王 志 趙 琪 劉正道 朱海冬 劉曉飛 王 建 何長海 李保安 張 磊 和術(shù)臣

嗜鉻細(xì)胞瘤是一類神經(jīng)內(nèi)分泌方面的腫瘤,起源于腎上腺的嗜鉻細(xì)胞或者是髓質(zhì)等相關(guān)的組織,其病因尚不清楚,但可能與遺傳有關(guān)[1]。嗜鉻細(xì)胞瘤通常表現(xiàn)出一系列癥狀,例如高血壓,心肌梗塞,急性呼吸窘迫綜合征,急性腎衰竭和腦血管事件[2]。由于這些嚴(yán)重的并發(fā)癥,臨床上必須及時有效地診治嗜鉻細(xì)胞瘤。但是,由于脂質(zhì)原因,臨床上MRI平掃難以區(qū)別嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺腺瘤[3]。因此,迫切需要一些生物標(biāo)志物來鑒別兩者。非編碼RNA為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子,在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),包括嗜鉻細(xì)胞瘤[4]。Ying-Chun等[5]發(fā)現(xiàn)嗜鉻細(xì)胞瘤中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2表達(dá)異常?；诖?本研究旨在探討血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2聯(lián)合對嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

挑選2018年4月至2022年4月我院治療的嗜鉻細(xì)胞瘤患者共70例為嗜鉻組,其中男女比為37∶33,平均年齡(46.23±21.06)歲。腎上腺腺瘤患者70例為腎上組,其中男女比為32∶38,平均年齡(47.42±23.51)。嗜鉻細(xì)胞瘤患者和腎上腺腺瘤患者均經(jīng)MRI檢查和病理活檢證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn):①血液抽取前實(shí)施任何方面治療的患者;②伴有其他部位的腫瘤;③伴有全身性的自體免疫性疾病;④伴有肝、心、腎等功能嚴(yán)重障礙;⑤予以免疫抑制劑或者是皮質(zhì)類固醇激素治療的患者。挑選同一個時間段在我院體檢的健康人70例為對照組,其中男女比為35∶35,平均年齡(44.65±24.93)歲。各組受試者的一般資料可比(P>0.05)。受試者均知情同意且獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 抽取RNA以及實(shí)時熒光定量PCR

采集腎上腺腺瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤患者以及健康體檢者的外周血各10 ml。使用北京潤澤康生物生產(chǎn)的RNA小量提取試劑盒(貨號:R6814-01)對于血清總RNA進(jìn)行抽提。用特定的逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2進(jìn)行擴(kuò)增。RT反應(yīng)在42 ℃條件下進(jìn)行60 min,70 ℃條件下進(jìn)行10 min;PCR反應(yīng)在95 ℃條件下進(jìn)行20 s,然后在7900HT實(shí)時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上進(jìn)行40個循環(huán),95 ℃條件下進(jìn)行10 s,60 ℃條件下進(jìn)行20 s,然后70 ℃條件下進(jìn)行10 s。通過SYBR Green Dye(SYBR?Premix Ex TaqTM II,TaKaRa)釋放的熒光水平計算PCR產(chǎn)物的相對量。采用溶解曲線分析方法評價PCR產(chǎn)物的特異性。2-ΔΔCt方法應(yīng)用于確定miRNA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

RISM 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Mann-Whit-ney U檢驗(yàn)評估嗜鉻組、腎上組、對照組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的表達(dá)水平差異。應(yīng)用受試者的工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2水平對嗜鉻細(xì)胞瘤的臨床診斷價值。陽性臨界值是ROC曲線中約登指數(shù)最大值所對應(yīng)的數(shù)值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試人員血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的相對表達(dá)量

血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的相對表達(dá)量在嗜鉻組、腎上組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 3組受試人員血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的相對表達(dá)量

2.2 非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2水平對嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺腺瘤的診斷效能

為了判定血清里面非編碼RNAC9orf147和BSN-AS2水平對嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺腺瘤的診斷效能,繪制ROC曲線(圖1)。C9orf147的AUC是0.91±0.03(95%CI 0.8508～0.9664),以1.551作為C9orf147的陽性臨界值,其診斷方面的靈敏度以及特異度分別是92.86%(65/70)、91.43%(64/70);BSN-AS2的受試者具體的AUC是0.93±0.02(95%CI 0.8929～0.9847),以1.276作為BSN-AS2的陽性臨界值,其診斷方面的靈敏度以及特異度分別是92.86%(65/70)、92.86%(65/70)。見表2、3和圖1。

圖1 嗜鉻組和腎上組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的ROC曲線

表2 血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2檢測與病理結(jié)果對比/例

表3 嗜鉻組和腎上組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的AUC、特異度、靈敏度和截斷值

2.3 嗜鉻組和對照組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估血清中非編碼RNAC9orf147和BSN-AS2在嗜鉻組和對照組中的診斷價值,繪制70例嗜鉻組患者和70例對照組人員的ROC曲線(圖1)。C9orf147的AUC是0.94±0.02(95%CI 0.8899～0.9839),以1.967作為C9orf147的陽性臨界值,其診斷方面的靈敏度以及特異度分別是94.29%(66/70)、92.86%(65/70);BSN-AS2的AUC為0.95±0.02(95%CI 0.9125～0.9850),以1.719作為BSN-AS2的陽性臨界值,其診斷方面的靈敏度以及特異度分別是94.29%(66/70)、94.29%(66/70)。見圖2和表4、5。

圖2 嗜鉻組和對照組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的ROC曲線

表4 血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2檢測與病理診斷結(jié)果的對比/例

表5 嗜鉻組和對照組血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的AUC、特異度、靈敏度和截斷值

2.4 非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2對嗜鉻細(xì)胞瘤的聯(lián)合診斷

存在嗜鉻細(xì)胞瘤的認(rèn)定是真陽性,不存在嗜鉻細(xì)胞瘤則認(rèn)定為真陰性,以C9orf147的陽性臨界值為1.551和BSN-AS2的陽性臨界值為1.276作為此次診斷的界限,兩者全部滿足則認(rèn)定為聯(lián)合診斷陽性,反之則認(rèn)定為陰性。血清非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2聯(lián)合檢測對嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷的靈敏度為92.86%(65/70),特異度為93.57%(131/140),準(zhǔn)確度為93.33%(196/210)。見表6。

表6 非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2對嗜鉻細(xì)胞瘤的聯(lián)合診斷/例

3 討論

嗜鉻細(xì)胞瘤是一種罕見的腎上腺腫瘤,發(fā)病率為每百萬人中有3～4人[6]。嗜鉻細(xì)胞瘤臨床表現(xiàn)多種多樣,但最容易出現(xiàn)的有出汗、頭痛、心悸和高血壓,這些心血管嚴(yán)重并發(fā)癥與其分泌的兒茶酚胺有關(guān)。但是,影像學(xué)診斷難以區(qū)分嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺腺瘤。因此,迫切需要非影像學(xué)手段對嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺腺瘤進(jìn)行診斷。本研究發(fā)現(xiàn)血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2聯(lián)合對嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷的靈敏度為92.86%,特異度為93.57%,準(zhǔn)確度為93.33%。

最近的研究表明[7],盡管這些基因中只有1%～2%編碼蛋白質(zhì),但人類基因組中有超過90%可以被轉(zhuǎn)錄。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼RNA,包含多種復(fù)雜的生物物種[8]。最近的研究表明[9],lncRNAs參與了基因組印跡,轉(zhuǎn)錄激活,X滅活,轉(zhuǎn)錄干擾,染色質(zhì)修飾和核轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的相對表達(dá)量在嗜鉻組、腎上組和對照組中有顯著差異(P<0.05)。最近的研究表明[10],基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有多種作用方式。一些lncRNA具有與miRNA的結(jié)合位點(diǎn),并充當(dāng)miRNA海綿,從而從靶基因釋放miRNA,并提高了靶基因的表達(dá)水平。因此,C9orf147和BSN-AS2可能通過與miRNA結(jié)合,調(diào)控某些基因的mRNA水平并影響這些基因的翻譯。盡管還沒有研究探討C9orf147和BSN-AS2的功能。但是通過Ying-Chun等[5]建立的lncRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以看出,BSN-AS2可能通過miR-195調(diào)節(jié)PTPRJ mRNA的表達(dá),而PTPRJ的表達(dá)與總體生存率呈負(fù)相關(guān)。相反,BSN-AS2也可能與miR-193b、miR-195和/或miR-497競爭介導(dǎo)TGFBR3 mRNA的表達(dá)有關(guān),而這與生存率呈正相關(guān)。因此,目前BSN-AS2與總體生存率的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的探討。此外,非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2是否是在多種腫瘤中表達(dá)異常仍需探討。

在本研究中,血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2單項(xiàng)診斷嗜鉻組與腎上組的靈敏度為92.86%、92.86%,特異度分別為91.43%、92.86%。血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2單項(xiàng)診斷嗜鉻組與對照組的靈敏度為94.29%、94.29%,特異度分別為92.86%、94.29%。相比于傳統(tǒng)的病理活檢[11],檢測血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的表達(dá)水平具有無創(chuàng)、簡單、快速的優(yōu)勢。相比于方嫻靜等[12]的影像學(xué)平掃CT值診斷嗜鉻細(xì)胞瘤,本研究非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的檢測具有較高的特異度。

綜上所述,血清中非編碼RNA C9orf147和BSN-AS2的表達(dá)水平可作為嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷指標(biāo)。