胡麗榕，王亞明，王 倩，宋 惠，黃子豪，黃 林,2，鐘 敏,2，彭帥英,2*

TasA抑菌蛋白對煙草黑脛病的防治效果研究

胡麗榕1，王亞明1，王 倩1，宋 惠1，黃子豪1，黃 林1,2，鐘 敏1,2，彭帥英1,2*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045）

【目的】煙草黑脛病是煙草疫霉菌侵染形成的一種嚴(yán)重危害煙草根莖的土傳性疾病，給全球煙草種植業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。研究通過構(gòu)建TasA蛋白原核表達重組菌，研究TasA對煙草黑脛病的抑制效果；并通過改變TasA蛋白的異源表達水平，以期提高該蛋白對煙草黑脛病的抑制效果。【方法】通過PCR擴增技術(shù)獲得枯草芽孢桿菌抑菌蛋白基因，構(gòu)建大腸桿菌重組菌；并以煙草疫霉菌（）為指示菌，研究TasA蛋白對煙草黑脛病的抑制效果。此外，通過改變克隆載體的拷貝數(shù)，研究TasA蛋白的表達量對其抑菌作用的影響?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了三株大腸桿菌重組菌（pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株），且TasA蛋白在三株重組菌中都成功進行了異源表達，分子量為35 ku左右。pACYC-TasA菌株、pCDF-TasA菌株及pT7473-TasA菌株對煙草疫霉菌菌絲體均有抑制效果，抑制率分別為14.85%、25.55%及13.45%。【結(jié)論】抑菌蛋白TasA對煙草黑脛病具有顯著抑制效果，且過表達pCDF-TasA重組質(zhì)粒的工程菌對煙草黑脛病抑制效果最佳。

煙草黑脛病；煙草疫霉菌；TasA蛋白；PCR擴增；異源表達

【研究意義】煙草是世界上重要的經(jīng)濟作物，煙草黑脛病自1896年發(fā)現(xiàn)以來，其在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，已成為煙草種植業(yè)最具破壞性的土源性病害之一[1]。我國煙草種植區(qū)特別是山東、安徽與河南種植區(qū)煙草黑脛病害頻發(fā)，平均發(fā)病率為5%～12%，嚴(yán)重時高達75%，給我國煙草生產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2]。煙草黑脛病由煙草疫霉菌（）引發(fā)，該病原菌侵染能力強，且在整個煙草生長期都可發(fā)生侵染。有報道指出每年由煙草黑脛病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億元[3]，僅次于煙草病毒病，已成為制約煙草優(yōu)質(zhì)、高效、安全生產(chǎn)的重要因素[4]。煙草黑脛病的防治方法包括合理輪作、抗病品種培育、化學(xué)防治以及生物防治等。在諸多植物真菌病害防治方法中，生物防治具有高效且不污染環(huán)境、對作物安全、對人畜安全、對食品安全等優(yōu)點，符合人們對食品安全的要求，而且為生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供了技術(shù)支持。因此，關(guān)于植物病害的生物防治研究日益受到關(guān)注。【前人研究進展】芽孢桿菌是植物病害生物防治研究中的重要微生物，其種類多分布廣、易分離純化，是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢種群。大量研究發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括脂肽類、肽類、磷脂類、細(xì)菌素等物質(zhì)[5]。芽孢桿菌的生防機制包括競爭作用、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗性等方面，尤以產(chǎn)生抗生素、抑菌蛋白和揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的拮抗作用為主要的防病機理[6-8]。目前應(yīng)用于生物防治的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（）、蘇云金芽孢桿菌（）、解淀粉芽孢桿菌（）、臘樣芽孢桿菌（）、巨大芽孢桿菌（）及貝萊斯芽孢桿菌（）等[5,9]。TasA是一類芽孢結(jié)合蛋白，與芽孢外殼和芽孢形成相關(guān)，在芽孢形成的早期一直到細(xì)胞進入靜止期均有合成，并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中[10]。研究表明TasA蛋白具有廣譜抑菌活性，對多種植物病原菌有明顯的抑制效果，是芽孢桿菌的主要抑菌活性成分[11]。近年來，國內(nèi)關(guān)于芽孢桿菌基因克隆并在原核生物中表達的研究日益增多。楊麗榮等[12]以解淀粉芽孢桿菌YN-1菌株為研究對象，利用PCR方法從基因組DNA中擴增出編碼抑制基因的全長DNA，并構(gòu)建pGEX-4T2/TasA原核表達載體，在BL21（DE3）中表達獲得TasA-GST融合表達的抑菌蛋白，且該表達產(chǎn)物能夠抑制黃瓜灰霉病病原體的生長；劉通等[13]以短小芽孢桿菌DX01菌株為研究對象，采用PCR方法從DX01菌株基因組DNA中擴增出編碼基因的全長序列，并構(gòu)建原核表達載體pET28-TasA，在BL21（DE3）中表達獲得TasA的融合表達蛋白，該融合蛋白對玉米小斑病菌及病菌分生孢子萌發(fā)有顯著抑制作用，同時對水稻稻瘟病菌菌絲體生長有顯著抑制作用；尹向田等[14]以枯草芽孢桿菌ME0717菌株為研究對象，采用PCR方法從該菌基因組DNA中擴增出完整的基因，將其構(gòu)建到pEASY-E1載體上，并在BL21（DE3）中表達獲得抑菌蛋白，該蛋白對桑樹疫病菌具有抑制作用；來源于芽孢桿菌CQBS03和BH072的基因分別構(gòu)建到pEASY-E1和pET28a載體上，并在BL21（DE3）中表達，表達產(chǎn)物能夠抑制柑桔潰瘍病菌及灰霉病菌生長[15-16]；來源于解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌蛋白基因用pET22b表達載體，并在BL21（DE3）中表達，并在低溫下培養(yǎng)表達，其表達產(chǎn)物能抑制番茄灰霉病和葉霉病、玉米莖基腐病和水稻稻曲病菌生長[17]。【本研究切入點】枯草芽孢桿菌TasA蛋白是一種具有廣譜抑菌活性的生物大分子。近年來，關(guān)于TasA蛋白抑制植物病原真菌的報道逐年增加。然而，TasA蛋白對煙草疫霉菌的抑制作用尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建TasA蛋白原核表達重組菌，并以煙草疫霉菌為指示菌，探究TasA蛋白對煙草疫霉菌的抑制效果；此外，通過改變TasA蛋白在大腸桿菌宿主中的表達量，以期進一步提高TasA蛋白的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枯草芽孢桿菌、煙草疫霉菌、大腸桿菌均保藏于課題組實驗室，大腸桿菌DH5α用于DNA分子克隆，BL21（DE3）用于蛋白質(zhì)表達，分子操作相關(guān)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組DNA分子構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中枯草芽孢桿菌的基因序列設(shè)計PCR擴增引物，引物序列如下：TasA-F引物5′- GGAGCTTGGTATGAAAAAG-3′（I），TasA-R引物5′-CGGTTTTATTAATTTTTAT CCT-3′（I），下劃線分別為限制性核酸內(nèi)切酶I與I的識別序列；以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，擴增基因，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min后進行30個PCR循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min；對目的片段及克隆質(zhì)粒（pACYCDuet-1、pCDFDuet-1及pT7473）分別進行I與I的雙酶切反應(yīng)；回收酶切的目的片段及載體分子，利用T4 DNA連接酶進行酶連反應(yīng)，構(gòu)建三個重組DNA分子即pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA分子；將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆子并送至北京擎科生物有限公司進行測序；保存經(jīng)測序驗證正確的菌株，并抽提其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，保存菌株。

1.2.2 重組菌株的培養(yǎng) 將-80 ℃保存的菌株接種至3 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中（含有相應(yīng)抗性），于37 ℃下200 r/min培養(yǎng)過夜；隔天按1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中（含有相應(yīng)抗性），于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值至0.6～0.8；加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)；4 h后將菌液于8 000 r/min下離心20 min，棄上清液收集菌體。

1.2.3 細(xì)胞破碎 將菌體使用細(xì)胞破碎緩沖液A（50 mmol/L Tris?HCl緩沖液pH 8.0；100 mmol/L NaCl；10 mmol/L EDTA）重懸至菌濃度為20 mg/mL。破碎過程（所有操作都在冰浴條件下進行）如下：功率200 W，On 2 s，Off 4 s，Cycle 90次，取樣作為全菌樣本；隨后于10 000 r/min下4 ℃離心30 min，收集上清液，作為上清樣本；將沉淀使用破碎緩沖液B（50 mmol/L Tris?HCl緩沖液pH 8.0；100 mmol/L NaCl）洗滌2次，重懸混勻，取樣作為沉淀樣本。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析 蛋白質(zhì)樣品采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分析。蛋白質(zhì)樣品加入2×SDS蛋白樣品緩沖液，在100 ℃下變性5 min。在垂直平板凝膠裝置中采用4%（w/v）濃縮膠和10%（w/v）分離凝膠進行PAGE電泳。隨后，用0.05%（m/v）考馬斯亮藍R-250溶液對凝膠染色4 h；使用脫色液（V（乙酸）﹕V（甲醇）﹕V（水）=1﹕3﹕6）對凝膠進行脫色。

1.2.5 菌絲抑制率測定 制備PDA固體培養(yǎng)基平板，待培養(yǎng)基凝固后分別取200 μL重組菌株的全菌、上清液、沉淀樣品均勻涂布至PDA平板上；用無菌打孔器打取5 mm煙草黑脛病的菌餅接至PDA平板中央，用封口膜封口；放至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，以單獨接種煙草黑脛病菌餅的平板為對照（對照組培養(yǎng)72 h后菌絲長滿平板）；每個處理設(shè)置3個平行，病原菌菌絲抑制率計算公式如下：

菌絲抑制率=（對照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對照菌絲直徑×100% （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 三株TasA重組菌株的分子構(gòu)建

將枯草芽孢桿菌抑菌蛋白基因分別克隆至3種質(zhì)粒載體中，即pACYCDuet-1（4 008 bp）、pCDFDuet-1（3 781 bp）及pT7473（5 443 bp），構(gòu)建pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA重組質(zhì)粒，3個重組質(zhì)粒的分子圖譜見圖1。

圖1 3個重組DNA質(zhì)粒的分子圖譜

以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，以設(shè)計的TasA-F/TasA-R序列為引物進行PCR擴增，其擴增產(chǎn)物經(jīng)0.75%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，基因的分子量大小為750 bp左右，與預(yù)期的分子量大小（786 bp）一致（圖2a）。將PCR產(chǎn)物克隆至3種質(zhì)粒分子中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進行菌落PCR驗證（圖2b），挑選陽性克隆進行I/I雙酶切驗證。從圖2c可以看出，pACYC-TasA重組DNA分子經(jīng)雙酶切電泳后發(fā)現(xiàn)2個DNA條帶（4 000 bp與750 bp），其條帶分別與載體及基因的大小一致（圖2c，1泳道）；pCDF-TasA與pT7473-TasA重組DNA分子經(jīng)雙酶切后均發(fā)現(xiàn)載體分子與目的基因條帶（圖2c，2與3泳道），這些結(jié)果表明基因已成功克隆至3個載體分子中。隨后將經(jīng)測序驗證正確的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，分別構(gòu)建包含pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌，并命名為pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株。

a）TasA基因PCR產(chǎn)物電泳圖。b）菌落PCR鑒定結(jié)果，1,2：pACYC-TasA；3,4：pCDF-TasA；5,6：pT7473-TasA。 c）雙酶切鑒定結(jié)果，1：pACYC-TasA，2：pCDF-TasA，3：pT7473-TasA，M：DNA marker。

2.2 不同質(zhì)?？截悢?shù)對TasA基因表達量

將3株重組菌株于37 ℃培養(yǎng)并經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，檢測各重組菌株中TasA蛋白的異源表達情況。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在35 ku左右觀察到一條蛋白質(zhì)過表達條帶，其與TasA蛋白預(yù)期的分子量大小一致（圖3），說明TasA蛋白在3株重組菌中都成功進行了表達；此外，從3株重組菌的上清液（S泳道）與沉淀（P泳道）樣本的電泳結(jié)果可以看出，TasA在3株重組菌株中主要以可溶性形式表達，且pCDF-TasA菌株中TasA蛋白的可溶性表達水平較其它兩株重組菌株高。

2.3 不同質(zhì)?？截悢?shù)對TasA抑菌活性的影響

以煙草疫霉菌為病原指示菌，分別對3株重組菌株的全菌、上清液和沉淀樣品進行抑菌活性測定。結(jié)果表明，與空的BL21（DE3）宿主菌相比，3株重組菌的全菌和上清樣品均能在不同程度上抑制煙草疫霉菌菌絲體的生長（圖4）。pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株全菌樣品對煙草疫霉菌菌絲體的抑制率分別為14.85%、25.55%、13.45%，與空的BL21（DE3）宿主菌對照相比，菌絲抑制率分別為對照菌的2.59、4.45、2.34倍。pACYC-TasA、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株上清樣品對煙草疫霉菌菌絲體的抑制率分別為11.66%、22.81%、10.10%。上述結(jié)果表明，pCDF-TasA菌株的全菌及上清樣品對煙草疫霉菌的抑制效果最好，這一結(jié)果與TasA蛋白的表達量結(jié)果一致即TasA蛋白在pCDF-TasA菌株中的表達量最高。

3 討 論

煙草黑脛病是由煙草疫霉菌引發(fā)的土傳性病害，通常感染煙草植物的根和莖，每年給全球煙草種植業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前防治煙草黑脛病的諸多方法中，生物防治方法因其綠色、環(huán)保、可持續(xù)等優(yōu)勢，在植物病害防治上展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。當(dāng)前對煙草黑脛病的生物防治研究主要集中在拮抗微生物的分離篩選方面，且已有諸多拮抗微生物被成功分離篩選出來。例如賈孟媛等[18]從毒鵝膏菌棲息土壤中分離篩選到一株具有顯著煙草疫霉菌抑制效果的拮抗細(xì)菌亞麻假單胞菌DE4-5；Ding等[19]從貴州煙草黑脛病高發(fā)區(qū)土壤中篩選到一株對煙草黑脛病有顯著抑制效果的拮抗菌——貝萊斯芽孢桿菌GUMT319?？莶菅挎邨U菌抑菌蛋白TasA被認(rèn)為是一種具有廣譜抑菌活性的抑菌蛋白，其對諸多植物病原菌都表現(xiàn)出顯著的抑菌活性[12-17]。關(guān)于TasA對煙草黑脛病的抑制活性尚未見報道。在本研究中，枯草芽孢桿菌TasA蛋白基因在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了異源表達。此外，TasA蛋白能有效抑制煙草疫霉菌菌絲體生長，體現(xiàn)出良好的煙草黑脛病防治效果。表達載體是影響基因異源表達的一個重要因素，基因表達量和表達產(chǎn)物活性與表達載體的拷貝數(shù)、類型密切相關(guān)[20-21]。本研究通過將TasA抑菌蛋白基因克隆至3種不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（3種載體拷貝數(shù)關(guān)系：pACYCDuet-1＜pCDFDuet-1＜pT7473）中，考察了TasA蛋白表達量對其抑菌活性的影響，提高TasA蛋白的表達量能進一步提高其對煙草疫霉菌的抑制效果。本研究中的TasA抑菌蛋白來源于枯草芽孢桿菌，對其氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含信號肽序列，表明TasA蛋白是一種分泌表達型蛋白。在后續(xù)研究中，課題組計劃以枯草芽孢桿菌為異源表達宿主，實現(xiàn)TasA蛋白基因的高效分泌表達，以進一步提高TasA抑菌活性。綜上，本研究拓寬了枯草芽孢桿菌抑菌蛋白TasA的抑菌譜，同時也可為TasA蛋白防治煙草黑脛病提供理論參考。

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Biocontrol Effects of Antifungal Protein TasA on Tobacco Black Shank

HU Lirong1, WANG Yaming1, WANG Qian1, SONG Hui1, HUANG Zihao1, HUANG Lin1,2, ZHONG Min1,2, PENG Shuaiying1,2*

（1. School of Biological Sciences and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Institute of Applied Microbiology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

Tobacco black shank is a soil-borne disease caused by fugal pathogens of, typically infecting the roots and stems of tobacco plants and causing serious economic losses to the global tobacco industries. Therefore, recombinant strains overexpressing TasA were constructed to reveal the inhibitory effect of TasA on tobacco black shank. Moreover, the heterologous expression level of TasA was altered to improve its inhibitory effects.The TasA gene ofwas PCR amplified and overexpressed inBL21(DE3) strain. The inhibitory effect of TasA protein on tobacco black shank was studied by usingas a pathogen indicator. In addition, the inhibitory effect of TasA under different expression levels was also studied by cloning TasA gene into three vectors with different copy numbers.Three recombinantstrains (pACYC-TasA, pCDF-TasA, and pT7473-TasA strain) were successfully constructed. SDS-PAGE results revealed that TasA protein was overexpressed in all recombinant strains and its molecular weight was around 35 ku. The mycelial inhibition rate ofin pACYC-TasA, pCDF-TasA, and pT7473-TasA strain was 14.85%, 25.55%, and 13.45%, respectively.TasA protein shows a significant inhibitory effect on tobacco black shank, and recombinant strains overexpressing recombinant plasmid of pCDF-TasA exhibit the best inhibitory effect on tobacco black shank.

tobacco black shank;; TasA protein; PCR amplification; heterologous expression

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.64

S435.72

A

2095-3704（2023）04-0425-07

2023-09-21

2023-10-11

江西省教育廳科技計劃項目（GJJ180238）

胡麗蓉（2002—），女，主要從事微生物資源開發(fā)與利用研究，1511631708@qq.com；*通信作者：彭帥英，講師，博士，sypeng@jxau.edu.cn。

胡麗榕, 王亞明, 王倩, 等. TasA抑菌蛋白對煙草黑脛病的防治效果研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 425-431.