陳基勝 符明君 林玉美 (?？谑械谌嗣襻t(yī)院麻醉科,海南 海口 571138)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,根據(jù)胃癌的總發(fā)病率和死亡率,其在惡性腫瘤中排名第二,是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因〔1～3〕。據(jù)2018年統(tǒng)計(jì),全球新診斷胃癌病例103.3萬,死亡78.3萬〔4〕。吸煙、高鹽攝入、病毒感染和遺傳等因素可能與胃癌腫瘤的發(fā)生有關(guān)〔5〕。由于耐藥和高復(fù)發(fā)率等,患者的5年生存率低于30%〔6〕。利多卡因具有明顯的抗胃癌活性。利多卡因可抑制胃癌細(xì)胞惡性行為和增殖潛力〔7〕。利多卡因可抑制人胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8,9〕。微小RNA(miRNA)異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。研究表明,miR-4461可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔10〕。但miR-4461在胃癌中的表達(dá)和作用及利多卡因的抗胃癌作用是否與miR-4461有關(guān)仍需探討。本研究旨在探討利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞惡性表型的影響及潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞AGS、N87、HGC-27和SNU-484(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);miR-4461 inhibitor、miR-4461 mimic及其陰性對(duì)照(inhibitor-NC、miR-NC,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2細(xì)胞處理 將AGS細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng),分為對(duì)照組、利多卡因組(用含10 mmol/L利多卡因培養(yǎng)基培養(yǎng))、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor-NC)、anti-miR-4461組(轉(zhuǎn)染miR-4461 inhibitor)、利多卡因+miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC后,用含10 mmol/L利多卡因培養(yǎng)基培養(yǎng))、利多卡因+miR-4461組(轉(zhuǎn)染miR-4461 mimic后,用含10 mmol/L利多卡因培養(yǎng)基培養(yǎng)),轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 從細(xì)胞中提取總RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-4461表達(dá)量。引物序列:miR-4461,上游:5′-GATTGAGACTAGTAGGGCTCGGC-3′,下游:5′-AGA-CTGGATGAGACTGTGACTTG-3′;U6,上游:5′-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.4MTT 將各組AGS細(xì)胞接種于96孔板(2.5×103個(gè)細(xì)胞/孔),48 h后,加MTT溶液,4 h后加DMSO溶解結(jié)晶物,酶標(biāo)儀檢測490 nm處OD值。

1.5Transwell 于Transwell小室的上室中接種100 μl AGS細(xì)胞懸液(無血清培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml),下室加600 μl培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),常規(guī)培養(yǎng)24 h后,取出小室,穿膜細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。在細(xì)胞侵襲中,使用包被Matrigel的上室,其余操作同上。

1.6Western印跡 RIPA裂解液提取總蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品(60 μg)并轉(zhuǎn)膜,將膜封閉后,與一抗細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1(1∶2 000)、p21(1∶500)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)孵育24 h,洗去一抗,室溫下將膜與二抗(1∶4 000)孵育2 h,顯影,分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1胃癌細(xì)胞中miR-4461表達(dá)比較 與人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(1.00±0.06)比較,胃癌細(xì)胞AGS、N87、HGC-27和SNU-484中miR-4461表達(dá)水平顯著升高(3.15±0.29、2.79±0.32、2.37±0.23、2.19±0.25,F=98.308,P=0.000)。

2.2不同濃度利多卡因?qū)ξ赴〢GS細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組〔(100.00±7.26)%〕比較,1、5、10、20 mmol/L利多卡因均AGS細(xì)胞存活率顯著降低〔(81.28±5.23)%、(65.47±3.58)%、(51.23±4.12)%、(48.12±7.16)%;F=176.092,P=0.000〕,且10、20 mmol/L利多卡因處理后的細(xì)胞存活率約為50%,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 mmol/L利多卡因。

2.3利多卡因?qū)ξ赴〢GS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對(duì)照組比較,利多卡因組AGS細(xì)胞OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低,p21蛋白水平明顯升高(P<0.001)。見圖1、表1、圖2。

表1 利多卡因?qū)GS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)、miR-4461表達(dá)的影響

1～6:對(duì)照組、利多卡因組、anti-miR-NC組、anti-miR-4461組、利多卡因+miR-NC組、利多卡因+miR-4461組圖1 各組CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4利多卡因?qū)ξ赴〢GS細(xì)胞中miR-4461表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,利多卡因組miR-4461表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)。見表1。

2.5下調(diào)miR-4461對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-4461后,anti-miR-4461組miR-4461表達(dá)水平明顯低于anti-miR-NC組,說明轉(zhuǎn)染成功;與anti-miR-NC組比較,anti-miR-4461組AGS細(xì)胞OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平明顯降低,p21水平明顯升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

表2 下調(diào)miR-4461對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6過表達(dá)miR-4461逆轉(zhuǎn)了利多卡因?qū)ξ赴〢GS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與利多卡因+miR-NC組比,利多卡因+miR-4461組miR-4461表達(dá)水平、OD值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平明顯升高,p21水平明顯降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 過表達(dá)miR-4461逆轉(zhuǎn)了利多卡因?qū)ξ赴〢GS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

利多卡因可用于多種急性或慢性疼痛疾病,如神經(jīng)性疼痛、炎癥和傷害性疼痛〔11,12〕。且研究發(fā)現(xiàn),利多卡因具有抗癌作用,如利多卡因可抑制乳腺癌細(xì)胞的存活和遷移〔13〕。利多卡因可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)凋亡〔14〕。利多卡因可抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞的生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、遷移和侵襲,并可增強(qiáng)小鼠卵巢轉(zhuǎn)移模型中的順鉑化療敏感性〔15〕。利多卡因可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活力和有氧糖酵解,促進(jìn)體外細(xì)胞凋亡,抑制體內(nèi)腫瘤生長〔16〕。利多卡因可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔17〕。與上述抗癌作用一致,本研究結(jié)果提示利多卡因具有抗胃癌作用。

研究表明,miRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如miR-552高表達(dá)預(yù)示胃癌患者預(yù)后不良,上調(diào)miR-552可提高胃癌細(xì)胞活力、轉(zhuǎn)移和EMT能力,并通過靶向負(fù)調(diào)控叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(FOX)O1表達(dá)促進(jìn)胃癌進(jìn)展〔18〕。miR-1301-3p在胃癌中呈高表達(dá),其可通過靶向下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1促進(jìn)胃癌細(xì)胞體內(nèi)生長〔19〕。miR-653-5p通過下調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)抑制分子(SOCS)6促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔20〕。在胃癌組織和細(xì)胞中,miR-196b表達(dá)上調(diào),下調(diào)miR-196b通過靶向上調(diào)食管癌相關(guān)基因(ECRG)4抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔21〕。miR-1180在胃腺癌組織中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān),且可促進(jìn)胃癌進(jìn)展〔22〕。與上述研究結(jié)果相似,本研究結(jié)果提示miR-4461在胃癌中發(fā)揮促癌作用,下調(diào)miR-4461可抑制胃癌進(jìn)展。

近年來,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),利多卡因通過調(diào)控miR表達(dá)發(fā)揮抗癌作用。如利多卡因可通過上調(diào)miR-520a-3p抑制EGFR表達(dá),誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡,并抑制其增殖〔23〕。在肝癌細(xì)胞中,過表達(dá)miR-15a-5p可增加細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞遷移和侵襲,利多卡因通過調(diào)控miR-15a-5p表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制遷移和侵襲〔24〕。在卵巢癌和乳腺癌中,利多卡因通過調(diào)控miR-382-5p/SLC7A11軸促進(jìn)卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞鐵死亡〔25〕。此外,利多卡因被報(bào)道可通過上調(diào)miR-145抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為〔26〕;且利多卡因可通過降低miR-10b表達(dá)增強(qiáng)胃癌MGC-803/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性〔27〕。本研究結(jié)果提示利多卡因的抗胃癌作用可能與下調(diào)miR-4461表達(dá)有關(guān)。