苑寶文 魏玲 李籌忠

(1貴州省骨科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550000;2畢節(jié)市第一人民醫(yī)院針灸科;3貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科)

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染引起的急性皰疹性皮膚病,部分患者皰疹消退后局部皮膚仍遺留神經(jīng)痛,即為帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)。PHN主要表現(xiàn)為局部皮膚灼熱、敏感、針刺樣疼痛及麻木。疼痛劇烈且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量〔1〕。張愛(ài)民等〔2〕研究表明PHN的維持可能與脊髓自噬過(guò)度激活有關(guān)。劉永達(dá)等〔3〕也發(fā)現(xiàn)自噬活性的改變可能參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生。章軍等〔4〕發(fā)現(xiàn)針刀微創(chuàng)治療組可以有效緩解患者疼痛,其治療效果高于毫針圍刺組。于云等〔5〕通過(guò)觀察30例接受華佗夾脊穴針刺法與30例接受針刀阻滯松解法治療PHN患者的臨床療效,發(fā)現(xiàn)針刀阻滯松解法對(duì)患者疼痛、焦慮、睡眠質(zhì)量等方面的改善優(yōu)于華佗夾脊穴針刺法。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mNGF)具有促進(jìn)突起生長(zhǎng)、神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)的功能,研究顯示mNGF聯(lián)合普瑞巴林、奧卡西平、紅光均具有很好的治療效果,但會(huì)產(chǎn)生頭暈、嗜睡、過(guò)敏等不良反應(yīng)〔6～8〕。而針刀微創(chuàng)聯(lián)合mNGF夾脊穴位注射在治療PHN中是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性發(fā)揮治療功效尚未報(bào)道。本研究觀察針刀微創(chuàng)聯(lián)合mNGF夾脊穴位注射治療對(duì)PHN模型大鼠的影響,探討脊髓背角自噬改變?cè)谄渲械目赡茏饔谩?/p>

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100只體質(zhì)量為200～240 g的SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自中生北動(dòng)(北京)科技發(fā)展有限公司〔SYXK(京)2020-0051〕。飼養(yǎng)環(huán)境為22～25 ℃、濕度50%～60%、周期光照12 h、自由飲水、進(jìn)食。1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑和儀器 mNGF(廈門北大之路生物有限公司);非洲綠猴腎母纖維細(xì)胞(CV-1,美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù));白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物有限公司);免疫組化試劑盒(上海齊一生物科技有限公司);TUNEL染色試劑盒(安徽佰歐晶醫(yī)學(xué)科技有限公司);酵母自噬相關(guān)基因6的哺乳動(dòng)物同源體(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC3)-Ⅱ、自噬調(diào)控多功能蛋白(p62)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化核糖體40 S小亞基S6蛋白激酶(P-S6K)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(武漢博歐特生物科技有限公司);NX-1R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(天津鼎昊源生物科技有限公司);蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);透射電鏡(日本JEOL公司)。

1.3動(dòng)物分組與造模 分組:100只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、mNGF肌肉注射(肌肉注射)組、mNGF夾脊穴位注射(穴位注射)組、針刀微創(chuàng)聯(lián)合mNGF夾脊穴位注射(針刀聯(lián)合)組。模型制作:VZV感染CV-1細(xì)胞,培養(yǎng)2 d后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并制成細(xì)胞懸液,進(jìn)行帶狀皰疹病毒接種;腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠,將50 μl細(xì)胞密度為1.2×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種至大鼠左趾蹼中,對(duì)照組注射等量生理鹽水;接種3～4 d后,測(cè)定造模大鼠機(jī)械縮足閾值(MWT)降低表明造模成功。干預(yù):肌肉注射組給予肌肉注射mNGF〔2.1 μg/(kg·d)〕,1次/d,共14 d;穴位注射組給予夾脊穴位注射mNGF〔2.1 μg/(kg·d)〕,1次/d,共14 d;針刀聯(lián)合組在穴位注射組基礎(chǔ)上進(jìn)行針刀治療,1次/w,共2 w(操作方法:大鼠常規(guī)消毒、切點(diǎn)皮下淺筋膜下浸潤(rùn)麻醉,戴無(wú)菌手套,于脊柱或神經(jīng)敏感點(diǎn)垂直進(jìn)針刀,刺破皮膚,針刀與皮膚平行,行橫向扇形切割,松解粘連帶,退出針刀,無(wú)菌紗布按壓3 min);對(duì)照組、模型組不做處理。

1.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠MWT 采用電子測(cè)痛儀測(cè)定干預(yù)后1、7和14 d時(shí)機(jī)械痛閾值。用探頭垂直刺激大鼠后足底部,逐漸增加力度,待其出現(xiàn)舔足、抬足和躲避等行為時(shí),記錄電子測(cè)痛儀顯示最大值。每隔10 min檢測(cè)1次,連續(xù)檢測(cè)5次。

1.5收集標(biāo)本 MWT檢測(cè)結(jié)束后,將大鼠斷頭處死,取L4～L6脊髓組織,部分加入9倍生理鹽水制成勻漿,1 000 r/min離心10 min后,收集上清液,置于液氮保存?zhèn)溆?部分以4%多聚甲醛固定;部分置于-80 ℃冰箱中保存;部分胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液。

1.6ELISA檢測(cè)脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取凍存的脊髓組織上清液,按照ELISA操作說(shuō)明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)溶液,加入抗體和顯色劑,在酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7TUNEL染色檢測(cè)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡 4%多聚甲醛固定脊髓組織,制成石蠟切片。經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明、中性膠封片等,于顯微鏡(×400)下觀察,使用ImageJ圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8免疫組化染色檢測(cè)脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62表達(dá)水平 取脊髓組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、高壓抗原修復(fù)后分別滴加Beclin1、LC3-Ⅱ、P62一抗(1∶200)孵育過(guò)夜,加入二抗(1∶500)孵育20 min,DAB顯色液顯色,蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水、透明、封片,于顯微鏡(×200)下鏡檢。

1.9透射電鏡觀察脊髓組織自噬泡形成 取L4～L6脊髓組織,胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液,接種于6孔板上培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,加入4%戊二醛,4 ℃固定1 h,常規(guī)電鏡固定、脫水、包埋,制成超薄切片,于透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬泡和亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.10Western印跡檢測(cè)脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取脊髓組織,加入適量裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量后制樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h,分別加入Beclin1、LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3一抗(1:500)4 ℃過(guò)夜。加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,避光加入ECL發(fā)光液,Bio-rad凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照,以β-actin作為對(duì)照,對(duì)各組蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)PWT比較 與對(duì)照組相比,模型組給藥后相同時(shí)間PWT明顯降低(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組給藥后7 d和14 d時(shí)PWT明顯升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)PWT的比較

2.2各組脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與對(duì)照組相比,模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加(均P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.3各組脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較 與對(duì)照組〔(3.17±0.59)%〕相比,模型組細(xì)胞凋亡水平〔(34.28±3.85)%〕明顯升高(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組細(xì)胞凋亡水平明顯降低〔(22.69±2.43)%、(16.81±1.38)%、(11.76±1.54)%,P<0.05〕;針刀聯(lián)合組抗凋亡效果最佳(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.4免疫組化染色檢測(cè)各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá) Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色。對(duì)照組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62少量表達(dá);與對(duì)照組相比,模型組Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯減少,P62表達(dá)明顯增多(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯增多,P62表達(dá)水平明顯減少(P<0.05);針刀聯(lián)合組各蛋白變化量最明顯。見表3、圖2。

圖2 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)

表3 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)水平

2.5各組脊髓組織自噬泡的形成比較 對(duì)照組細(xì)胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在極少自噬泡;模型組存在少量自噬泡;與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組自噬泡數(shù)量明顯增加;針刀聯(lián)合組自噬泡數(shù)量多于其他組。見圖3。

圖3 各組脊髓組織自噬泡的形成(×8 000)

2.6各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3蛋白水平比較 與對(duì)照組相比,模型組Beclin1、LC3-Ⅱ、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3水平明顯升高,P62水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯(lián)合組Beclin1、LC3-Ⅱ水平明顯升高,P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3水平明顯降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3表達(dá)

表4 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

mNGF可以修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞,促進(jìn)神經(jīng)形成,并且有效改善疼痛癥狀,廣泛用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。如周禮志等〔9〕發(fā)現(xiàn)mNGF可有效著緩解PHN患者疼痛、縮短治療時(shí)間,其效果強(qiáng)于腺苷鈷胺。夾脊穴位注射可以使多種感受器興奮,產(chǎn)生具有明顯抑制疼痛的電位,達(dá)到活血止痛的作用。黃彬〔10〕發(fā)現(xiàn)電針結(jié)合穴位注射mNGF治療Ramsay Hunt綜合征的療效高于電針組,明顯降低后遺神經(jīng)痛的發(fā)生率。部分患者在帶狀皰疹急性發(fā)作期后,易造成皮下粘連,粘連組織會(huì)壓迫周圍神經(jīng),影響受損神經(jīng)恢復(fù)。針刀治療可以松解局部粘連組織,減輕病變組織壓力,促進(jìn)炎癥消退,達(dá)到消炎鎮(zhèn)痛、祛除麻木、恢復(fù)功能的作用。郭慧等〔11〕發(fā)現(xiàn)穴位注射聯(lián)合小針刀可有效減輕PNH患者的疼痛,具有較高的治療效果。本研究說(shuō)明,針刀微創(chuàng)聯(lián)合夾脊穴位注射射mNGF能有效減輕PHN疼痛。

在正常狀態(tài)下,神經(jīng)系統(tǒng)自噬水平較低,在病理刺激下,自噬狀態(tài)會(huì)被激活,從而啟動(dòng)應(yīng)激防御,促進(jìn)神經(jīng)元的生存。自噬涉及多種信號(hào)通路,其中mTOR信號(hào)通路在突觸可塑性的形成和維持中起關(guān)鍵作用,并且可以抑制自噬。Beclin1是自噬泡形成的特異性基因,與自噬啟動(dòng)有關(guān)。LC3蛋白是酵母自噬基因Atg8的同系物,是最常用的自噬蛋白標(biāo)志物,LC3-Ⅱ定位在自噬體膜上,其含量與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)。p62作為一種特異的泛素結(jié)合蛋白,可與LC3選擇性結(jié)合形成自噬溶酶體被降解,p62增多表明自噬受到抑制。陳雪玲等〔12〕發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過(guò)降低mTOR、下游效應(yīng)分子p70S6K1和4EBP1的表達(dá)水平,激活自噬信號(hào)蛋白的表達(dá),抑制弗氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠炎性疼痛。Feng等〔13〕發(fā)現(xiàn)辛二酰苯胺異羥肟酸可減輕神經(jīng)性疼痛,并通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞的自噬通量。呂丹等〔14〕發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理能抑制mTOR信號(hào)通路,增加LC3Ⅱ、Beclin-1水平,降低p62水平,從而增強(qiáng)脊髓背角細(xì)胞的自噬功能,最終產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛的作用。本研究說(shuō)明,針刀微創(chuàng)聯(lián)合夾脊穴位注射射mNGF通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)PHN大鼠脊髓背角自噬水平。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是疼痛發(fā)生的重要機(jī)制,增強(qiáng)自噬能抑制神經(jīng)元凋亡,而抑制自噬則會(huì)增加凋亡〔15〕。陳云婷等〔16〕發(fā)現(xiàn),PHN小鼠脊髓組織中Caspase-3表達(dá)升高,神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多。Chou等〔17〕發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以降低IL-6、IL-1β、Beclin1、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)量,減輕由慢性縮窄性損傷誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)損傷引起的細(xì)胞凋亡和自噬。本研究說(shuō)明,針刀聯(lián)合組通過(guò)增強(qiáng)PHN大鼠脊髓背角自噬水平抑制細(xì)胞凋亡,與上述研究結(jié)果一致。

PHN患者血清中IL-1β、IL-6和TNF-α過(guò)度表達(dá),而高水平的IL-1β、IL-6和TNF-α可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷,引起疼痛〔18〕。徐俊濤等〔19〕發(fā)現(xiàn),PHN模型大鼠脊髓中IL-1β和TNF-α水平明顯升高。馬洪濤等〔20〕發(fā)現(xiàn)富氫液可以增加LC3Ⅱ和Beclin 1水平,降低IL-1β和TNF-α水平,通過(guò)激活自噬減輕PHN大鼠的機(jī)械痛敏和炎癥因子的釋放。本研究說(shuō)明,針刀微創(chuàng)聯(lián)合夾脊穴位注射射mNGF通過(guò)增強(qiáng)PHN大鼠脊髓背角自噬水平抑制炎癥反應(yīng),與上述研究結(jié)果一致。