邢倩倩

(1. 乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海 200436;2. 上海乳業(yè)生物工程技術研究中心,上海 200436;3. 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;4. 食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫 214122)

近幾年,超臨界流體色譜硬件和軟件發(fā)展迅速,可分析表征的樣品范圍也在不斷擴大,越來越接近反相液相色譜的適用范圍。超臨界流體色譜技術具有“環(huán)?！焙汀熬G色”的優(yōu)勢,基于其短時的分析速度可實現(xiàn)快速分析。超臨界流體色譜已成為分析和制備規(guī)模上實現(xiàn)手性分析的首選方式[1-2]。預計未來超臨界流體色譜技術在石油化工、食品工業(yè)、環(huán)境空氣質(zhì)量檢測、生物柴油質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)分離等方面將有良好的應用。近些年,超臨界流體色譜在食品相關分析方面應用越來越多[3-6]。文章主要針對超臨界流體在食品質(zhì)量和食品安全檢測方面的應用展開討論,以期為相關研究提供依據(jù)。

1 超臨界流體色譜簡介

1.1 流動相

超臨界流體具有與液體相似的密度和溶解能力,同時具有與氣體相似的黏度和擴散特性。因此,在色譜中用作流動相的超臨界流體既如氣相色譜中的流動相一樣可以充當物質(zhì)載體,又如液相色譜中的溶劑一樣可以溶解這些物質(zhì)。以超臨界流體作為流動相的色譜分離模式稱為超臨界流體色譜。Klesper等[7]完成了14 MPa壓力和150～170 ℃溫度下使用超臨界氯氟甲烷分離熱不穩(wěn)定的卟啉衍生物的工作。但此時超臨界流體色譜的發(fā)展無法與同時出現(xiàn)的高效液相色譜的迅猛發(fā)展相提并論。

二氧化碳的臨界溫度和壓力分別為31 ℃和7.3 MPa,超臨界流體狀態(tài)易實現(xiàn),且具有無毒、防爆等優(yōu)點,是超臨界流體色譜中使用最廣泛的流動相。超臨界流體色譜最初是用純超臨界二氧化碳作為流動相實現(xiàn)分析,但現(xiàn)在超臨界流體色譜中二氧化碳流動相被有機改性劑或添加劑改性以增加極性化合物的溶解度,其分離過程主要在亞臨界條件下進行[8]。超臨界二氧化碳作為流動相的主要成分,決定了流動相的低黏度、高分子擴散性和環(huán)境友好性。與液相色譜相比,超臨界流體色譜可實現(xiàn)更高的流速和更低的柱壓降,從而可在較短分析時間內(nèi)提高效率并減少有機溶劑的消耗。色譜柱平衡時間更短意味著超臨界流體色譜具有更尖銳的峰、更高的分辨率和更短的方法建立時間[9]。

1.2 色譜柱

早期的超臨界流體色譜分離過程主要使用填充柱。20世紀80年代早期,氣相色譜技術中常用的開管色譜柱被成功應用于超臨界流體色譜技術。超臨界色譜技術中所用開管色譜柱具有兩個特點:① 色譜柱內(nèi)徑更小;② 色譜柱內(nèi)填充的聚合物固定相交聯(lián)更密切[10]。目前,超臨界流體色譜技術主要使用液相色譜柱,由于使用與液相色譜技術基本相同的硬件和軟件,被視為一種類似于高效液相色譜的分離技術。超臨界流體色譜主要使用極性固定相,例如純硅膠、氰丙基硅膠、3-氨基丙基硅膠和2-乙基吡啶基硅膠等。近期,專為液相色譜設計的亞2 μm粒徑色譜柱在超臨界流體色譜中也有應用,但由于該種色譜柱建立的方法存在峰容量低、選擇性差等限制,該類色譜柱不是超臨界流體色譜的最佳選擇。由于使用超臨界流體色譜分離堿性或酸性化合物時,必須使用調(diào)節(jié)pH值添加劑以獲得良好的峰形,該情況促進了超臨界流體色譜專用新型固定相(無需使用添加劑即可獲得良好的峰對稱性)的開發(fā)[11]。

1.3 儀器

超臨界流體色譜系統(tǒng)由兩個泵組成:① 用于提供有機改性劑;② 用于推動超臨界二氧化碳流體。通過電子冷卻裝置控制超臨界流體的泵溫度低于-4 ℃。進樣裝置通常采用進樣環(huán)模式,色譜柱放置在與高效液相色譜類似的柱溫箱中。超臨界流體儀器主要使用高效液相色譜型檢測器,通過在檢測器之后運行的背壓調(diào)節(jié)器來控制系統(tǒng)壓力,使用質(zhì)譜檢測器時系統(tǒng)背壓在檢測器之前進行控制。

超臨界流體色譜儀器主要有兩種類型:流速≤20 mL/min的分析型儀器和用于工業(yè)級規(guī)模分離的制備型儀器[12]。制備型超臨界流體色譜儀器可以進一步細分:半制備型儀器的流速范圍為20～200 mL/min;較大型制備系統(tǒng)色譜柱單位以英寸替代為毫米,流速單位為“L/min”。

1.4 技術特色

正相和反相液相色譜柱均可應用于現(xiàn)代超臨界流體色譜技術。盡管與正相液相色譜相比,超臨界流體色譜分離化合物極性范圍更廣、分離能力更強,但該技術通常被認為是一種正相色譜。Lesellier[13]認為現(xiàn)代超臨界流體色譜稱為“合相色譜”更合適。與反相高效液相色譜相比,超臨界流體色譜具有更高的色譜柱流速/樣品通量,更快速的平衡時間和更短的循環(huán)時間。超臨界流體色譜分析過程運行成本更低,并且與反相液相色譜有良好的正交性。

由于超臨界流體色譜溶劑消耗低,因此其產(chǎn)生的廢液也較少。分析過程完成后,超臨界流體色譜中的二氧化碳會揮發(fā)掉,目標化合物可以在相對少量的溶劑中完成分離,上述特點對于洗脫溶劑體積消耗較大的制備型色譜分離應用尤為重要。

2 超臨界流體色譜在食品質(zhì)量檢測方面的應用

食品質(zhì)量的分離分析是分析化學的一個重要議題[14]。由于食品質(zhì)量方面需要檢測的目標組分(包括營養(yǎng)物質(zhì)、生物活性物質(zhì)和質(zhì)量標志成分等)數(shù)量龐大且種類繁多,使得色譜成為該議題應用最廣泛的方法,其中液相色譜和氣相色譜是應用最廣泛的技術。近些年,超臨界流體色譜在食品質(zhì)量分析領域應用亦越來越多[15-18]。

2.1 脂質(zhì)

脂質(zhì)是三大食品營養(yǎng)素之一,是細胞膜的結(jié)構(gòu)成分,在能量儲存和細胞信號傳導等許多生物過程中起著至關重要的作用[19]。脂質(zhì)通常被認為是疏水化合物,由于疏水性?；湹牟煌M合,具有結(jié)構(gòu)多樣性,并且由于與親水性部分(如磷酸或碳水化合物)的結(jié)合,具有極性多樣性。脂質(zhì)可分為不包含極性基團的中性脂質(zhì),包括甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇和角鯊烯等;含有極性基團的極性或復合脂質(zhì),包括磷脂、糖脂、鞘脂、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂和腦苷脂等[20]。中性脂質(zhì)用于產(chǎn)生能量,而復合脂質(zhì)是細胞膜的成分,具有多種生物活性作用。

乳品脂質(zhì)是自然界中最復雜的物質(zhì)之一,與許多生理功能相關,因此全面表征脂質(zhì)特征對于評估乳品的營養(yǎng)價值非常重要[21-22]。Tu等[23]使用超臨界流體色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜,建立了一種識別母乳和嬰兒配方奶粉中三酰甘油的方法。成功鑒別出母乳中的60個三酰甘油和嬰兒配方奶粉中的50個三酰甘油。分析結(jié)果表明,母乳中的三酰甘油受泌乳階段的影響較大。母乳和進口嬰兒配方奶粉的三酰甘油之間存在顯著差異,嬰兒配方奶粉中的中鏈三酰甘油較高,三酰甘油飽和度高,表明國外廠商開發(fā)的嬰兒配方奶粉并不適合中國寶寶。Tang等[24]建立了超高效超臨界流體色譜耦合電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜方法在7 min內(nèi)分析牛、山羊、水牛、母乳和嬰兒配方奶粉的中極性和極性脂質(zhì),分離出12類脂類(三酰甘油、二酰甘油、單甘油酯、脂肪酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、球鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺),并對每一類脂類進行鑒別。成功對實際樣品中的250種脂質(zhì)進行了表征和定量。該結(jié)果證明了超臨界流體色譜耦合電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜方法在乳品高通量全面脂質(zhì)分析中的適用性,有望為營養(yǎng)學家提供不同類型乳品中的脂質(zhì)分布,以幫助設計更適合的嬰兒配方奶粉。Buszewski等[25]利用線性溶劑化能關系模型描述磷脂在超臨界色譜中的保留機制。使用了7種具有不同物理化學性質(zhì)的固定相。由于磷脂分子結(jié)構(gòu)包含極性磷酸基團和與兩個非極性脂肪酸結(jié)合的極性“頭”,其分離機理非常復雜。定量結(jié)構(gòu)—保留關系不僅可以確定測試化合物的保留情況,還可以顯示不同固定相的作用力差別。磷脂在超臨界流體色譜模式下,氟苯基柱、2-乙基吡啶柱和二醇基柱的保留機制基于氫鍵作用,2-氨甲基吡啶柱和1-蒽胺色譜柱的保留基質(zhì)基于π—π相互作用,乙烯鍵合橋柱和C18色譜柱的保留機制基于范德華作用力。結(jié)果顯示,2-乙基吡啶柱、2-氨甲基吡啶柱和1-蒽胺色譜柱更適合超臨界流體色譜模式下磷脂的分離分析。通常反相液相色譜保留機制基于疏水作用力,而正相液相色譜保留機制基于親水作用力、π—π作用力和分散作用力,該工作表明超臨界流體色譜分離過程具有雙重相互作用力的特征。

超臨界流體色譜分離模式下脂質(zhì)類物質(zhì)的分離保留規(guī)律與反相液相色譜和正相液相色譜均有區(qū)別,可用于識別新型脂質(zhì)類物質(zhì)。超臨界流體色譜分離模型下復雜食品體系中脂質(zhì)的分離表征具有分辨率高、分離速度快等優(yōu)勢,可在更短分析時間內(nèi)識別出更多的脂質(zhì)類物質(zhì)。

2.2 類胡蘿卜素

類胡蘿卜素是分布最廣的一類天然脂溶性色素,由8個異戊二烯單元組合而成,在生物過程中發(fā)揮著重要作用。類胡蘿卜素具有明顯的抗氧化活性,作為潛在的抗癌、抗衰老和預防心血管疾病化合物備受關注[26]。

Matsubara等[27]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析β-胡蘿卜素、玉米黃素、番茄紅素、葉黃素、環(huán)氧玉米黃素、新葉黃素和紫黃素的混合物。該方法選擇整體C18色譜柱在15 min內(nèi)完成7種類胡蘿卜素的分離,進而通過選擇更短色譜柱和更高的流速將方法縮短至4 min。成功對類胡蘿卜素化合物進行了高通量、高分辨率和高靈敏度分析,使用此方法可以獲得包含復雜基質(zhì)的生物樣品的代謝概況,用于篩選含有類胡蘿卜素的菌株。該研究小組[28]還研究了超臨界流體色譜對β-玉米黃素和9種β-玉米黃素脂肪酸酯的分離,包括月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、亞油酸酯、二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯。該方法選擇聚合型C18色譜柱,在20 min內(nèi)完成10種物質(zhì)的分離,成功應用于柑橘類水果的定量分析。結(jié)果表明,所檢測水果中含有少量的β-玉米黃素丁酸酯、己酸酯、辛酸酯和癸酸酯。Miao等[29]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)紫外串聯(lián)質(zhì)譜檢測器法測定喂食β-胡蘿卜素母雞產(chǎn)蛋的蛋黃中類胡蘿卜素和維生素A的檢測。結(jié)果顯示,蛋雞日糧中的β-胡蘿卜素可部分沉積在蛋黃中,通過β-胡蘿卜素的生物轉(zhuǎn)化提高蛋黃中維生素A含量。

超臨界流體色譜在類胡蘿卜素分離分析方面呈現(xiàn)快速、高效及節(jié)能等優(yōu)勢。

2.3 維生素

維生素是一種維持多種生物功能必不可少的小分子有機化合物,可分為水溶性維生素和脂溶性維生素,其中脂溶性維生素一般從飲食中獲得。飲食中缺乏脂溶性維生素(維生素A、D、E、K)可能導致失明(缺乏維生素A)、骨軟化癥(缺乏維生素D)、氧化細胞應激增加(缺乏維生素E)和出血(缺乏維生素K)[30]。高效液相色譜是脂溶性維生素分析中使用的常規(guī)技術。然而,脂溶性維生素的精確測定仍然是分析人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。

Liu等[31]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法用于測定人血漿中維生素代謝物,在超臨界流體色譜和液相色譜系統(tǒng)中維生素D代謝物具有不同的洗脫特性。超臨界流體色譜有效改進了等質(zhì)量分析物的分離,呈現(xiàn)比液相色譜更短的保留時間和更高的靈敏度。與反相液相色譜相比,超臨界流體色譜中的超臨界二氧化碳更環(huán)保,有機溶劑消耗更少。超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可以高通量、精確地分析維生素D代謝物含量。Andri等[32]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)紫外法分析維生素D3和有關雜質(zhì),該方法與傳統(tǒng)的液相色譜法(耗時20 min)相比,時間縮短至2 min左右。

相比于傳統(tǒng)液相色譜法,超臨界流體色譜在脂溶性維生素分離分析方面可大大縮短分析時間,且溶劑成本較低,產(chǎn)生的液體有機廢物量也明顯較少,更符合節(jié)能減排,綠色分析的主旨。

3 超臨界流體色譜在食品安全檢測方面的應用

食品安全是食品領域重要的議題,主要體現(xiàn)在:① 食品中的農(nóng)藥和獸藥殘留即使在較低的濃度下也可能對健康造成不良影響;② 食品在加工、包裝和貯藏過程中對人體有害物質(zhì)可能會發(fā)生遷移,產(chǎn)生持續(xù)危害;③ 仍存在蓄意行為引發(fā)的食品安全問題需要曝光和防范[33]。

3.1 農(nóng)藥

用殺蟲劑處理農(nóng)作物是維持農(nóng)產(chǎn)品穩(wěn)定供應的有效工具。但農(nóng)藥的使用導致食品安全問題增多,需要對農(nóng)藥殘留進行監(jiān)測和記錄。

超臨界流體色譜作為分離科學中一項強大的綠色技術,已被應用于食品安全中的農(nóng)藥分析[34]。Cheng等[35]建立了一種高效、靈敏的手性分析方法,通過超臨界流體色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法,在Chiralpak AD-3柱上以CO2/乙醇(VCO2∶V乙醇為93∶7)作為流動相進行丙環(huán)唑異構(gòu)體分離。4種丙環(huán)唑異構(gòu)體在4.7 min內(nèi)得到良好分離,分離度>2.0;小麥秸稈和葡萄發(fā)生顯著的立體選擇性降解,但在土壤中未觀察到對映選擇性。以上結(jié)果有助于更準確地評估丙環(huán)唑的環(huán)境風險和食品殘留。Tao等[36]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法用于測定蔬菜、水果、谷物和土壤中的芬布康唑及其兩種手性代謝物。基于優(yōu)化的色譜條件,4 min內(nèi)完成了6種異構(gòu)體的基線分離。所開發(fā)的方法比前期報道的液相色譜方法更環(huán)保,更靈敏,并且大大減少了分析時間和人工成本。6種目標分析物的平均回收率為76.3%～104.6%,定量限均<3.31 μg/kg。后續(xù)該方法可以擴展到芬布康唑及其手性代謝物在植物基質(zhì)中的立體選擇性降解和轉(zhuǎn)化研究,將有助于降低這些化合物對人類健康和環(huán)境造成的風險。Cutillas等[37]建立了超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法完成番茄、橙子和韭菜中164種農(nóng)藥的定量分析,可以鑒定番茄、橙子和韭菜中質(zhì)量分數(shù)為5 μg/kg的164種目標農(nóng)藥中的大多數(shù),以及質(zhì)量分數(shù)為10 μg/kg的所有化合物。綜上,超臨界流體色譜在手性農(nóng)藥及多種類農(nóng)藥識別方面呈現(xiàn)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)正相色譜和反相色譜的表現(xiàn)。

3.2 化學副產(chǎn)物

食用油中的3-氯丙烷-1,2-二醇脂肪酸酯主要在油脂精煉過程中產(chǎn)生,特別是在高溫脫臭步驟中易生成。3-氯丙烷-1,2-二醇會對腎臟造成不良影響,因此需對食用油中的3-氯丙烷-1,2-二醇脂肪酸酯進行測定。Hori等[38]采用超臨界流體色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定了食用油中的3-氯丙烷-1,2-二醇脂肪酸酯,克服了氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法無法分離3-氯丙烷-1,2-二醇和3-氯丙烷-1,2-二醇脂肪酸酯以及液相色譜法靈敏度不足的問題。色譜條件為Inertsil ODS-4(250 mm×4.6 mm, 5 μm),柱溫為35 ℃,背壓為10 MPa,流速為3 mL/min,改性劑為0.1%甲酸銨—甲醇,在正離子模式下使用電噴霧電離將分析物電離為銨加合物。該方法在9 min內(nèi)完成了14種分析物的分離,檢測限范圍為0.013～0.063 mg/kg。該方法應用于6種不同類型的油樣品分析,結(jié)果表明3-氯丙烷-1,2-二醇脂肪酸酯主要在棕櫚油精煉過程中產(chǎn)生。

丙烯酰胺作為美拉德反應的代表性產(chǎn)物之一,主要是食物中的葡萄糖和天冬酰胺等在低濕度條件下被加熱到120 ℃以上生成。丙烯酰胺具有毒性、可致癌,多個國際組織已對食品中的丙烯酰胺進行了風險評估[39]。Yoshioka等[40]開發(fā)了一種高靈敏超臨界流體串聯(lián)質(zhì)譜方法,用于快速定量各種飲料、谷物和糖果中的丙烯酰胺,該方法的靈敏度比高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜約高11倍。超臨界流體串聯(lián)質(zhì)譜方法離子源中二氧化碳的蒸發(fā)有助于提高丙烯酰胺的檢測靈敏度,定量限為0.50 μg/kg,可完成無法通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法定量的烘焙大麥茶和咖啡中的低濃度丙烯酰胺檢測。

生物胺在魚、肉和醬油等食品中均存在,而食用含有高濃度生物胺的食物易對健康產(chǎn)生危害[41-42]。Song等[43]開發(fā)了一種使用超臨界流體色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用的綠色高效方法來測定醬油中的生物胺。使用5%水和0.2%氨的甲醇溶液作為流動相添加劑,在12 MPa背壓和40 ℃柱溫下,9種生物胺在Cosmosil 5 HP色譜柱上25 min內(nèi)得到良好分離。該工作對所建立的方法在線性、靈敏度、精密度和準確度方面進行了充分驗證,檢測限和定量限范圍分別為0.03～10.50 μg/mL和0.10～23.10 μg/mL,所建立方法被成功應用于醬油中生物胺的定量分析,表明加工過程和貯藏條件均會影響醬油中生物胺含量。

超臨界流體色譜在食品化學副產(chǎn)物方面的應用越來越廣,預計該方法將來會有更多在痕量化學危害成分分析方面的應用。

3.3 生物副產(chǎn)物

黃曲霉毒素是曲霉屬真菌、黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2主要存在于玉米和花生等多種農(nóng)作物,尤其是貯藏在炎熱潮濕的環(huán)境中的農(nóng)作物中。由于黃曲霉毒素具有致突變、致畸和致癌作用,許多國家均對食品和飼料中的黃曲霉毒素設定了限量,并高度重視這些化合物的控制和監(jiān)測。Lei等[44]建立的超臨界流體串聯(lián)質(zhì)譜法完成了食用油中4種黃曲霉毒素的定量檢測,通過優(yōu)化分離柱、改性劑和樣品溶劑等超臨界流體色譜條件,實現(xiàn)了4種目標黃曲霉毒素的基線分離。黃曲霉毒素的定量限為0.05～0.12 μg/L。并研究了電噴霧離子源接口參數(shù),表明補充流量是超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜靈敏測定的關鍵因素。該工作表明超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用在食品中痕量生物污染物測定方面具有巨大潛力。

超臨界流體色譜在食品中農(nóng)藥、化學副產(chǎn)物和生物副產(chǎn)物分離分析方面的應用均呈快速、高效、分辨率高、節(jié)省溶劑等優(yōu)勢,后續(xù)復雜食品基質(zhì)中該類化合物的分離分析和含量控制可考慮該分離模式。

4 結(jié)論與展望

盡管有很多學者為確保食品質(zhì)量與安全做出了努力,但由于缺乏成熟的技術,保證食品質(zhì)量與安全仍存在挑戰(zhàn)性。一方面,人類的生存離不開足夠的食物供應,另一方面,建立成熟的技術來檢測甚至消除食品中存在的有毒有害物質(zhì)還有很長的路要走。超臨界流體色譜適用于食品中簡單或中等復雜物質(zhì)的直接、快速和高通量分析,以及復雜食品中低濃度分析物的快速測定。超臨界流體色譜在省時、高通量、低毒和生態(tài)友好方面具有無限的潛力,未來其在食品分析中的應用會越來越廣泛。