王鑫媛，劉曉龍，李 成，郭曉玉，劉 京，李曉燕，馬 軍

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050000）

糖尿病是一種糖代謝障礙、血葡萄糖水平增高的代謝功能紊亂性疾病[1]。人體糖代謝調(diào)控的關(guān)鍵酶是α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（蔗糖酶、麥芽糖酶等）。α-淀粉酶廣泛分布于唾液及胰臟，能催化α-1,4 糖苷鍵水解，將淀粉分解為單糖、糊精等。α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀緣膜上皮細胞，能將雙糖水解成可被小腸吸收的單糖，如蔗糖、麥芽糖等。因此，抑制該酶活性能夠延緩碳水化合物的消化，減少葡萄糖吸收入血，進而抑制餐后高血糖，改善對血糖的控制[2-4]。研究表明，持續(xù)性高血糖會增加患者糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率，如果在糖尿病前期或早期開始控制血糖水平，可使糖尿病并發(fā)癥的風險有效降低[5]。

研究顯示，從天然植物中獲取的單一活性物質(zhì)具有顯著調(diào)控糖代謝關(guān)鍵酶活性的功效，能起到降低血糖的作用[6]。多種活性物質(zhì)聯(lián)合使用的功效比單獨使用更加顯著，聯(lián)合復配多種活性物質(zhì)較單一活性物質(zhì)具有多靶點、多種作用機制的優(yōu)勢，聯(lián)合復配產(chǎn)生的協(xié)同效應可以增強功能活性、減少劑量、延緩耐藥性發(fā)展和降低毒性，節(jié)省能源、降低成本[7]。白蕓豆提取物、L-阿拉伯糖、桑葉提取物有抑制特定酶活性，延緩淀粉、蔗糖、麥芽糖等碳水化合物的消化吸收，降低血糖值等作用[8-10]。但結(jié)合三者優(yōu)勢，將三者聯(lián)合復配調(diào)節(jié)血糖的研究還未見報道。

本試驗將白蕓豆提取物、L-阿拉伯糖、桑葉提取物三者組合，從多靶點協(xié)同抑制糖代謝中的關(guān)鍵酶角度出發(fā)，延緩碳水化合物水解。①白蕓豆提取物和L-阿拉伯糖可直接阻斷日常飲食中食用的淀粉及蔗糖的消化吸收。②淀粉水解會產(chǎn)生麥芽糖、寡糖等成分，具有明顯α-葡萄糖苷酶抑制活性的桑葉提取物可以抑制麥芽糖等二糖的進一步水解。三者共同作用，減少葡萄糖吸收入血，可延緩血糖驟然升高，達到調(diào)節(jié)血糖平穩(wěn)的效果。本文可為研究開發(fā)具有調(diào)節(jié)餐后血糖功能的食品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蕓豆提取物，美國Phase 2；L-阿拉伯糖，濟南圣泉唐和唐生物科技有限公司；桑葉提取物，博仲圣景醫(yī)藥技術(shù)（北京）有限公司；異麥芽酮糖醇，廣西常寶生物技術(shù)有限公司；植物粉（質(zhì)量比2 ∶2 ∶3 ∶2 ∶2 ∶1 的平利絞股藍、山楂、山藥、烏梅、桑葚及桑葉的混合物），石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；硬脂酸鎂（食品級），山東聊城阿華制藥股份有限公司；α-淀粉酶（豬胰腺，14 U·mg-1），上海源葉生物科技有限公司；可溶性淀粉（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；DNS 顯色液，飛凈生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（液體，7×105U·mL-1），北京索萊寶科技有限公司；無水碳酸鈉（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE Lambda 25 紫外可見分光光度計；賽多利斯224-1CN 電子天平；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋；新馬S60 旋轉(zhuǎn)壓片機；三諾血糖儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 α-淀粉酶抑制活性的測定

參考VEGA-LóPEZ 等[11]的方法測定α-淀粉酶的抑制活性。將250 μL 的樣品溶液與等體積的α-淀粉酶溶液（1.4 U·mL-1）充分混合均勻，37 ℃反應10 min，再向其中加入等體積的1%淀粉溶液，37 ℃下反應10 min，向反應體系中加入500 μL 的DNS 終止反應，沸水浴5 min 后快速冷卻至室溫，加入5 mL蒸餾水稀釋混合液，在540 nm 處測定吸光值，α-淀粉酶抑制率計算公式見式（1）。

式中：A0為樣品溶液、酶和淀粉混合液反應后的OD540；A1為緩沖液代替α-淀粉酶溶液反應后的OD540；A2為緩沖液代替樣品溶液反應后的OD540。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

根據(jù)YANG 等[12]的方法測定α-葡萄糖苷酶的抑制活性。將200 μL 樣品溶液與等體積的α-葡萄糖苷酶（7 000 U·mL-1）充分混合均勻，55 ℃反應15 min，再向其中加入等體積的2.5 mmol·L-1對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖溶液，55 ℃反應10 min，加入5 mL 的0.10 mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應，在400 nm 處測定吸光值，α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式見式（2）。

式中：A0為樣品溶液、酶和硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖溶液混合液反應后的OD400；A1為緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液反應后的OD400；A2為緩沖液代替樣品溶液反應后的OD400。

1.3.3 感官評價

由10 名有感官評價經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)人員組成評價小組，根據(jù)感官評定標準對產(chǎn)品打分，滿分100 分，其中外觀50 分、風味及口感50 分，感官評分最終結(jié)果以評分總和的平均值計。感官評分標準見表1。

表1 控糖片感官評分標準表

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

為突出白蕓豆提取物、L-阿拉伯糖以及桑葉提取物的功效，同時考慮控糖片的外觀及口感，本試驗以α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評價為指標，綜合考察白蕓豆提取物添加量、L-阿拉伯糖添加量以及桑葉提取物添加量對控糖片的影響。

（1）白蕓豆提取物添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。試驗按照白蕓豆提取物添加量10%、15%、20%、25%、30%，L-阿拉伯糖添加量10%，桑葉提取物添加量5%，剩余配方量用異麥芽酮糖醇補足，進行試驗，考察白蕓豆提取物添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。

（2）L-阿拉伯糖添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。試驗按照L-阿拉伯糖添加量6%、8%、10%、12%、14%，白蕓豆提取物添加量20%，桑葉提取物添加量5%，剩余配方量用異麥芽酮糖醇補足，進行試驗，考察L-阿拉伯糖添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。

（3）桑葉提取物對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。試驗按照桑葉提取物添加量1%、3%、5%、7%、9%，白蕓豆提取物添加量20%，L-阿拉伯糖添加量10%，剩余配方量用異麥芽酮糖醇補足，進行試驗，考察桑葉提取物添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響。

1.3.5 人體試食試驗

參考《食物血糖生成指數(shù)測定方法》（WS/T 652—2019）[13]進行試驗，設(shè)計2 次試驗，2 次試驗食用相同的食物，第1 次食用食物作為空白組，第2 次在進食前30 min 服用控糖片作為樣品組，2 次試驗之間間隔≥72 h。分別觀察空腹血樣（-5 min、0 min 取平均值）、餐后15 min、30 min、45 min、60 min、90 min 和120 min 血樣，記錄血糖值（mmol·L-1）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 進行數(shù)據(jù)處理，用正交設(shè)計助手IIV3.1進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 白蕓豆提取物添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響

由圖1 可知，隨著白蕓豆提取物添加量的增加，2 種酶的抑制率均呈上升趨勢，到達一定濃度時，抑制活性趨于平穩(wěn)，原因可能是白蕓豆提取物濃度到達一定量后，白蕓豆提取物與α-淀粉酶分子上的特異性部位結(jié)合，從而使酶抑制活性趨于平穩(wěn)。隨著白蕓豆特有的風味的呈現(xiàn)，感官評分增高。綜合3 個指標，選取白蕓豆提取物添加量20%、25%、30%進行正交試驗。

圖1 白蕓豆提取物添加量對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響圖

2.1.2 L-阿拉伯糖添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響

由圖2 可知，隨著L-阿拉伯糖添加量的增加，α-淀粉酶抑制率先上升后趨于平緩，α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趨勢，原因可能是L-阿拉伯糖對蔗糖酶有良好的選擇性，隨著添加量的增加，α-葡萄糖苷酶抑制活性增加。L-阿拉伯糖添加量對感官影響不明顯，當添加量為10%時，感官評分最高。綜合3 個指標，選取L-阿拉伯糖添加量8%、10%、12%進行正交試驗。

圖2 L-阿拉伯糖添加量對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響圖

2.1.3 桑葉提取物添加量對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響

由圖3 可知，隨桑葉提取物添加量的增加，α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趨勢，原因可能是提取物的增加使體系中羥基生物堿的濃度增加，從而對兩種酶的抑制活性增加。隨桑葉提取物添加量的增加，其特有的苦澀口感增強，感官評分呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。綜合3 個指標，選取桑葉提取物添加量 3%、5%、7%進行正交試驗。

圖3 桑葉提取物添加量對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分的影響圖

2.2 正交試驗

選取白蕓豆提取物添加量（A）、L-阿拉伯糖添加量（B）、桑葉提取物添加量（C）為考察因素，以α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率、感官評分為指標，選用L9(34)正交試驗設(shè)計表（表2），進行優(yōu)化試驗，以確定最佳配比。

表2 正交試驗設(shè)計因素水平表

控糖片的主要功效作用是對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用，感官品質(zhì)是食品的重要指標之一，因此本試驗在確保功效的基礎(chǔ)上，同時保證產(chǎn)品口感，利用綜合加權(quán)評分法確定最佳添加量，設(shè)定α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分三者的權(quán)重系數(shù)分別為35%、35%、30%。打分方法參考鐘凌云等[14]的方法，各項試驗指標按照權(quán)重相加得分即為綜合得分，如1 號總分為Y總=84.13/95.01×100×0.35+23.84/47.24×100×0.35+79.2×0.30=72.41，結(jié)果見表3、表4。

表3 α-淀粉酶抑制活性正交試驗結(jié)果表

表4 方差分析結(jié)果表

由表3 及表4 可知，A、B兩因素對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分影響不顯著，C因素對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），3 個因素對α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率和感官評分影響的主次順序為C＞B＞A，即桑葉提取物添加量＞L-阿拉伯糖添加量＞白蕓豆提取物添加量。由此得出的最佳配比為A3B2C3，即白蕓豆提取物添加量30%、L-阿拉伯糖添加量10%、桑葉提取物添加量7%。

根據(jù)優(yōu)選的A3B2C3的組合，進行3 次平行試驗，得到綜合得分98.43 分，α-淀粉酶抑制率91.13%，α-葡萄糖苷酶抑制率48.49%、感官評分96.47 分，綜合得分及感官評分均大于正交組合中最高分，工藝穩(wěn)定性較好。

2.3 人體試食試驗

按照上述配方壓片，經(jīng)人體試食，測定餐后2 h內(nèi)的血糖值變化。共招募受試者9 人，其中男4 人、女5 人，年齡27～40 歲，平均年齡33.67 歲，試驗結(jié)果（9 位受試者檢測結(jié)果平均值）見圖4。

圖4 餐后2 h 血糖應答曲線圖

由圖4 可見，樣品組的餐后血糖值低于空白組的餐后血糖值，樣品組較空白組的餐后2 h 血糖面積減小33%，說明食用控糖片有降低餐后血糖的作用。

3 結(jié)論與討論

本研究采用3 類不同調(diào)糖機理的天然植物來源的酶抑制劑白蕓豆提取物、L-阿拉伯糖、桑葉提取物開發(fā)一款綜合控糖片。白蕓豆提取物與淀粉酶分子上的特異性部位結(jié)合，使得酶分子構(gòu)象改變，抑制其活性，延緩部分淀粉的分解吸收[15]；L-阿拉伯糖對蔗糖酶-蔗糖復合物具有高親和力，形成具有低蔗糖酶活性的三重復合物，低蔗糖酶活性三重復合物的小腸吸收效率顯著降低，從而抑制部分蔗糖被小腸消化吸收[9]；桑葉提取物具有抑制小腸內(nèi)糖苷酶活性的功效，淀粉水解產(chǎn)生的麥芽糖、寡糖等二糖在小腸內(nèi)得不到糖苷酶的協(xié)助，抑制二糖的水解，從而降低了葡萄糖的小腸吸收[16]。三者從多靶點抑制參與糖代謝的關(guān)鍵酶α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活力角度出發(fā)，抑制日常攝入碳水化合物的消化吸收，從而減少葡萄糖的吸收，調(diào)節(jié)血糖水平。

經(jīng)試驗，得到三者最佳添加比例為白蕓豆提取物添加量30%、L-阿拉伯糖添加量10%、桑葉提取物添加量7%。人體試食試驗表明，食用該控糖片具有明顯降低餐后血糖的作用。該產(chǎn)品符合人們對健康的新需求，亦符合健康食品發(fā)展的新趨勢，具有良好的市場開發(fā)前景。