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；植物總蛋白提取試劑盒購自生物工程（上海）股份有限工公司。

1.2 方法

1.2.1 SRBSDV基因的克隆 根據(jù)已發(fā)表的SRBSDV的基因序列（登錄號：HM585273.1）設(shè)計(jì)引物，并加入Gateway重組序列，正向引物P7-2F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCTTCATGAATTACAACGATGCCAATG，反向引物P7-2R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG TCTTACAAATTCAGAATGTTTTTCAAC。提取南方水稻黑條矮縮病病葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；利用特異性引物P7-2F/P7-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、P7-2F/P7-2R各2 μL（10 μmol/L）、2×SuperMix 25 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。所得產(chǎn)物電泳后回收純化。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將回收純化的目的條帶與入門載體pDONR221在25 ℃條件下進(jìn)行BP重組反應(yīng)2 h，BP反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物1.2 μL，pDONR221載體0.4 μL，BP酶0.4 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中并將其涂布在LB固體培養(yǎng)基（含卡那霉素，Kan，50 μg/mL）上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基（含Kan）中震蕩培養(yǎng)4 h。取2 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件同1.2.1。將PCR鑒定為陽性的菌液進(jìn)行測序。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性菌液并提取質(zhì)粒。用限制性核酸內(nèi)切酶37 ℃下酶切陽性質(zhì)粒30 min后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化其中分子量較大的DNA片段。將回收純化的DNA與原核表達(dá)載體pDEST17在25 ℃下進(jìn)行LR重組反應(yīng)2 h，LR反應(yīng)體系為：酶切產(chǎn)物1.2 μL，pDEST17載體0.4 μL，LR酶0.4 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；利用PCR鑒定陽性克隆，方法同上。提取質(zhì)粒，即獲得基因的原核表達(dá)載體pDEST17-。

1.2.3 SRBSDV的原核表達(dá) 用熱激發(fā)將pDEST17-P7-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株中。復(fù)蘇后將其涂布在含氨芐青霉素（AMP，100 μg/mL）與氯霉素（Chl，35 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h。挑取若干單菌落震蕩培養(yǎng)4 h，利用菌液PCR鑒定陽性菌株，方法同1.2.1。將陽性菌株接種于LB液體培養(yǎng)基（含AMP和Chl），37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。以體積1﹕100的比例將陽性菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入IPTG（終濃度為0.1 mmol/L），溫度調(diào)至28 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對照為未誘導(dǎo)的陽性菌液及誘導(dǎo)的含pDEST17空載體的菌液。誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后離心收集菌體；加入100 μL無菌水重懸，隨后加入100 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，離心后取15 μL上清進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRBSDV P7-2基因的克隆

提取南方水稻黑條矮縮病病葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增到一條大小約為1 000 bp的條帶，與目的條帶大小一致（930 bp）（圖1）。

2.2 SRBSDV P7-2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

回收純化PCR產(chǎn)物，并通過BP連接酶將其構(gòu)建到pDONR221載體中。測序結(jié)果表明成功獲得pDONR221-重組子。利用進(jìn)行酶切，得到兩條DNA條帶，其中分子量較大的片段為目標(biāo)片段（圖2）。

M為DNA Marker；1為SRBSDV P7-2基因。

M為DNA Marker；1為pDNOR221-P7-2酶切鑒定。

回收純化目標(biāo)片段。利用LR連接酶將其構(gòu)建到pDEST17載體上。結(jié)果如圖3所示，菌液PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶，表明重組質(zhì)粒pDEST17-構(gòu)建成功。

2.3 P7-2蛋白的原核表達(dá)分析

將含pDEST17-的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株中。挑取陽性菌落于LB液體培養(yǎng)基（含AMP和Chl）中震蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖4所示，成功誘導(dǎo)表達(dá)一條大小為42 kDa左右的蛋白，與預(yù)期大小一致，表明成功表達(dá)SRBSDV P7-2蛋白。

M為DNA Marker；1-6為pDEST17-P7-2 PCR鑒定。

M為蛋白Marker；1為未加IPTG誘導(dǎo)的含pDEST17-P7-2的宿主菌；2-3為加IPTG誘導(dǎo)的含pDEST17-P7-2宿主菌；4-5為加IPTG誘導(dǎo)的含pDEST17空載體的宿主菌。

3 結(jié)論與討論

南方水稻黑條矮縮病是影響我國水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重病害之一[1]。水稻各個(gè)生育期都能感病，發(fā)病后，水稻植株矮縮、葉片深綠、葉尖卷曲，稻稈上會(huì)形成乳白色瘤狀突起，高位分蘗以及倒生須根等典型癥狀，發(fā)病嚴(yán)重的植物不能正常抽穗，產(chǎn)量損失30%～50%[7,22-23]。2001年在廣東陽江市首次發(fā)現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病[1,7]。2009年該病害在我國南方多地晚稻上爆發(fā)，受害面積達(dá)30多萬hm2[22]；2010年南方水稻黑條矮縮病擴(kuò)散至我國南部13個(gè)省區(qū)，包括江西、湖南、安徽等地，中晚稻受害總面積增至120多萬hm2[22]；近年南方水稻黑體矮縮病持續(xù)危害水稻生產(chǎn)，2020年被收錄于我國一類農(nóng)作物病蟲害名錄[23]。因此亟需南方水稻黑條矮縮病的科學(xué)防控措施。由于缺乏抗性水稻品種及高效的防治藥劑，該病害至今尚未得到有效控制。

SRBSDV的傳播介體是遷飛性害蟲白背飛虱[4]。SRBSDV的主要初侵染源是春季帶毒遷入的白背飛虱，再傳播到中、晚稻或者田間雜草上，由此造成嚴(yán)重為害[4,22]。由于白背飛虱高效傳毒特點(diǎn)以及廣泛的取食范圍，白背飛虱一旦帶毒就可能造成水稻大面積發(fā)病[4,13]。因此對田間水稻植株發(fā)病率和白背飛虱帶毒率的監(jiān)測可為防治SRBSDV提供有效的依據(jù)。可靠的病原檢測與鑒定是病毒病防治的基礎(chǔ)。因此本論文擬擴(kuò)增SRBSDV基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體并表達(dá)蛋白，為SRBSDV抗血清的制備及病毒檢測奠定基礎(chǔ)。

目前SRBSDV編碼的多個(gè)蛋白的功能已被驗(yàn)證。例如P5-1形成絲狀包涵體，可能在病毒粒子的形成中具有重要作用[24]；S6是病毒的一個(gè)沉默抑制子[25]；S7-1編碼小管蛋白，形成管狀結(jié)構(gòu)，參與病毒在細(xì)胞與細(xì)胞間的擴(kuò)散[26]；P9-1形成病毒基質(zhì)[27]。但是P7-2的功能未知，因此通過體外誘導(dǎo)表達(dá)P7-2蛋白，可為P7-2的功能研究做準(zhǔn)備。本研究利用原核表達(dá)載體pDEST17誘導(dǎo)表達(dá)了大量的帶HIS標(biāo)簽的P7-2的融合蛋白，但該蛋白為無活性的沉淀蛋白。還需通過調(diào)整誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG的濃度等獲得可溶性蛋白。

本論文通過RT-PCR的方法從感染南方水稻黑條矮縮病毒的水稻葉片中擴(kuò)增得到了SRBSDV基因。利用Gateway重組系統(tǒng)構(gòu)建原核表達(dá)載體，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)得到大量的SRBSDV P7-2蛋白。本研究為SRBSDV的田間檢測和防治提供靶標(biāo)，也為進(jìn)一步研究P7-2蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression ofof

HU Yuzhuan1, WANG Quanxing1, ZHANG Jinyi1, SONG Shuilin1, JIANG Junxi1,2, XIONG Guihong1,2*

（1. School of Agronomy Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Root and Tuber Crops Biology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

To establish a method for rapid detection of(SRBSDV) and study the function ofgene, it is necessary to prepare specific antiserum of.Thegene was amplified by RT-PCR from the rice leaves infected with SRBSDV. The purified PCR fragment ofgene was subcloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to obtain the recombinant prokaryotic expression vector pDEST17-by Gateway recombinant technology. Then the recombinant vector was transformed intocells, which was induced by IPTG to express the protein and optimize the induced expression conditions.Sequence of the 930 bp SRBSDVwas amplified by RT PCR. The sequencing results showed that the prokaryotic expression vector pDEST17-was obtained. The positive prokaryotic expression ofstrains was identified by PCR. A large number of 42 kDa HIS6-tag fusion protein was obtained with the induction of 0.1 mmol/L IPTG fromcells for 8 h when the temperature was 28 ℃.SRBSDVgene was obtained and its protein was induced successfully under the optimal conditions, which laid a foundation for the detection and prediction of SRBSDV in the field as well as for the function study of SRBSDV.

SRBSDV; RT-PCR;gene; prokaryotic expression

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.65

S432.1

A

2095-3704（2023）04-0432-06

2023-10-20

2023-11-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960533）、江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20192BAB214004）和江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ170293）

胡昱顓（1999—），男，碩士生，主要從事植物病理學(xué)研究，601018211@qq.com；*通信作者：熊桂紅，講師，博士，xiongguihong2009@163.com。

胡昱顓, 王全興, 張金藝, 等. 南方水稻黑條矮縮病毒基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 432-437.