吳德光 鄧學(xué)聰 胡智慧 周英彪

(1. 茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系,貴州 遵義 564500;2. 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東 茂名 525000)

桑葚是藥食同源植物,含水量極高,采摘后難以長期貯藏和運(yùn)輸[1]。其藥用價(jià)值尚未得到有效開發(fā),常見的桑葚干、桑葚果醬、桑葚醋、桑葚酒和桑葚茶等都是中低端加工產(chǎn)品[2-3]。如何拓寬桑葚的深加工技術(shù),開發(fā)出適合不同人群的桑葚功能食品,提升桑葚果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值將成為桑葚高附加值產(chǎn)業(yè)的全新發(fā)展方向。桑葚的深加工技術(shù)仍主要依賴于微生物發(fā)酵,除了生產(chǎn)飲料酒和醋等產(chǎn)品外,桑葚還能生產(chǎn)具有特定生物活性成分的酵素[4-5]。通常酵素產(chǎn)品富含酚類等抗氧化活性物質(zhì)和維生素等生物活性物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓、預(yù)防慢性病與調(diào)節(jié)腸胃等功能,從而對(duì)機(jī)體的健康有一定的幫助[6-7],其中占有率較高的果蔬酵素是以果蔬類植物營養(yǎng)物質(zhì)為原料,經(jīng)過植物乳桿菌等乳酸菌發(fā)酵而成,可將果蔬中原本人體不能吸收的營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為人體能吸收的代謝產(chǎn)物,從而使果蔬產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值大大提高[8]。同時(shí)還有研究[9]表明,乳酸菌釋放的酶類可促進(jìn)如花青素等酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,生成綠原酸及咖啡酸等,此類酚類物質(zhì)能夠清除自由基及阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而達(dá)到抗氧化的效果,并且該類物質(zhì)也可通過微生物代謝合成。目前未見有以桑葚為原料,植物乳桿菌為發(fā)酵菌種,以總酚為指標(biāo)進(jìn)行桑葚酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化的報(bào)道。

研究擬以植物乳桿菌為生產(chǎn)菌種,以新鮮桑葚汁為原料,以總酚為指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葚酵素的發(fā)酵工藝,并對(duì)桑葚酵素的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為進(jìn)一步拓寬農(nóng)產(chǎn)品加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚:茂名市化州名葚園;

植物乳桿菌:LactobacillusplantarumCICC21790,廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院代謝控制發(fā)酵研究室保藏;

蛋白胨、酵母粉:生化級(jí),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;

氯化鈉:分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;

無水碳酸鈉、95%無水乙醇:分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;

福林酚:分析純,福州飛靜生物技術(shù)公司;

75%醫(yī)用酒精:沈陽惠民洗消劑制造公司;

沒食子酸:色譜純,北京索萊寶科技有限公司;

氫氧化鈉:分析純,西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器:LS-50HD型,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;

榨汁機(jī):WJS1222F型,美的集團(tuán)股份有限公司;

電子天平:10002型,杭州友恒稱重設(shè)備有限公司;

雙人單面垂直超凈工作臺(tái):SW-CJ-2FD型,蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;

臥式恒溫?fù)u床:DHZ-DA型,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-2型,常州天瑞儀器有限公司;

電熱鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9140A型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

高速冷凍微量離心機(jī):CF1524R型,上海通善生物科技有限公司;

微機(jī)型離心機(jī):PHS-3C型,杭州齊薇儀器有限公司;

紫外可見分光光度計(jì):UV-5100B型,上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素發(fā)酵工藝 桑葚酵素發(fā)酵工藝主要包括新鮮桑葚榨汁制備、菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、巴氏滅菌與過濾分裝等工序。

(1) 新鮮桑葚汁的制備:從化州名葚園采摘的新鮮桑葚,用純凈水洗干凈后,使用經(jīng)75%醫(yī)用酒精噴灑消毒的榨汁機(jī)將其榨汁,獲得桑葚原液,無菌紗布對(duì)折4層過濾去除桑葚碎渣,置于2 L的玻璃罐中,貯藏在-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?使用前提前置于4 ℃冰箱解凍24 h。

(2) 菌種培養(yǎng):從4 ℃冰箱保存的種子液中,按試驗(yàn)所需的10%接種量接到經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)基中,180 r/min,37 ℃進(jìn)行菌種活化10 h,將活化好的菌種再次按10%接種量接到另一個(gè)新鮮LB培養(yǎng)基,同樣條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng),到菌種的對(duì)數(shù)生長期中后期(大約16 h時(shí))停止培養(yǎng)。

(3) 接種發(fā)酵:按試驗(yàn)所需接種量量取菌液,8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,棄上清液取菌體,無菌生理鹽水洗滌菌體2次得干凈的菌體,將經(jīng)過80 ℃巴氏滅菌的桑葚汁分裝每瓶10 mL,按試驗(yàn)所需接入菌種培養(yǎng)發(fā)酵。

(4) 發(fā)酵液滅菌與過濾分裝:將發(fā)酵液靜置2 h后,吸取上清液在冷凍離心機(jī)8 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液于80 ℃的水浴鍋中巴氏滅菌10 min,靜置冷卻到室溫,0.45 μm的濾膜過濾后分裝,得桑葚乳酸菌酵素飲料。

1.3.2 單因素優(yōu)化桑葚酵素發(fā)酵工藝試驗(yàn)

(1) 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚汁發(fā)酵程度的影響:發(fā)酵溫度共設(shè)計(jì)6個(gè)水平(28,30,32,34,36,38 ℃),新鮮桑葚汁為10 mL,接種量為10 mL/100 mL,發(fā)酵時(shí)間為24 h,180 r/min搖床進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)后,取樣測定不同溫度下發(fā)酵液中的總酚含量。

(2) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚汁發(fā)酵程度的影響:發(fā)酵時(shí)間共設(shè)計(jì)6個(gè)水平(12,24,36,48,60,72 h),新鮮桑葚汁為10 mL,接種量為10 mL/100 mL,發(fā)酵溫度為30 ℃,180 r/min搖床進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)后,取樣測定不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵液中的總酚含量。

(3) 接種量對(duì)桑葚汁發(fā)酵程度的影響:接種量共設(shè)計(jì)6個(gè)水平(5,10,15,20,25,30 mL/100 mL),新鮮桑葚汁為10 mL,發(fā)酵時(shí)間為24 h,發(fā)酵溫度為30 ℃,180 r/min搖床進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)后,取樣測定不同接種量下發(fā)酵液中的總酚含量。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚酵素發(fā)酵工藝試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果選取總酚含量最高的3個(gè)水平,根據(jù)Design-Expert 13軟件的Box-betoken中心組合設(shè)計(jì)條件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳的桑葚汁酵素發(fā)酵工藝條件。

1.3.4 發(fā)酵液總酚含量測定

(1) 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:整個(gè)試驗(yàn)避光進(jìn)行,在7根干凈的10 mL的具塞比色管中分別加入配制好的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液為0.00,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50 mL,再加入福林酚試劑1 mL和配制好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液2 mL,超純水定容至具塞比色管刻度線并充分振蕩搖勻,重復(fù)3個(gè)平行組,室溫下黑暗處避光反應(yīng)30 min后通過紫外分光光度計(jì)測定吸光值[10]。

(2) 發(fā)酵液總酚含量測定:整個(gè)試驗(yàn)避光進(jìn)行,經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)確定合適的稀釋倍數(shù)后用超純水稀釋樣品,在干凈的10 mL的具塞比色管中加入0.25 mL稀釋的樣品,再加入福林酚試劑1 mL和配制好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液2 mL,超純水定容至具塞比色管刻度線并充分振蕩搖勻,重復(fù)3個(gè)平行組,室溫下黑暗處避光反應(yīng)30 min后通過紫外分光光度計(jì)測定吸光值,依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中的總酚含量[10]。

1.3.5 桑葚酵素質(zhì)量評(píng)價(jià)

(1) 感官評(píng)定:將制備的桑葚酵素分裝10瓶于滅菌錐形瓶中,每瓶20 mL,作為感官評(píng)定樣品。參與感官評(píng)定的人員由10名心情平靜且味覺正常的生物工程專業(yè)學(xué)生組成,從色澤、香味、滋味、體態(tài)4個(gè)項(xiàng)目對(duì)桑葚酵素進(jìn)行評(píng)定。

(2) 可溶性固形物測定:按GB/T 12143—2008執(zhí)行。

(3) pH值:使用PHS-3C型酸度計(jì)測定。

(4) 微生物指標(biāo):按GB 4789.3—2016、GB 4789.15—2016執(zhí)行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行繪制,單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行處理與分析,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert 13軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按福林酚法要求的條件測量吸光值并制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。經(jīng)過計(jì)算得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=9.510 4x-0.378 7,R2=0.998,表明線性擬合好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚酵素總酚的影響 如圖2所示,發(fā)酵12 h時(shí)桑葚酵素的總酚含量較低,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加總酚含量逐漸上升,發(fā)酵36 h時(shí)桑葚酵素的總酚含量達(dá)到最大值(42.43 μg/mL),當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過36 h后總酚含量逐漸下降。因此,選取24,36,48 h 3個(gè)時(shí)間作為響應(yīng)面試驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間的3個(gè)水平。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酵素總酚的影響 如圖3所示,發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)桑葚酵素的總酚含量較低,隨著發(fā)酵溫度的上升總酚含量逐漸增加,發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)桑葚酵素的總酚含量達(dá)到最大值(40.25 μg/mL),當(dāng)發(fā)酵溫度超過30 ℃后總酚含量逐漸下降。因此,選取30,32,34 ℃ 3個(gè)溫度作為響應(yīng)面試驗(yàn)發(fā)酵溫度的3個(gè)水平。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響

2.2.3 接種量對(duì)桑葚酵素總酚的影響 如圖4所示,接種量為5 mL/100 mL時(shí)桑葚酵素的總酚含量較低,隨著總接種量的增加,總酚含量呈增加趨勢,接種量為30 mL/100 mL時(shí)桑葚酵素的總酚含量達(dá)到最大值(39.68 μg/mL),表明植物乳桿菌的代謝有助于總酚的積累。

圖4 接種量對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表

表2 桑葚酵素響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 總酚含量回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)?

以桑葚酵素總酚含量為指標(biāo),得到總酚含量(Y)對(duì)發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、總接種量(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=-803.151 000+5.573 790A+47.176 120B-0.646 175C-0.094 062AB+0.009 313AC+0.044 000BC-0.036 132A2-0.707 625B2-0.022 555C2。

(1)

圖5～圖7表明,發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響最大,發(fā)酵時(shí)間與接種量的交互作用對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響次之,發(fā)酵溫度與接種量的交互作用對(duì)桑葚酵素總酚含量的影響不顯著。

圖5 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑葚酵素總酚含量的交互影響

圖6 發(fā)酵時(shí)間與接種量對(duì)桑葚酵素總酚含量的交互影響

圖7 發(fā)酵溫度與接種量對(duì)桑葚酵素總酚含量的交互影響

對(duì)回歸方程求解后,得出最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間39.30 h、發(fā)酵溫度31.48 ℃、接種量24.51%,得到的桑葚酵素理想總酚含量為41.11 μg/mL。綜合考量儀器條件和可操作性,將發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵時(shí)間40 h、發(fā)酵溫度32 ℃、接種量25%。按此發(fā)酵條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),得到桑葚酵素的總酚含量為(43.48±0.67) μg/mL,與響應(yīng)面模型的預(yù)測值相近,表明優(yōu)化得到發(fā)酵工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4 桑葚酵素的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 感官品質(zhì) 采用優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件釀制的桑葚酵素呈紫紅、色澤均勻;具有濃郁的桑葚果香和發(fā)酵的香味,無異味;酸味柔和,風(fēng)味好;無雜質(zhì),有光澤,無沉淀。

2.4.2 理化指標(biāo) 新鮮桑葚汁與桑葚酵素的總酚含量、可溶性固體物和pH值見表4。

表4 桑葚酵素的理化指標(biāo)

由表4可知,對(duì)比之下,優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下制得的桑葚酵素總酚含量是新鮮桑葚汁的1.62倍,有助于提高其抗氧化能力。韓曉云等[11]研究也發(fā)現(xiàn)桑葚發(fā)酵后的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率由發(fā)酵前的(45.97±2.23)%顯著提高到(59.01±3.59)%(P<0.05);對(duì)羥自由基清除率由發(fā)酵前的(68.68±1.23)%顯著提高到(78.55±0.57)%(P<0.05)。發(fā)酵后的桑葚酵素pH值相比于未經(jīng)發(fā)酵的新鮮桑葚汁有所下降,表明乳酸菌發(fā)酵時(shí)發(fā)生代謝作用產(chǎn)出乳酸致使發(fā)酵液的pH值下降;桑葚酵素的可溶性固體物為5.36%,符合GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》中:發(fā)酵果蔬汁的可溶性固體物大于5.0%的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3 微生物指標(biāo) 桑葚酵素的微生物指標(biāo)見表5。

表5 桑葚酵素的微生物指標(biāo)

由表5可知,該桑葚酵素的微生物指標(biāo)符合GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》和GB 7101—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

以新鮮桑葚汁為原料,植物乳桿菌為生產(chǎn)菌種,總酚含量為指標(biāo),經(jīng)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葚酵素發(fā)酵工藝,確定最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間40 h、發(fā)酵溫度32 ℃、接種量25%,此發(fā)酵工藝下制得的桑葚酵素的總酚含量達(dá)(43.48±0.67) μg/mL,是未經(jīng)發(fā)酵的桑葚汁的1.62倍。質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明,所釀制的桑葚酵素呈紫紅、色澤均勻;具有濃郁的桑葚果香和發(fā)酵的香味,無異味;酸味柔和,風(fēng)味好;無雜質(zhì),有光澤,無沉淀。該桑葚酵素指標(biāo)符合GB/T 10789—2015《飲料通則》、GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》和GB 7101—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)將對(duì)酚類物質(zhì)組成和含量以及對(duì)桑葚酵素品質(zhì)的影響進(jìn)一步探究。