殷光玲，賢 歡，肖義然，黃遠英

（湯臣倍健股份有限公司營養(yǎng)健康研究院，廣東 廣州 510700）

氨糖軟骨素鈣片是一種以氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、骨碎補、CaCO3和酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide，CPP）為主要原料的保健食品，具有增加骨密度的作用。本產(chǎn)品所添加的5 個主要原料均有相關(guān)研究證明其在增加骨密度方面的作用。氨基葡萄糖是關(guān)節(jié)軟骨組織的主要成分之一，外源性補充氨基葡萄糖可促進軟骨膠原合成，維持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的完整性，促進鈣沉積，增強骨密度[1]。已有動物試驗證明氨基葡萄糖可逆轉(zhuǎn)骨量的丟失，改善骨質(zhì)疏松[2]。硫酸軟骨素是一種糖胺聚糖，是結(jié)締組織的成分之一，大量文獻報道了其對骨關(guān)節(jié)炎的改善作用[3-4]。有研究表明，硫酸軟骨素和氨基葡萄糖聯(lián)用，對于骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療具有協(xié)同增效作用[5]。骨碎補是藥典記載的一種根莖類中藥，屬水龍骨科，國內(nèi)外已有較多研究表明其可有效抑制骨質(zhì)流失、加速骨骼傷患的康復(fù)，骨碎補黃酮是主要的功效物質(zhì)[6]。鈣是人體骨骼的主要成分，確保體內(nèi)血鈣的正常水平對于防治骨質(zhì)疏松癥尤為重要[7-8]。而CPP 作為一種牛乳水解活性肽，由于其分子結(jié)構(gòu)中含有持鈣能力較強的陰離子簇，可促進人體對鈣離子的吸收。動物試驗表明，CPP 與鈣同時攝入，可提高體內(nèi)血清和股骨鈣水平，增強骨密度[9-11]。已有較多研究報道了氨糖軟骨素鈣片中各主要功能原料的功效性，而對于幾種功能原料組成的復(fù)合物的安全性，尚無相關(guān)文獻報道。本研究以氨糖軟骨素鈣片為受試物，通過動物試驗評估，獲取系統(tǒng)的安全性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

氨糖軟骨素鈣片：由湯臣倍健股份有限公司提供，人體口服劑量為0.069 g·（kg bw）-1。取樣品用粉碎機粉碎成粉末后進行試驗。

1.2 試驗動物

SPF 級昆明種小鼠和SD 大鼠：長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2014-001。

1.3 儀器與試劑

SYSMEX XT-2000i 全自動血球計數(shù)儀，日本希森美康；BECKMAN COULTER AU 680 全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特；METTLER TOLEDOAB204-N 分析天平，梅特勒托利多；疊氮鈉（NaN3），Ruibio；2-氨基茐、9-茐酮，Aladdin；絲裂霉素C（Mitomycin C，MMC），購自Roche；1,8-二羥基蒽酮，Sigma；S9 混合液，上海齊源生物；環(huán)磷酰胺，上海瑞永生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

參照GB 1519.3—2014[12]，采用最大耐受劑量法進行急性毒性試驗，選用小鼠作為試驗動物，以羧甲基纖維素水溶液作為受試物溶劑，受試液濃度為50%，單次灌胃劑量為20.0 g·（kg bw）-1。灌胃后14 d 內(nèi)，監(jiān)測小鼠生長狀態(tài)。

1.4.2 Ames 試驗

參照GB 15193.4—2014[13]，用于測試的菌株為鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102。設(shè)溶劑對照組（二甲亞砜）、陽性對照組、自發(fā)回變組和受試樣不同劑量組（8 μg/皿、40 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿、5 000 μg/皿）。其中不同組別中陽性對照設(shè)置內(nèi)容：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9 的陽性對照為2-AF（10.0 μg/皿）；TA97a-S9、TA98-S9組陽性對照為9-芴酮（0.2 μg/皿）；TA100-S9 組陽性對照為NaN3（1.5 μg/皿）；TA102+S9 組陽性對照為1,8-二羥蒽醌（50.0 μg/皿）；TA102-S9 組陽性對照為MCC（0.5 μg/皿）。

若回變菌落數(shù)是自發(fā)回變組的2 倍及以上，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，則判斷為陽性結(jié)果。

1.4.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

參照GB 15193.5—2014[14]，經(jīng)口灌胃，采用30 h給受試物法。受試小鼠隨機分為5組，設(shè)陽性對照組（環(huán)磷酰胺）、陰性對照組（1%羧甲基纖維素）和受試樣不同劑量組[低劑量組2.5 g·（kg bw）-1、中劑量組5.0 g·（kg bw）-1、高劑量組10.0 g·（kg bw）-1]，每組10 只。給藥結(jié)束后處死小鼠，取胸骨制成細胞懸液涂片。觀察并計算含微核嗜多染紅細胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE）千分率和嗜多染紅細胞占總紅細胞的比值（PCE/NCE）。

1.4.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗

參照GB 15193.8—2014[15]，進行小鼠精母細胞致畸試驗，受試動物小鼠隨機分為5 組，每組5 只。灌胃劑量同1.4.3，連續(xù)灌胃5 d，每天1 次。給藥結(jié)束后第14 天將小鼠處死，取附睪涂片，伊紅染色，觀察并計算精原細胞染色體畸變發(fā)生率。

1.4.5 30 d 喂養(yǎng)試驗

參照GB 15193.22—2014[16]，取SD 大鼠80 只，隨機分為4 組，即對照組（基礎(chǔ)飼料）和低、中、高劑量組[分別為1.72 g·（kg bw）-1、3.45 g·（kg bw）-1、6.90 g·（kg bw）-1]，每組20 只。低、中、高3 個劑量組分別按1.72%、3.45%、6.90%的比例添加樣品，周期為30 d。

試驗期間試驗動物自由飲水和攝食，記錄攝食量和體重增長情況，以及其他行為表現(xiàn)。給藥結(jié)束，采集大鼠血樣，進行血常規(guī)和生化指標(biāo)檢測。采血后頸椎脫臼處死試驗大鼠進行大體解剖，稱量各主要臟器質(zhì)量，計算相對重量（臟/體比值），同時進行組織病理切片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

由表1 可知，試驗小鼠以受試樣品進行單次大劑量（20.0 g·kg-1）灌胃后，2 周內(nèi)的體重增長未受影響，未出現(xiàn)死亡或中毒反應(yīng)等現(xiàn)象。試驗動物處死后，進行解剖檢查，各主要臟器均未發(fā)現(xiàn)病變。故氨糖軟骨素鈣片對試驗小鼠的最大耐受劑量大于20.0 g·（kg bw）-1，根據(jù)GB 15193.3—2014 中的分級標(biāo)準(zhǔn)，屬無毒級。

表1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗結(jié)果表

2.2 Ames 試驗

由表2 可知，對于4 株菌株，陽性對照組中回變菌落數(shù)均在自發(fā)回變組2 倍以上，呈現(xiàn)陽性結(jié)果；而受試樣不同劑量組（8～5 000 μg/皿）中，無論是否加S9 溶液，樣品給藥組回變菌落數(shù)均低于自發(fā)回變組的2 倍，未出現(xiàn)陽性結(jié)果。

表2 樣品Ames 試驗結(jié)果表（）

表2 樣品Ames 試驗結(jié)果表（）

2.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

由表3 可知，與對照相比，受試樣品給藥組微核率無顯著差異（P＞0.05），而陽性對照組（環(huán)磷酰胺）則出現(xiàn)了顯著升高的現(xiàn)象（P＜0.05）。同樣，與陰性對照相比，各組PCE/NCE比值也并無顯著差異。此結(jié)果表明，受試樣品組小鼠骨髓細胞的有絲分裂正常，染色體并未出現(xiàn)損傷，未出現(xiàn)異常毒性反應(yīng)。

表3 小鼠骨髓微核發(fā)生率表

2.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗

由表4 可知，與陰性對照相比，不同劑量受試樣品組的小鼠精原細胞染色體畸變發(fā)生率無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照（環(huán)磷酰胺）的畸變率與對照組相比，則出現(xiàn)了顯著升高的現(xiàn)象（P＜0.05）。該結(jié)果表明，受試樣品對于試驗雄鼠的精子無毒性作用，即未發(fā)現(xiàn)遺傳毒性。

表4 小鼠精原細胞染色體畸變發(fā)生率表

2.5 30 d 喂養(yǎng)試驗

2.5.1 受試樣品對大鼠攝食情況和體重的影響

由表5 可知，喂養(yǎng)期間，不同劑量受試樣品組雌、雄鼠的攝食量、體重增長量和食物利用率，與對照組相比，均沒有顯著性差異（P＞0.05）。受試樣品組大鼠的生長狀態(tài)無異常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，依據(jù)所記錄動物的行為表現(xiàn)和精神狀態(tài)，未出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng)。

表5 試驗大鼠總食物利用率表（）

表5 試驗大鼠總食物利用率表（）

2.5.2 樣品對大鼠血常規(guī)和生化指標(biāo)的影響

大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗結(jié)束時，不同劑量受試樣品組的雌、雄大鼠與對照組相比，血常規(guī)各項指標(biāo)（紅細胞、白細胞、淋巴細胞等）均無顯著性差異（P＞0.05），見表6。同樣，與對照組大鼠相比，不同劑量受試樣品組大鼠的生化指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐和血糖指標(biāo)等），也均無顯著性差異（P＞0.05），見表7。結(jié)果表明，氨糖軟骨素鈣片給藥后，試驗大鼠的血液學(xué)細胞計數(shù)、肝腎功能等體征均未出現(xiàn)異常，生化指標(biāo)上未表現(xiàn)出毒性反應(yīng)。

表6 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗?zāi)┢谘簩W(xué)檢查結(jié)果表（x-±s）

表7 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗?zāi)┢谏笜?biāo)檢查結(jié)果表（）

表7 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗?zāi)┢谏笜?biāo)檢查結(jié)果表（）

2.5.3 解剖及組織病理結(jié)果

30 d喂養(yǎng)結(jié)束后，對大鼠進行解剖，各主要臟器（肺部、心臟、脾臟、肝腎、生殖器官等）組織形態(tài)未出現(xiàn)肉眼可見的異常病態(tài)。高劑量組雌性大鼠和雄性大鼠的肝、脾、腎、胃、腸、睪丸（卵巢）均未見明顯與試驗因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化。綜上所述，以氨糖軟骨素鈣片為受試物進行的30 d 喂養(yǎng)試驗表明，喂養(yǎng)期間，試驗動物的生長情況未出現(xiàn)異常，機體狀態(tài)良好（攝食與增重、生化和血常規(guī)、主要臟器絕對和相對重量等）。組織病理檢查未發(fā)現(xiàn)明顯有關(guān)的異常改變，表明氨糖軟骨素鈣片無明顯毒副作用。

3 結(jié)論

人體試驗表明，氨基葡萄糖可有效治療膝骨關(guān)節(jié)炎，顯著降低患者的疼痛程度，且具有良好的安全性和耐受性[17]。硫酸軟骨素在國內(nèi)外也被用作治療骨關(guān)節(jié)炎的對癥藥物，其長期安全性臨床試驗中尚未報告任何明顯的副作用[18]。氨基葡萄糖與硫酸軟骨素聯(lián)用，可有效緩解骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛感，且具有良好的耐受性[19]。骨碎補總黃酮已作為一種藥品，被應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，對改善患者的骨密度具有一定的輔助治療作用，且具有良好的安全性[20]，尚未報道有嚴重的藥物不良反應(yīng)，僅少數(shù)病例報道了腸道不適等輕微副作用[21]。但此前尚無研究報道氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、骨碎補、CaCO3和CPP 復(fù)合物的安全性，本試驗首次研究了由此5 種功能原料，經(jīng)科學(xué)配比復(fù)配制備的復(fù)合物的安全性。研究結(jié)果表明，本受試物以20.0 g·kg-1劑量單次給小鼠灌胃后，未出現(xiàn)毒副作用表現(xiàn)，最大耐受劑量大于20.0 g·kg-1。根據(jù)GB 15193.3—2014 的分級標(biāo)準(zhǔn)，屬無毒級。Ames 試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗、精原細胞染色體畸變試驗均表明無致突變作用；30 d 喂養(yǎng)期間，試驗動物生長情況無異常，未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡現(xiàn)象，表明氨糖軟骨素鈣片具有長期食用安全性。本次毒理學(xué)試驗結(jié)果表明，氨糖軟骨素鈣片作為一款保健食品，具備良好的安全性。