單關(guān)月,萬 慧,張雨欣,史云鵬,李海軍*

(1.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤免疫實驗室,吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 肝膽胰外科,吉林 長春130033)

銅(Cu)是人體必須的微量元素,在線粒體呼吸、抗氧化防御和生物復合物合成等多種細胞生命過程中發(fā)揮重要輔助功能[1]。然而,生理條件下細胞內(nèi)Cu濃度較低,Cu濃度小幅度升高可能引起細胞毒性,甚至導致細胞死亡[2]。細胞內(nèi)銅的攝取、分布和消除等過程受到機體嚴格調(diào)控。基因突變導致Cu過量累積與多種致命性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此,充分理解細胞內(nèi)Cu積累和代謝機制對于疾病的治療至關(guān)重要[3]。銅死亡是一種由Cu2+過度蓄積引發(fā)的細胞調(diào)控性死亡方式,不同于細胞凋亡、鐵死亡和壞死[4]。銅死亡發(fā)生的過程如下:細胞內(nèi)的Cu2+靶向結(jié)合三羧酸循環(huán)中的脂?；煞?銅結(jié)合脂?；煞志奂?鐵硫蛋白簇繼發(fā)性下降-蛋白毒性應(yīng)激并最終導致細胞死亡。

肝臟是人體腹腔內(nèi)最大的消化器官,承載著機體消化、代謝、解毒和免疫等重要生理功能[5]。肝臟疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化、肝硬化和肝癌。氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡、免疫異常、代謝異常、基因突變等是其主要致病因素[6]。銅死亡相關(guān)研究逐漸成為熱點,通過干預細胞銅死亡治療肝臟疾病具有廣闊前景。本文將圍繞銅代謝和銅死亡相關(guān)信號通路,以及銅死亡介導的肝臟疾病發(fā)病機制展開綜述,以期為銅死亡相關(guān)肝臟疾病的治療提供新思路。

1 銅死亡

Cu是機體必須的微量元素,多種研究表明Cu對于維持機體多種生命活動代謝酶的活性具有重要意義[7]。因此機體內(nèi)Cu濃度必須維持在相對狹窄范圍內(nèi),才能保證機體正常的生理功能。細胞發(fā)生銅死亡的前提條件是細胞蓄積銅過量而未能有效代謝,因此本部分將從機體和細胞對Cu的代謝功能展開討論。

1.1 機體內(nèi)銅代謝

食物來源的Cu主要通過小腸和十二指腸吸收,小腸上皮細胞頂端的銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1(CTR1)調(diào)控Cu吸收[8]。Cu被胃腸道吸收后,被分泌到血液中,并與可溶性白蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、組氨酸和巨球蛋白等結(jié)合成復合體,而后流經(jīng)肝臟后通過CTR1被肝臟吸收[7]。在肝細胞質(zhì)中,Cu可以被螯合到其它蛋白質(zhì)中發(fā)揮酶活性,或經(jīng)金屬硫蛋白螯合后儲存于肝細胞內(nèi)[9]。銅ATP酶是一種離子泵,可以將肝臟內(nèi)的Cu重新釋放到血液中,繼而結(jié)合伴侶蛋白或到達其它組織器官而發(fā)揮后續(xù)生理功能,包括線粒體能量、酪氨酸和神經(jīng)遞質(zhì)代謝,氧化還原穩(wěn)態(tài)和細胞外基質(zhì)重塑[10]。

Cu進入機體后首先在肝臟內(nèi)儲存,過量的銅經(jīng)膽汁途徑最終通過糞便排出體外[11]。尿液、汗液和月經(jīng)等其它途徑能代謝少量銅?？傊?機體內(nèi)Cu主要通過十二指腸吸收,并通過膽汁排泄。當機體攝入Cu增加時,Cu吸收就會相應(yīng)減少,而排泄增多;相反,當機體攝入Cu減少時,通過膽汁排泄Cu減少,銅Cu吸收增加,以此維持機體銅穩(wěn)態(tài)[12]。

1.2 細胞內(nèi)銅代謝的調(diào)控機制

為維持細胞水平上Cu穩(wěn)態(tài),細胞內(nèi)復雜的Cu調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與其中,包括銅酶、銅伴侶蛋白和細胞膜銅運輸載體和通道。這些機制協(xié)同工作,共同調(diào)控細胞內(nèi)Cu的攝取、排出和細胞內(nèi)利用,以維持細胞內(nèi)Cu濃度在安全的生理水平。細胞通過表面表達銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1(CTR1)攝取Cu進入細胞[13]。體外研究表明CTR1的表達受Cu濃度調(diào)控,當細胞外Cu濃度過量時,CTR1表達下降;相反,細胞外Cu濃度下降時,CTR1表達上調(diào)[14]。

在細胞質(zhì)內(nèi),Cu的運輸由高親和力銅伴侶蛋白酶精細調(diào)控。銅伴侶蛋白ATOX1負責將Cu轉(zhuǎn)運給高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的ATP7A和ATP7B蛋白,進行賴氨酰氧化酶、酪氨酸酶和銅藍蛋白等銅酶的合成[15]。在小鼠胚胎成纖維細胞中,ATOX1作為銅依賴性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)因子,有助于細胞增殖[16]。Cu可以通過調(diào)節(jié)SOD1的表達而維持線粒體過氧化穩(wěn)態(tài)。除此之外,細胞色素氧化酶(COX)利用銅進行氧化磷酸化和穩(wěn)定線粒體功能[17]。銅ATP酶ATP7A/B是細胞內(nèi)銅運輸?shù)闹匾d體。在生理條件下,ATP7A/B表達于反式高爾基復合體內(nèi),負責將胞漿中的Cu轉(zhuǎn)運到高爾基體管腔內(nèi)。而當細胞內(nèi)Cu濃度升高時,ATP7A/B能夠轉(zhuǎn)位到細胞膜囊泡上,負責將Cu轉(zhuǎn)運出細胞[18]。

1.3 銅死亡機制研究

關(guān)于銅代謝與細胞程序性死亡的研究由來已久。1980年以來,研究表明Cu與細胞程序性死亡有關(guān),但是具體機制未闡明[19]。銅離子載體是一種可逆性結(jié)合銅離子的脂溶性分子,在細胞銅死亡中發(fā)揮重要作用。銅離子載體可以運輸銅離子穿過細胞的質(zhì)膜或線粒體膜結(jié)構(gòu)[20]。因此,細胞膜或線粒體膜表面銅離子載體表達異常會導致細胞內(nèi)銅濃度異常而誘導細胞銅死亡。

線粒體發(fā)生氧化還原反應(yīng)時產(chǎn)生的ROS與線粒體代謝和Cu誘導的細胞程序性死亡密切相關(guān)[21]。伊利司莫(ES)是公認的銅死亡誘導劑,有研究觀察到ES誘導的細胞死亡中線粒體功能紊亂,ROS水平顯著升高。ES轉(zhuǎn)運黑色素瘤細胞內(nèi)Cu并導致線粒體相關(guān)蛋白水平降低,從而導致ROS升高而抑制腫瘤細胞增殖。銅離子通過ES轉(zhuǎn)運進入K562細胞后,能夠氧化抗壞血酸并與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生更具破壞性的ROS,誘導細胞程序性死亡[22]。由此可見,線粒體功能紊亂產(chǎn)生過量ROS,也是細胞發(fā)生銅死亡的重要機制。

Cu可以直接與NPL4相互作用后抑制p97蛋白泛素化蛋白降解,引起p97蛋白聚集或與其直接結(jié)合并抑制其構(gòu)象轉(zhuǎn)變,最終導致細胞程序性死亡[23]。過去研究都將Cu相關(guān)的程序性死亡過程認為是細胞凋亡、自噬和鐵死亡的中間過程,并通過細胞活力實驗、免疫印跡實驗、流式細胞術(shù)和免疫熒光等實驗加以證明。直到2022年3月,TSVETKOV等發(fā)現(xiàn)細胞凋亡、壞死、ROS誘導的細胞死亡或鐵死亡的抑制劑都不能逆轉(zhuǎn)Cu誘導的細胞死亡,而只有銅螯合劑能實現(xiàn)這一目的,同時胱天蛋白酶-3(Caspase3)的活性沒有變化[1]。目前針對銅死亡的研究及其與疾病發(fā)生的關(guān)系將逐漸成為研究熱點。

2 肝臟疾病與銅死亡

無論Cu缺乏還是過量富集都會對機體帶來危害[24]。研究表明,門克斯病(Menkes)、威爾遜病(Wilson)、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和腫瘤與銅死亡通路密切相關(guān)[25]。肝臟是人體腹腔內(nèi)最大的消化器官,承載著機體消化、代謝、解毒和免疫等重要生理功能。肝臟也是銅吸收和代謝的重要器官,了解銅死亡與肝臟疾病的關(guān)系對于闡明銅死亡的機制和肝病的治療非常重要。

2.1 肝癌與銅死亡

肝癌的發(fā)生率和死亡率非常高。鐵死亡誘導劑索拉非尼和埃拉斯汀可以通過增加銅依賴性硫?；鞍拙奂鸶伟┘毎l(fā)生銅死亡[26]。索拉非尼和埃拉斯汀通過抑制線粒體基質(zhì)相關(guān)蛋白酶介導的鐵氧還蛋白-1(FDX1)上調(diào)蛋白脂質(zhì)化降解,并通過抑制胱氨酸減少細胞內(nèi)銅螯合劑谷胱甘肽(GSH)的合成[27]。鐵氧還原蛋白1(FDX1)是最重要的銅死亡調(diào)節(jié)因子。肝癌患者FDX1的表達顯著下調(diào),同時FDX1高表達與肝癌患者的生存率明顯正相關(guān)[28]。臨床回顧性分析顯示,銅死亡相關(guān)基因的表達與患者PD-1/PD-L1免疫檢查點分子的表達水平和患者愈后明顯正相關(guān)。說明銅死亡基因的表達可以作為肝癌免疫治療評價的生物標志物[29]。

2.2 肝豆狀核變性(Wilson)與銅死亡

肝豆狀核變性由Wilson在1912年首先描述,故又稱為Wilson病(WD)。WD是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病,以銅代謝障礙引起的肝硬化、基底節(jié)損害為主要臨床特征[30]。ATP7B基因突變導致的銅代謝異常是Wilson病重要發(fā)病機制。健康者肝內(nèi)Cu濃度通常低于55 μg/g組織干重;而Wilson病患者肝內(nèi)Cu濃度高于55 μg/g組織干重[31]。Cu中毒引起的DNA損傷、肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化和線粒體功能障礙是Wilson病的主要致病機制[32]。線粒體間質(zhì)變寬、內(nèi)膜和外膜分離并擴大、出現(xiàn)大液泡等肝臟形態(tài)學變化通常發(fā)生在WD早期階段,是WD肝損傷的形態(tài)學標志[31]。WD患者的肝臟癥狀為急性肝功能衰竭、血清轉(zhuǎn)氨酶水平持續(xù)升高、黃疸和慢性肝炎。然而,有些患者沒有表現(xiàn)出這些肝臟變化,而是出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。肝臟Cu過量積聚可能導致肝硬化的發(fā)生[33]。

2.3 非酒精性脂肪性肝病與銅死亡

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界范圍內(nèi)最常見的肝臟疾病,發(fā)病機制仍未闡明。銅死亡作為一種新型細胞程序性死亡模式,與NAFLD之間的關(guān)系有待研究。鐵氧化還原蛋白-1(FDX1)、硫?；厦?LIAS)、脂肪酰轉(zhuǎn)移酶-1(LIPT1)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD)、S-乙酰轉(zhuǎn)移酶二氫硫酰胺(DLAT)、丙酮酸脫氫酶E-1α(PDHA1)和丙酮酸脫氫酶E-1β(PDHB)是銅死亡相關(guān)基因。臨床回顧性分析和NAFLD小鼠模型顯示,DLD和PDHB兩種基因在NAFLD肝臟病變中顯著升高。DLD和PDHB可以作為NAFLD診斷和治療的生物標志物[34]。血清銅濃度與體重指數(shù)(BMI)、瘦素和胰島素抵抗水平等NAFLD的危險因素明顯正相關(guān)[35]。肝細胞特異性敲除ATP7基因后,小鼠肝臟銅濃度顯著升高,同時導致小鼠肥胖和肝脂肪變性[36]。

2.4 病毒性肝炎與銅死亡

病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病。中國以乙型肝炎病毒(HBV)感染居多,而西方國家以丙型肝炎(HCV)感染為主。病毒性肝炎如果不加以干預會發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌[37]。已有研究表明,鐵死亡在病毒性肝炎發(fā)展為肝纖維化過程中發(fā)揮重要功能。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)通過抑制鐵死亡過程而減少HSC細胞死亡[38]。新型冠狀病毒(COVID-19)與銅死亡的研究顯示:新冠肺炎患者外周血淋巴細胞中銅濃度遠高于健康對照組,新冠肺炎患者體內(nèi)PDHA1和PDHB兩種重要的銅死亡基因顯著上調(diào)[39]。由此可見,雖然目前還沒有關(guān)于病毒性肝炎與銅死亡的相關(guān)研究,但是未來基于細胞銅死亡通路研究HBV或HCV的致病機制及其干預手段具有一定空間。

3 總結(jié)與展望

Cu是人體必須的微量元素,然而Cu過量又能導致機體嚴重的損傷。銅死亡是最新被發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式,主要受細胞內(nèi)線粒體脂?；刚{(diào)節(jié)。與細胞鐵死亡相似,線粒體ROS和GPX4可以調(diào)節(jié)細胞銅死亡過程[40]。然而,銅死亡過程未發(fā)生線粒體收縮、膜密度增加等形態(tài)學變化。鑒于銅死亡過程能夠影響細胞鐵代謝,未來研究需要關(guān)注銅死亡過程中細胞或線粒體的特異性形態(tài)學改變,以便于理解兩種細胞死亡方式的區(qū)別和聯(lián)系。

門克斯病、威爾遜病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和腫瘤與銅死亡通路密切相關(guān)[25]。肝臟銅吸收和代謝的重要器官,了解銅死亡與肝臟疾病的關(guān)系對于闡明銅死亡的機制和肝病的干預非常重要。目前銅死亡在肝癌和威爾遜病領(lǐng)域的研究較多,包括機制研究和臨床回顧性分析。DLD和PDHB兩種銅死亡相關(guān)基因在NAFLD肝臟病變中顯著升高。病毒性肝炎,尤其是乙型肝炎在中國發(fā)病率非常高,肝纖維化是肝炎病毒感染后期最典型的終末期肝病,至今沒有有效治療手段。未來病毒性肝炎和肝纖維化中銅死亡的機制研究將成為熱點,并可能對此研發(fā)出新的診斷和治療方法。