舒 攀，左 瑤，李建勇，蔡海林*，劉 敏*

馬唐生防真菌MA4的分離鑒定及其生物學(xué)特性

舒 攀1，左 瑤1，李建勇2，蔡海林2*，劉 敏1*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省煙草公司長沙市公司，湖南 長沙 410011）

【目的】篩選防治馬唐（）的生防真菌，挖掘其應(yīng)用于雜草生物防治的潛力。【方法】采用組織分離法，從自然發(fā)病的馬唐植株中分離出對(duì)馬唐具有較強(qiáng)致病力的生防菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、、、基因序列同源性比對(duì)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析確定其分類地位；利用單因素試驗(yàn)研究其生物學(xué)特性及整株生物測(cè)定法測(cè)定馬唐生防真菌對(duì)幾種常見雜草的侵染效果及對(duì)常見作物的安全性?！窘Y(jié)果】分離得到的馬唐生防真菌MA4被鑒定為藤倉鐮刀菌（）；最適合MA4生長的培養(yǎng)基為PDA和PSA；最適合MA4生長和產(chǎn)孢的培養(yǎng)條件為：溫度28～30 ℃，pH值6.0～8.0，黑暗培養(yǎng)；MA4對(duì)馬唐鮮重防效較好，達(dá)到91.4%，對(duì)看麥娘、狗尾草和鉆形紫菀的鮮重抑制率分別為63.8%、80.6%、69.4%；MA4對(duì)雙子葉作物相對(duì)安全。【結(jié)論】藤倉鐮刀菌MA4菌株對(duì)馬唐等禾本科雜草防治效果較好，對(duì)雙子葉作物較安全，具有開發(fā)成生物除草劑的巨大潛力。

馬唐；藤倉鐮刀菌；生物防治；生物學(xué)特性

【研究意義】馬唐（）是一種主要為害玉米、豆類、棉花、花生等秋熟旱地作物的惡性雜草，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量?；瘜W(xué)防治是目前防治馬唐的主要手段[1]，而隨著化學(xué)除草劑的長期使用，也帶來了諸如環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、雜草抗藥性上升等負(fù)面影響。相對(duì)于化學(xué)除草劑，微生物除草劑具有環(huán)境友好、對(duì)作物安全性高、雜草不容易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)[2]，因此研究和開發(fā)微生物除草劑具有廣闊的前景?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物致病微生物理論上來講都有開發(fā)成為生物除草劑的潛力，但在實(shí)際研究與應(yīng)用中，真菌被研究更多。目前已經(jīng)有報(bào)道多種真菌具有被開發(fā)成為生物除草劑的潛力，如鐮刀菌屬（）、尾孢霉屬（）、莖點(diǎn)霉屬（）、交鏈孢菌屬（）等[3]。羅文芳等[4]從自然發(fā)病番茄列當(dāng)上分離得到了一株列當(dāng)生防真菌交鏈格孢（）JTF001；吳兆圓等[5]報(bào)道了一株防除馬唐的鏈格孢菌（）；張亞鑫等[6]分離得到了對(duì)稗屬雜草具有強(qiáng)致病力的新月彎孢（）、尖角突臍蠕孢（）等10株生防菌株；鐘加日等[7]分離得到了一株稗草生防菌新月彎孢菌（）NX2A；李健等[8-9]報(bào)道了用于防除稗草的露濕漆斑菌（）和防除馬唐的厚垣孢鐮刀菌（）；俞雯雯等[10]報(bào)道了一株具有雜草生防潛力的嘴突凸臍蠕孢菌（）；陸俞萍等[11]發(fā)現(xiàn)木賊鐮刀菌（）、再育鐮刀菌（）、狗尾草平臍蠕孢（）、間型彎孢（）和新月彎孢（）5種病原菌具有開發(fā)成防除茶園雜草生物除草劑的較好潛力；王偉等[12]從土壤中分離得到一株球孢白僵菌（），其對(duì)野燕麥具有較好生物活性。也有研究人員報(bào)道細(xì)菌可以用于雜草生物防治。Yang等[13]從海水中得到一株黏質(zhì)沙雷氏菌（），發(fā)現(xiàn)其對(duì)馬唐有較好的活性；李鑫等[14]進(jìn)一步測(cè)定了黏質(zhì)沙雷氏菌菌株對(duì)玉米田雜草的活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)玉米田雜草反枝莧、馬唐、苘麻、牽牛、稗草、虎尾草均有一定的防除作用，對(duì)反枝莧和馬唐效果最佳。【本研究切入點(diǎn)】馬唐對(duì)常用化學(xué)除草劑抗藥性水平急劇上升，因此開發(fā)環(huán)境友好的非化學(xué)除草劑方法，可為馬唐的科學(xué)防控提供新的選擇與參考?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)擬以田間自然發(fā)病的馬唐植株為研究對(duì)象，采用組織分離法分離得到一株馬唐生防真菌MA4，通過形態(tài)學(xué)觀察、基因、微管蛋白基因和翻譯延伸基因分析確定其分類地位，并研究其生物學(xué)特性，可為微生物除草劑的挖掘與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：馬唐病葉采集自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園教學(xué)科研基地；馬唐、牛筋草等雜草種子均為本實(shí)驗(yàn)室采集并保存；水稻、玉米等作物種子均購自隆平高科種業(yè)有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基：燕麥片30 g，蒸餾水定容至1 000 mL；馬唐汁液培養(yǎng)基（CAJ）：馬唐汁液200 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 馬唐生防真菌的分離與鑒定

1.2.1 馬唐生防菌的分離與純化 用無菌水將自然發(fā)病的馬唐葉片漂洗干凈，沿病健交界處剪成小塊，將組織小塊置于5%次氯酸鈉溶液和70%乙醇溶液中分別進(jìn)行表面消毒60 s和30 s，表面消毒后的馬唐葉片組織用無菌蒸餾水漂洗3～4次以徹底清除組織表面殘留的消毒劑，隨后將馬唐葉片組織塊置于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干。將吹干后的馬唐葉片組織置于滅菌的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待長出真菌菌落后用滅菌的接種針挑取菌絲至新的PDA平板內(nèi)，產(chǎn)孢后挑取單孢子進(jìn)行純化得到純培養(yǎng)菌株，命名為MA4。將MA4回接至表面消毒的健康馬唐葉片，觀察發(fā)病狀況，并從馬唐葉片病健交界處再次分離病原菌，以驗(yàn)證柯赫氏法則。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株MA4在PDA平板上培養(yǎng)7 d，期間觀察并記錄其菌落形態(tài)。同時(shí)用無菌水將培養(yǎng)基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，顯微鏡下觀察菌株 MA4的分生孢子形態(tài)；對(duì)照魏景超[15]編著的《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株MA4進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取MA4菌株基因組DNA，采用通用引物ITS4/ITS5，Bt2a/Bt2b和EF728F/EF986R分別對(duì)MA4菌株基因、微管蛋白基因（）及翻譯延伸因子基因（）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后將其送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得序列登陸NCBI（national center for biotechnology information），通過GenBank中BLAST功能基因序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取合適序列，利用MEGA 7.0軟件分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果，確定MA4菌株的分類地位。

1.3 馬唐生防菌的生物學(xué)特性

1.3.1 培養(yǎng)基對(duì)MA4生長的影響 用PDA培養(yǎng)基活化保存的菌株5 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到各種供試培養(yǎng)基上，9 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并用無菌水洗脫分生孢子，稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.2 溫度對(duì)MA4生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌后將溫度條件設(shè)置為15，20，25，30，35 ℃，測(cè)定溫度條件對(duì)菌株生長的影響，接菌9 d后，測(cè)定菌落直徑及分生孢子數(shù)量。

1.3.3 pH值對(duì)MA4生長的影響 將PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)制成不同pH值，設(shè)置的pH值為4，5，6，7，8，9，10，參照1.3.1的方法，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)9 d后，測(cè)定菌落直徑和分生孢子數(shù)量。

1.3.4 光照對(duì)MA4生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌后光照條件設(shè)置為0 h/24 h，8 h/16 h，12 h/12 h，16 h/8 h，24 h/0 h共5個(gè)處理，測(cè)定光照條件對(duì)菌株生長的影響，接菌9 d后，測(cè)定菌落直徑及分生孢子數(shù)量。

1.3.5 對(duì)常見雜草的抑制效果 將MA4接種于PDA平板培養(yǎng)基，25 ℃、黑暗培養(yǎng)9 d后，收集孢子并配制成濃度為2.0×108個(gè)／mL的孢子懸浮液（含0.03%的吐溫80）。將孢子懸浮液噴施3～4葉期稗草、馬唐和狗尾草等雜草植株上，28 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后，持續(xù)光照培養(yǎng)，觀察菌株的致病特性。以噴施0.03%吐溫80的植株為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。14 d后測(cè)定雜草發(fā)病率，并計(jì)算MA4對(duì)不同雜草的鮮重抑制率。

發(fā)病率=（生防菌侵染雜草數(shù)/供試雜草總數(shù)）/供試雜草總數(shù)×100%（1）

鮮重抑制率=（對(duì)照組雜草鮮重-處理組雜草鮮重）/對(duì)照組雜草鮮重×100%（2）

1.3.6 對(duì)常見作物的安全性測(cè)定 將MA4菌株接種至新鮮PDA平板培養(yǎng)9 d，用無菌水清洗并收集分生孢子，將濃度為2.0×108個(gè)/mL的MA4分生孢子懸浮液分別噴施于3～4葉期的水稻、玉米、大豆等作物植株上。接種14 d后記錄不同作物發(fā)病程度，并測(cè)定MA4分生孢子懸浮液對(duì)不同作物的鮮重抑制率。參考李永龍等[16]的方法，按以下標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)病程度：NS表示無癥狀（一直無病斑，植株正常生長）；LS表示有輕微反應(yīng)（初期葉片分布零星斑點(diǎn)，14 d后鮮重不受抑制）；MS表示中等感病（葉面出現(xiàn)較多病斑，14 d后鮮重受到抑制）；SS表示嚴(yán)重感?。ㄈ~片病斑連成一體，14 d后鮮重受到嚴(yán)重抑制）。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬唐生防真菌的分離與鑒定

馬唐生防菌MA4菌株在PDA平板上形成白色絮狀菌落，菌絲緊密，菌落邊緣規(guī)則。在培養(yǎng)初期形成橢圓形小型分生孢子，培養(yǎng)后期形成鐮刀型大型分生孢子（圖1）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將MA4菌株初步鑒定為鐮刀菌。

圖1 MA4菌落及分生孢子形態(tài)

將擴(kuò)增得到的MA4菌株、、基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫（序列號(hào)分別為MN088607，MN096557，MN096556），BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，MA4菌株、、基因序列與來自藤倉鐮刀菌的基因序列MK192049、基因序列LT575105及基因序列KM514487的同源性分別為100%、100%、99%?；?、、基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2，圖3，圖4）均顯示，MA4菌株與藤倉鐮刀菌處于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)結(jié)果，將馬唐生防菌MA4最終鑒定為藤倉鐮刀菌（）。

圖2 基于ITS基因構(gòu)建的MA4系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于微管蛋白基因（β-Tubulin）構(gòu)建的MA4系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于翻譯延伸因子基因（EF-1α）構(gòu)建的MA4系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)基對(duì)MA4菌株生長的影響

菌株MA4在不同培養(yǎng)基上的生長情況如表1所示。由表1可知，MA4菌株在PDA培養(yǎng)基上長勢(shì)較好，生長速度較快，培養(yǎng)9 d后菌落直徑達(dá)到7.6 cm，在PSA培養(yǎng)基上的長勢(shì)和生長速度次之，但與PDA培養(yǎng)基相比差異不顯著；MA4產(chǎn)孢量方面，也以PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢效果最佳。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)MA4菌株生長的影響

2.3 溫度對(duì)MA4菌株生長的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株MA4生長的影響如表2所示。在PDA培養(yǎng)基上，MA4菌株在25，28，30 ℃條件下的菌落生長速度和產(chǎn)孢量均沒有顯著差異；當(dāng)溫度低于25 ℃或高于30 ℃時(shí)，菌落生長速度和產(chǎn)孢量均顯著下降。

表2 溫度對(duì)MA4菌株生長的影響

2.4 培養(yǎng)基pH對(duì)MA4菌株生長的影響

培養(yǎng)基pH對(duì)菌株MA4生長的影響如表3所示。在PDA培養(yǎng)基上，MA4菌株在培養(yǎng)基pH=7條件下的菌落生長速度和產(chǎn)孢量最高，但和pH=6及pH=8處理間沒有顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)基pH超過6～8區(qū)間時(shí)，菌落生長速度和產(chǎn)孢量均受到顯著抑制，說明最適合MA4菌株生長和產(chǎn)孢的pH為6～8。

表3 培養(yǎng)基pH對(duì)MA4菌株生長的影響

2.5 光照時(shí)間對(duì)MA4菌株生長的影響

光照時(shí)間對(duì)菌株MA4生長的影響如表4所示。在PDA培養(yǎng)基上，光照時(shí)間長短對(duì)MA4菌株菌落生長速度沒有顯著影響，但對(duì)MA4產(chǎn)孢量影響較大，MA4菌株在黑暗條件下產(chǎn)孢效果最好，隨著光照時(shí)間的延長，MA4產(chǎn)孢受到明顯抑制。

表4 光照時(shí)間對(duì)MA4菌株生長的影響

2.6 致病廣譜性測(cè)定

致病廣譜性試驗(yàn)結(jié)果表明：禾本科雜草中，MA4分生孢子液對(duì)馬唐的生防效果最佳，對(duì)馬唐的鮮重防效達(dá)到91.4%；對(duì)狗尾草防效次之，為80.6%；闊葉雜草中，MA4分生孢子液對(duì)鉆形紫菀鮮重防效69.4%，對(duì)小飛蓬、鐵莧菜、酢漿草生長幾乎沒有影響。

表5 菌株MA4孢子液對(duì)不同雜草的抑制效果

2.7 作物安全性測(cè)定

作物安全性測(cè)定結(jié)果表明，MA4分生孢子液對(duì)水稻和玉米的鮮重抑制率分別為39.7%和28.6%，表現(xiàn)為中等感病；對(duì)辣椒、番茄等雙子葉作物幾乎無影響。

表6 菌株MA4孢子液對(duì)不同作物的安全性

3 討 論

利用雜草致病微生物開發(fā)專一性強(qiáng)、對(duì)非靶標(biāo)植物安全、環(huán)境兼容性好、安全性高的微生物除草劑，或利用雜草致病微生物的活性代謝產(chǎn)物開發(fā)微生物源除草劑，是當(dāng)前雜草綠色防控技術(shù)體系的重要發(fā)展方向，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求。鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，可侵染多種植物，引起莖腐、根腐、葉斑在內(nèi)的多種病害[17]。由于鐮刀菌對(duì)營養(yǎng)要求不高，易于培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)過長中易于形成大量分生孢子，因而被廣泛地應(yīng)用于雜草的生物防治[18]。

鐮刀菌的鑒定非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的單一序列同源性分析鑒定該屬真菌存在一定難度，一些相較于基因變異速率更快的保守基因片段（如、基因等）有助于精確鑒定鐮刀菌[19]。李祥等[20]從患病甘草根部分離得到雜草致病菌株GD-0221，通過形態(tài)學(xué)特征及序列分析將其鑒定為尖孢鐮刀菌（）。王亞嬌等[21]從感病彎管列當(dāng)分離得到一株生防真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及翻譯延長因子基因序列同源性分析，將其鑒定為尖孢鐮刀菌（），該菌同時(shí)兼具良好的促生作用。Daniel等[22]從感病雜草分離得到具有除草活性的鐮刀菌株，通過基因及翻譯延長因子基因序列同源性分析將其鑒定為藤倉鐮刀菌（）。本研究中綜合利用、、等3個(gè)基因片段的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析，將馬唐生防菌MA4最終鑒定為藤倉鐮刀菌（），結(jié)果可靠性較高。

雜草生防菌雖然具備了被開發(fā)為雜草生防制劑的潛力，但其能否被開發(fā)為微生物除草劑登記產(chǎn)品還受諸多因素限制，如營養(yǎng)條件、環(huán)境因素等。王亞嬌等[23]通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，列當(dāng)生防菌層出鐮刀菌Br-1在最優(yōu)培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢量得到大幅提升，顯著提高了生防效果。楊瑩等[24]通過中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化了出芽短梗霉菌（）PA-2菌株的發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)和發(fā)酵條件可有效提高PA-2菌株的產(chǎn)孢量，降低發(fā)酵成本。本研究結(jié)果顯示，優(yōu)化的培養(yǎng)條件可以顯著提升馬唐生防真菌MA4的產(chǎn)孢量。

生防菌株致病力和安全性是制約生物除草劑開發(fā)最關(guān)鍵的兩大因素。本研究分離得到的馬唐生防菌菌株藤倉鐮刀菌MA4對(duì)包括馬唐在內(nèi)的幾種農(nóng)田禾本科雜草有廣譜的除草效果，對(duì)禾本科作物有明顯的侵染現(xiàn)象，而對(duì)闊葉作物表現(xiàn)相對(duì)安全，因此MA4菌株有被開發(fā)成闊葉作物田防除禾本科雜草生物除草劑的潛力。

在后續(xù)的生防試驗(yàn)中可通過生物除草劑制劑的制備以提高其生防效果穩(wěn)定性，將其與低劑量禾本科雜草除草劑進(jìn)行菌藥混合施用擴(kuò)大其殺草譜，進(jìn)一步挖掘其生防潛力，在保障環(huán)境友好的基礎(chǔ)上兼顧更高的防效。

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Isolation, Identification and Biological Characteristics of the Biocontrol Fungi MA4 for

SHU Pan1, ZUO Yao1, LI Jianyong2, CAI Hailin2*, LIU Min1*

（1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Changsha Branch of Hunan Provincial Tobacco Company, Changsha 410011, China）

To screen biocontrol fungi ofand explore the potential of its application in weed biological control.The biocontrol strains with strong pathogenicity towere isolated from naturally diseased plants by tissue isolation method, and their taxonomic status was determined by morphological observation, sequence homology comparison and phylogenetic analysis of,andgene. Biological characteristics of the biocontrol fungi was determined by single factor test. Infection effect on several common weeds and safety to common crops were also determined by whole plant bioassay.The isolatedbiocontrol fungi named MA4 was identified as. The most suitable media for MA4 growth were PDA and PSA.The most suitable culture conditions for MA4 growth and spore production were temperature of 28-30 °C, pH of 6.0-8.0 and dark culture.MA4 had good control effect on, the fresh weight control effect was 91.4%, and the fresh weight inhibition rates of,andwere 63.8%, 80.6% and 69.4%, respectively.MA4 is relatively safe to dicotyledonous crops.MA4 strain has good control effect on grasses such asand is safe to dicot crops, and it has great potential to be developed into a biological herbicide.

;; biological control; biological characteristics

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.63

S476.1

A

2095-3704（2023）04-0418-07

2023-10-07

2023-10-22

舒攀（1998—），男，碩士生，主要從事雜草生物防治技術(shù)研究，1378314479@qq.com；*通信作者：劉敏，講師，博士，liumin8637@hunan.edu.cn；蔡海林，高級(jí)農(nóng)藝師，博士，hailincai@126.com。

舒攀, 左瑤, 李建勇, 等. 馬唐生防真菌MA4的分離鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 418-424.