安 敏,王雪冬,裴愛月,王淑嫻,梁晨陽,付少杰,馬福哲*

(1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科,河北 唐山063000;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科,吉林 長春130021;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)鏡中心,吉林 長春130021;4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎病內(nèi)科,吉林 長春130021)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[1]。但是在目前的臨床實踐中,一直缺乏可靠的分子靶點用于DKD的早期診斷和有效治療[2]。機(jī)器學(xué)習(xí)策略是用于從一組方案中選擇最佳模型來擬合觀察結(jié)果的人工智能技術(shù),具有非線性、容錯性和實時性的優(yōu)點,因此適合于復(fù)雜場景的應(yīng)用[3]。近年來機(jī)器學(xué)習(xí)策略結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),在尋找新型疾病診斷標(biāo)志物方面展現(xiàn)出了巨大潛力[4]。微小RNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性非編碼RNA,通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)在DKD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5]。因此本研究旨在利用機(jī)器學(xué)習(xí)策略對公共數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,鑒定出新的DKD診斷標(biāo)志物,并預(yù)測調(diào)控該靶點的miRNA。之后利用多種分子生物學(xué)技術(shù)驗證上游miRNA對該靶點表達(dá)的調(diào)控情況,以及對DKD炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及纖維化的影響,以期探索出可用于DKD早期診斷和治療干預(yù)的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1公共數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/ geo/)中獲取含有健康對照以及DKD患者的腎小球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以GSE30528,GSE96804及GSE47185作為訓(xùn)練集,GSE99339及GSE30122作為驗證集。訓(xùn)練集和驗證集分別含有DKD患者64例和33例,對照組50例和61例。

1.1.2動物 6～8周齡的BTBR ob/ob小鼠(自發(fā)性2型DKD模型)40只,年齡匹配的BTBR野生型小鼠(BTBR WT)10只作為正常對照,均購于美國Jackson實驗室。

1.1.3主要試劑 ROS試劑盒、MDA試劑盒購于南京建成生物工程研究所;小鼠QuantiChromTM肌酐試劑盒、白蛋白試劑盒購于美國博世生物公司;小鼠血糖試劑盒、低密度脂蛋白試劑盒、尿素氮試劑盒購于杭州齊譽(yù)生物科技公司;SIRT1、VCAM-1、P53、Ac-P53、PAI-1、CTGF、TGF-β1、GAPDH一抗以及二抗購自美國Abcam公司;pGL質(zhì)粒載體購于美國Promega公司。

1.1.4細(xì)胞系及處理 SV40MES13小鼠腎小球系膜細(xì)胞系購自上海中喬新舟生物公司。為維持適宜的環(huán)境條件,細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)置為37℃,并保持5%的CO2濃度。培養(yǎng)基成分包括RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素。

1.2 方法

1.2.1機(jī)器學(xué)習(xí)及生物信息學(xué)分析 對各數(shù)據(jù)集進(jìn)行批次校正后合并,以矯正后的P值<0.05以及|log2差異倍數(shù)|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)鑒定出DKD的差異表達(dá)基因(DEGs)。分別使用最小絕對收縮和選擇算子(LASSO),隨機(jī)森林(RF)以及支持向量機(jī)遞歸特征消除(SVM-RFE)3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法針對訓(xùn)練集數(shù)據(jù)構(gòu)建診斷模型,將3種算法均納入的基因篩選為潛在生物標(biāo)志物。在訓(xùn)練集及驗證集中分別根據(jù)標(biāo)志物基因的表達(dá)量繪制了其接受者操作特征(ROC)曲線。

1.2.2雙熒光素酶報告系統(tǒng) 通過RNA預(yù)測數(shù)據(jù)庫RNAhybird(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)預(yù)測可以與鑒定出的標(biāo)志物mRNA 3’UTR區(qū)良好結(jié)合的目標(biāo)miRNA?；陬A(yù)測的結(jié)合位點合成包含目標(biāo)miRNA結(jié)合位點的靶基因短序列,并將其插入到pGL-控制載體的KpnⅠ和BgⅢ位點,構(gòu)建野生型質(zhì)粒,將SV40MES13細(xì)胞種在24孔板中,與野生型報告質(zhì)粒、熒光素腎素-胸苷激酶質(zhì)粒以及目標(biāo)miTNA,目標(biāo)miRNA抑制劑共同轉(zhuǎn)染24 h,使用Promega Dual熒光素酶報告檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性。

1.2.3動物分組及處理 小鼠分為正常對照組、DKD空白對照組、DKD轉(zhuǎn)染非同源miRNA對照組、DKD轉(zhuǎn)染目標(biāo)miRNA agomir組,DKD轉(zhuǎn)染目標(biāo)miRNA antagomir組,每組10只。按各自分組,分別給予陰性對照抑制劑、目標(biāo)miRNA agomir、目標(biāo)miRNA antagomir,2 mg/kg每周1次皮下注射,共干預(yù)24周。于第1、12、24周測血糖、血肌酐、低密度脂蛋白、尿蛋白肌酐比(UACR)以及24 h尿量。第24周小鼠安樂死,取腎組織進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2.4腎臟氧化應(yīng)激分析 對第24周取材小鼠的腎臟皮質(zhì)組織,采用檢測試劑盒測定其中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平。

1.2.5RNA的提取與檢測 應(yīng)用TRizol試劑提取腎組織中總RNA,使用qRT-PCR方法檢測miRNA以及mRNA的表達(dá),基因表達(dá)量被適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化為 U6或GAPDH,使用2-△△ct法對基因的表達(dá)水平進(jìn)行量化。miR-138-5p正向引物序列:5′-GGGAGCTGGTGTTGTGAAT-3′,反向引物序列:5′-CAGTGAGTGTCGTGGAGT-3′;SIRT1 mRNA正向引物序列:5′-GTCACACTTACGACAGAGCAGC-3′,反向引物序列:5′-TTTCTCCAGTACATACACAAC-3′;GAPDH mRNA正向引物序列:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′,反向引物序列:5′-TCTAGACGGC AGGTCAGGTCCACC-3′;U6正向引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6蛋白表達(dá)測定 應(yīng)用蛋白印跡法測定腎組織中蛋白的表達(dá)。使用含蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液對總蛋白進(jìn)行提取,并使用BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量。采用常規(guī)Westernblot方法,用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,再使用5%脫脂奶粉封閉15 min后于4℃下用一抗孵育過夜,次日用TBS-T將PVDF膜清洗3次,常溫下與二抗孵育1 h,再用TBS-T洗膜3次,用ECL顯影液顯影。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析 由SPSS 25.0分析所收集數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用t檢驗比較兩組間差異,One Way ANOVA檢驗用于多重對比,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于機(jī)器學(xué)習(xí)策略鑒定DKD新型診斷標(biāo)志物

在訓(xùn)練集數(shù)據(jù)中鑒定出100個DEGS,其中62個在DKD中低表達(dá),38個高表達(dá),見圖1A。使用LASSO、RF以及SVM-RFE機(jī)器學(xué)習(xí)算法分別構(gòu)建診斷模型,取交集后鑒定出DKD的潛在診斷標(biāo)志物為SIRT1,見圖1B～E。根據(jù)SIRT1在訓(xùn)練集和驗證集中的表達(dá)量分別繪制ROC曲線,AUC分別為0.950和0.885,提示SIRT1對DKD具有良好的診斷效能,見圖1F～G。

圖1 基于機(jī)器學(xué)習(xí)策略鑒定DKD新型診斷標(biāo)志物

2.2 鑒定調(diào)控SIRT1表達(dá)的miRNA

RNAhybird數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)SIRT1 mRNA 3’-UTR中的堿基序列為miR-138-5p提供了結(jié)合位點,見圖2A。在2型DKD組和對照組中,qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在2型DKD組高表達(dá)(P<0.01,圖2B),而SIRT1 mRNA在DKD組低表達(dá)(P<0.05,圖2C)。Westernblot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)SIRT1在DKD組低表達(dá)(P<0.05,圖2D和2E),提示miR-138-5p可能調(diào)控SIRT1的表達(dá)。進(jìn)一步的雙熒光素酶實驗結(jié)果提示,在SV40MES13細(xì)胞中,相較于對照組,miR-138-5p能顯著降低SIRT1 mRNA 3’UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01,圖2F),提示miR-138-5p可直接與SIRT1 mRNA 3’UTR結(jié)合。

2.3 調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-138-5p水平在BTBR ob/ob組及BTBR ob/ob+NC組均顯著高于正常對照組(P<0.01),在BTBR ob/ob+agomir組水平顯著高于BTBR ob/ob組(P<0.01),而在BTBR ob/ob+antagomir組水平顯著低于BTBR ob/ob組(P<0.01),見圖3A,而Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎組織SIRT1表達(dá)水平在BTBR ob/ob組及BTBR ob/ob+NC組均低于正常對照組(P<0.05),在BTBR ob/ob+agomir組表達(dá)水平顯著低于BTBR ob/ob組(P<0.01),而在BTBR ob/ob+antagomir組表達(dá)水平高于BTBR ob/ob組(P<0.05),見圖4A,提示miR-138-5p高表達(dá)及低表達(dá)動物模型造模成功,且miR-138-5p可負(fù)向調(diào)控SIRT1的表達(dá)。miR-138-5p高表達(dá)加重了2型DKD小鼠的多尿、高血糖、高脂血癥、高尿素氮以及蛋白尿癥狀,相應(yīng)的miR-138-5p低表達(dá)則減輕了2型DKD小鼠的上述癥狀,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3B-F,提示調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害。

圖3 調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD腎損害

2.4 調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激

為進(jìn)一步探究調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑對DKD炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激的影響,檢測了PAI-1、VCAM-1、TGF-β1、CTGF、ROS以及MDA在腎組織的表達(dá)情況。相較于正常對照組,這些指標(biāo)在2型DKD小鼠腎組織中均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),相較于2型DKD小鼠,這些指標(biāo)在miR-138-5p高表達(dá)模型組中均升高,在miR-138-5p低表達(dá)模型組中均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4,提示調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激。

圖4 調(diào)控miR-138-5p/SIRT1途徑可減輕DKD炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激

3 討論

DKD是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一,不僅是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因,而且顯著增加罹患心腦血管疾病的風(fēng)險,導(dǎo)致高致死率、高致殘率[6]。DKD目前尚缺乏特異性治療手段,早期診斷和及時干預(yù)可以改善DKD患者的預(yù)后[7]。DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且目前尚不完全清楚,深入研究其發(fā)病機(jī)制,尋找有助于早期診斷以及治療干預(yù)的靶點具有重要意義[8]。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)策略,鑒定出SIRT1為DKD的潛在診斷標(biāo)志物。SIRT1是組蛋白去乙?；讣易宓某蓡T之一,以NAD+依賴的方式使P53蛋白去乙?；?從而抑制P53的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動和機(jī)體穩(wěn)態(tài)[9]。P53是抑癌基因TP53的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物,是重要的抗腫瘤因子[10]。先前的研究已經(jīng)證實,P53在DKD中存在著過度活化,并且與DKD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。逆轉(zhuǎn)DKD腎組織中SIRT1的低表達(dá),可以抑制P53的過度活化,進(jìn)而改善DKD腎組織的病理變化[12]。miRNAs對包括DKD在內(nèi)的許多疾病中的多種生物學(xué)過程起著重要的調(diào)控作用[13-14]。而本研究則發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可以識別和結(jié)合SIRT1,從而負(fù)向調(diào)控其表達(dá),通過抑制miR-138-5p,即可逆轉(zhuǎn)DKD腎組織中SIRT1的低表達(dá),進(jìn)而抑制P53的表達(dá)和活性,減輕DKD腎組織的炎癥反應(yīng)、纖維化及氧化應(yīng)激等機(jī)制,改善DKD的腎臟損害。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了miR-138-5p/SIRT1途徑在DKD發(fā)生發(fā)展中的重要作用,為DKD的早期診斷及治療干預(yù)提供了新的靶點和思路。