曾陽俊，周玲旭，謝毅明，張 嫻

（1.簡陽市疾病預(yù)防控制中心，四川 簡陽 641400；2.重慶市渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 400000；3.德陽市食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，四川 德陽 618000）

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的高速發(fā)展及人們飲食和生活習(xí)慣的改變，一些代謝性疾病如糖尿病、高脂血癥等，已經(jīng)開始嚴(yán)重威脅人們的身體健康，而且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而飲酒與這些疾病的關(guān)系是人們近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。目前飲酒對血糖和胰島素影響的研究相對較少，但已有的研究發(fā)現(xiàn)，適量飲酒可以提高大鼠胰島素敏感性，降低2 型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；長期過量的酒精攝入，則可引起大鼠空腹血糖升高，胰島素下降，導(dǎo)致胰島功能受損[1]。提示飲酒對機(jī)體糖代謝有一定影響，而量的控制十分重要。目前，適量飲酒對機(jī)體糖代謝有何影響及通過哪些因子進(jìn)行調(diào)控，還未有研究闡明。

本研究采用高脂高糖飼料飼養(yǎng)大鼠，更加接近實(shí)際飲酒人群的飲食習(xí)慣，并以兩種四川濃香型白酒灌胃，通過測定機(jī)體糖代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)酶指標(biāo)，研究了攝入不同劑量白酒對大鼠糖代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)酶和脂肪組織GLUT4 mRNA 表達(dá)水平的影響，以期揭示攝入不同劑量不同品質(zhì)白酒影響機(jī)體糖代謝的機(jī)制，并為其他學(xué)者做進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：105 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，由四川大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重180～220 g；飼養(yǎng)條件：溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～60%；飼料：基礎(chǔ)飼料58%、蔗糖13%、豬油13%、蛋黃粉10%、膽固醇2%和蛋白粉4%，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

酒樣：兩種不同品質(zhì)的52°濃香型白酒，其中酒樣1 為某品牌名優(yōu)白酒，市場售價(jià)260 元/kg；酒樣2為散裝白酒，市場售價(jià)7.5 元/kg。

ELISA 試劑盒：北京誠林生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：BIO-RAD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及灌胃劑量

將105 只雄性清潔級SD 大鼠分箱群養(yǎng)，每籠5 只。按體重隨機(jī)分成7 組，分別為酒樣1 低劑量、酒樣1中劑量組、酒樣1 高劑量組、酒樣2 低劑量組、酒樣2 中劑量組、酒樣2 高劑量組和對照組，每組15 只。灌胃時(shí)間參照《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020 年版）》[2]每組每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃8 周，灌胃期間自由進(jìn)水、正常飲食，每周稱1 次體重，并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量。灌胃劑量參照《中國居民膳食指南（2022）》[3]中“建議成年男性一天飲用酒的酒精量不超過25 g”分別設(shè)置，酒樣1 低、中、高劑量組分別設(shè)置為1.3 mL·kg-1·d-1、2.6 mL·kg-1·d-1、5.1 mL·kg-1·d-1；酒樣2 低、中、高劑量組分別設(shè)置為1.3 mL·kg-1·d-1、2.6 mL·kg-1·d-1、5.1 mL·kg-1·d-1；對照組用蒸餾水灌胃，劑量為1.3 mL·kg-1·d-1、2.6 mL·kg-1·d-1、5.1 mL·kg-1·d-1。

1.2.2 樣本采集與處理

大鼠灌胃8 周后禁食24 h，股動(dòng)脈取血后處死。全血室溫靜置10～20 min，以3 000 r·min-1低溫離心20 min 后取血清。打開腹腔摘取腎周、睪丸周圍脂肪組織，盡量完整，用預(yù)冷生理鹽水清洗后，再取0.05 g 脂肪組織于凍存管，液氮中超低溫保存，以備提取總RNA。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 3 種酶的測定

用ELISA 方法（試劑盒）測定各組大鼠腺苷酸蛋白激酶（Adenosine 5’-Monophosphate-Activated Protein Kinase，AMPK）、磷酸化的腺苷酸蛋白激酶（Phosphorylated AMPK，P-AMPK）、葡萄糖調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glucose Transporter 4，GLUT4），具體檢測步驟參照產(chǎn)品說明書，樣品來源均為大鼠脂肪組織。

1.3.2 GLUT4 mRNA 的測定

用試劑盒進(jìn)行脂肪組織的總RNA 提取，反應(yīng)條件為25 ℃反應(yīng)5 min、42 ℃反應(yīng)30 min、85 ℃反應(yīng)5 min，產(chǎn)物置于-70 ℃超低溫保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5×iScript reaction mix 4 μL，iScript reverse transcriptase 1 μL，Nuclease-free water 14 μL，RNA template（100 fg to 1 μg total RNA 1 μL，Total volume 20 μL）。

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[4-5]篩選GLUT4 及內(nèi)參基因β-actin 作為特異性引物，試劑公司合成后，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 產(chǎn)物為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，反應(yīng)體系為SsoFast EvaGreen supermix 10 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，RNase/DNase-free water 7 μL，DNA template 1 μL，Total volume 20 μL。引物信息：GLUT4-F-GCAAGGACAGTGGACGCTCTCTTTC；R-CTGGGTAGGCAGGGTCTGGGGG；β-actin-FACTCTGTGTGGATTGGTGGC；R-AGCTCAGTAAC AGTCCGCCT。反應(yīng)條件：95.0 ℃，1 min；95.0 ℃，5 s；60.0 ℃，10 s；72.0 ℃，12 s（Plate Read）；40 個(gè)循環(huán)。同時(shí)做溶解曲線：溫度為65.0～95.0 ℃，每升高0.5 ℃停留5 s。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以x-±s表示，PCR 結(jié)果根據(jù)Ct 值以內(nèi)參基因（β-actin）進(jìn)行相對定量，以2-△△Ct表示，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析，以LSD 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMPK 檢測結(jié)果

如表1 所示，酒樣1 低劑量組的AMPK 含量顯著高于對照組（P＜0.05）；酒樣間對比，酒樣1 低劑量組的AMPK 含量高于酒樣2 低劑量組（P＜0.05）。低劑量的酒樣1 使大鼠體內(nèi)AMPK 含量水平高于對照組，而其他組和對照組維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的波動(dòng)范圍，可見酒樣1 低劑量組可以提高大鼠體內(nèi)AMPK 水平，增加AMPK 磷酸化供給，而長期攝入酒樣2 對這一指標(biāo)的影響不大，酒樣對比發(fā)現(xiàn)低劑量組名優(yōu)白酒提高AMPK 含量的效果優(yōu)于散裝白酒。

表1 各組大鼠糖代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)酶含量表

2.2 P-AMPK 檢測結(jié)果

如表1 所示，酒樣2 各組的P-AMPK 水平均顯著低于對照組（P＜0.05），而酒樣1 各劑量組對大鼠該項(xiàng)指標(biāo)基本無影響。兩種酒樣各劑量組相互比較得知，各組在促進(jìn)分解代謝、增加胰島素敏感性上沒有差異。

2.3 GLUT4 檢測結(jié)果

如表1 所示，酒樣1 的低、中劑量組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)于對照組（P＜0.05），說明長期攝入適量的酒樣1 可以增加大鼠機(jī)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而酒樣2對大鼠機(jī)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響不明顯。兩組酒樣間對比發(fā)現(xiàn)，酒樣1 的低、中劑量組轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能力分別強(qiáng)于酒樣2 的低、中劑量組（P＜0.05）。

2.4 GLUT4 mRNA 檢測結(jié)果

如表1 所示，酒樣1 和酒樣2 各劑量組GLUT4轉(zhuǎn)錄水平均高于對照組（P＜0.05）。長期飲用酒樣1或酒樣2 的大鼠GLUT4 mRNA 水平表達(dá)會(huì)有上調(diào)，這可能是飲酒導(dǎo)致機(jī)體胰島功能改變的原因之一。

3 結(jié)論與討論

AMPK 是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，可通過開啟分解代謝，關(guān)閉合成代謝，維持代謝平衡和能量穩(wěn)態(tài)，增加葡萄糖攝取，抑制糖類合成，使胰島素敏感性增加[6-9]。通過分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，長期適量飲用好品質(zhì)白酒可以使大鼠體內(nèi)AMPK 水平升高，正向調(diào)節(jié)胰島素敏感性，促進(jìn)機(jī)體糖代謝，而白酒的品質(zhì)及飲用量的控制在其中起著關(guān)鍵作用。P-AMPK 即磷酸化的AMPK，研究表明AMPK 可促進(jìn)脂肪酸氧化，抑制脂肪和蛋白質(zhì)的合成，有明顯對抗胰島素的作用[10]。對于本實(shí)驗(yàn)中AMPK 的利用情況，通過各組數(shù)據(jù)無法得出準(zhǔn)確結(jié)論，需要進(jìn)一步研究。GLUT4主要反映細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力，當(dāng)胰島素水平下降時(shí)，GLUT4 通過胞吞作用從細(xì)胞膜回到囊泡內(nèi)，由此保持組織血糖平衡[11-12]。GLUT4 mRNA 反映葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平，檢測GLUT4 mRNA 指標(biāo)有助于從分子水平上探討細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力，其表達(dá)和功能改變與骨骼肌、脂肪組織的胰島素抵抗密切相關(guān)。

本文的研究表明，長期攝入適量濃香型白酒會(huì)影響大鼠機(jī)體AMPK、P-AMPK、GLUT4 等調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)酶，同時(shí)使GLUT4 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，這可能是長期適量飲用白酒影響大鼠糖代謝的機(jī)制之一。本文通過兩種不同品質(zhì)濃香型白酒的對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒的品質(zhì)對糖代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)酶指標(biāo)有重大影響，建議飲酒人群加強(qiáng)對酒的品質(zhì)的關(guān)注，盡量選擇健康安全的白酒；同時(shí)飲用劑量的控制也非常關(guān)鍵，建議參考《中國居民膳食指南（2022）》，綜合考慮各項(xiàng)因素的影響，提倡合理、健康、科學(xué)飲酒。至于長期適量飲酒對糖代謝其他各項(xiàng)指標(biāo)的影響及其影響機(jī)制，則有待于做進(jìn)一步研究。