鄒平安 陶志偉 楊崢旭 劉 哲 廖建玉

對(duì)于晚期惡性黑色素瘤患者,PD1免疫治療已成為指南推薦的首選治療,PD-1抑制劑能夠更好地隔斷PD-1 受體同 PD-L1 配體的之間的融合,幫助免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞,由此提升機(jī)體自我的免疫水平,最終達(dá)到治療目的,但是,有數(shù)據(jù)顯示PD-1抑制劑在中國(guó)惡性黑色素瘤患者中的客觀緩解率僅有20%[1],因此臨床上亟需找到影響PD1抑制劑療效的相關(guān)因子。本研究選取經(jīng)PD-1抑制劑治療的惡性黑色素瘤患者,通過(guò)免疫組化檢測(cè)CD8及Foxp3的表達(dá),分析其與惡性黑色素瘤PD1抑制劑療效(客觀控制率與無(wú)進(jìn)展生存期)的相關(guān)性,初步探討其作為療效的生物標(biāo)志物可能性。

1 資料與方法

1.1 患者納入標(biāo)準(zhǔn)

選取本院2019年1月年至2021年6月轉(zhuǎn)移的或不可切除的惡性黑色素瘤患者共54例,在我院確診且均留有手術(shù)標(biāo)本蠟塊,其中男性30例,女性24例,中位年齡62歲。給予所有患者PD-1抑制劑特瑞普利單抗240 mg 靜滴,每2周一次,至少用藥3個(gè)月(排除假性進(jìn)展)。至少有一處可評(píng)估的病灶。隨訪周期至少1年以上,或隨訪至病情進(jìn)展。失訪或不能耐受藥物毒副作用的患者排除。

1.2 PD-1抑制劑療效評(píng)估及繪制無(wú)進(jìn)展生存曲線

收集納入標(biāo)準(zhǔn)患者的病歷、病理數(shù)據(jù)和影像學(xué)信息,圍繞符合要求的病患展開訪查活動(dòng),參照實(shí)體瘤評(píng)估要求recist1.1對(duì)效果進(jìn)行評(píng)價(jià),主要包含:CR:病灶徹底緩和,排除結(jié)節(jié)性疾病,目標(biāo)病灶均被徹底的消除了。全部的目標(biāo)結(jié)節(jié)須均降低至常規(guī)水平(短軸<10 mm)。PR:病灶有效緩和,全部可測(cè)的目標(biāo)病灶的直徑其總值小于基線不低于30%。目標(biāo)結(jié)節(jié)總和應(yīng)用短徑,但是其他的目標(biāo)病灶總和則選擇最長(zhǎng)直徑。PD:疾病發(fā)展,圍繞整個(gè)的測(cè)試期間全部的檢測(cè)的靶病灶直徑總值的最低值為依據(jù),直徑和相對(duì)而言提高不低于20%,與此同時(shí),務(wù)必達(dá)到直徑和的絕對(duì)值提高不低于5 mm。SD:病情穩(wěn)定,靶病灶降低水平未有達(dá)到PR,提高的水平也未有達(dá)到PD水平,存在于這兩者之間,分析過(guò)程中可選擇直徑之和的最低值進(jìn)行對(duì)比。PFS:無(wú)進(jìn)展生存階段,病患自接納治療伊始,至發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展或可能出現(xiàn)由于其他方面的因素而死亡的整個(gè)周期。

根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效,用SPSS軟件繪制患者總體的無(wú)進(jìn)展生存曲線。

1.3 免疫組化檢測(cè)CD8及Foxp3的表達(dá)

在10%的福爾馬林中對(duì)手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行固定處理,并選擇石蠟予以包埋處理,4 μm切片處理,En Vision 法免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化處理,FOXP3和CD8則選擇檸檬酸鹽緩沖液熱抗原予以修復(fù)處理,組織切片浸潤(rùn)在3%的雙氧水室溫條件下遮光培育20 min,給單內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。依次引入Foxp3(1∶100)和CD8(1∶100)一抗50 μl,濕盒四度培育12 h。加入二抗增強(qiáng)劑,濕盒培育20 min,引入常規(guī)的二抗,濕盒室溫條件下培育半小時(shí)。DAB著色,蘇木精復(fù)染返藍(lán),普通酒精梯度脫水處理、二甲苯透明以及光學(xué)顯微鏡條件下進(jìn)行分析。選擇IgG陰性進(jìn)行參照處理。

結(jié)果判定:由兩位具備專業(yè)水平的病理科醫(yī)療人員,根據(jù)雙盲法的原則對(duì)結(jié)果予以判定。Foxp3根據(jù)細(xì)胞核內(nèi)存在棕黃色以及棕褐色著色判定為陽(yáng)性,CD8則是細(xì)胞膜產(chǎn)生棕黃色以及棕褐色著色判定是陽(yáng)性。每個(gè)標(biāo)本于顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)四百倍的視野,各個(gè)視野計(jì)數(shù)一百個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),依次選擇均值來(lái)確定切片的Foxp3以及CD8具體數(shù)目。各個(gè)切片F(xiàn)oxp3數(shù)目高于5個(gè)則判定陽(yáng)性,不高于5個(gè)則判定陰性;除此之外,各個(gè)切片CD8數(shù)目高于10個(gè)則判定陽(yáng)性,不高于10則判定陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

涉及的數(shù)據(jù)選擇SPSS 22.0應(yīng)用進(jìn)行處理,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采取百分?jǐn)?shù)的形式表示,并進(jìn)行卡方校驗(yàn),選擇Spearman秩相關(guān)校驗(yàn)。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間分析則采取Kaplan-Meier法以及Log-rank檢驗(yàn),P<0.05則數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8及Foxp3在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)情況

54例惡性黑色素瘤組織里,CD8表達(dá)陽(yáng)性28例,占51.85%;Foxp3表達(dá)陽(yáng)性22例,占40.74%。

2.2 CD8及Foxp3的表達(dá)與PD1抑制劑近期療效的關(guān)系

54例黑色素瘤病患,經(jīng)PD1抑制劑干預(yù)之后,在隨訪周期內(nèi),26例進(jìn)展,2例完全緩解、8例不完全緩解、18例穩(wěn)定,總的疾病控制率為51.85%。CD8陽(yáng)性表達(dá)患者中疾病控制率(DCR%)為78.58%,CD8陰性表達(dá)患者中疾病控制率為23.08%,CD8陽(yáng)性表達(dá)患者疾病控制效果顯著好于陰性患者(P值<0.05)。在Foxp3陽(yáng)性表達(dá)患者中疾病控制率為36.36%,CD8陰性表達(dá)患者中疾病控制率為62.50%,Foxp3陽(yáng)性表達(dá)者疾病控制率明顯低于陰性表達(dá)者(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 PD1抑制劑的疾病控制率與CD8、Foxp3表達(dá)相關(guān)分析(例,%)

2.3 CD8及Foxp3的表達(dá)與惡性黑色素瘤患者生存期的關(guān)系

54例惡性黑色素瘤患者經(jīng)PD1抑制劑干預(yù)之后,中位PFS是10個(gè)月,12個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存率達(dá)到46%,2年無(wú)進(jìn)展生存率為26%。如圖1。其中,CD8陽(yáng)性病患中位PFS達(dá)到1年,CD8陰性病患的中位則達(dá)到8個(gè)月,CD8陽(yáng)性的病患無(wú)進(jìn)展生存周期顯著要大于CD8陰性病患,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013<0.05)。見(jiàn)圖2。Foxp3陽(yáng)性病患的中位PFS達(dá)到8個(gè)月,陰性病患的中位PFS則達(dá)到1年,Foxp3陽(yáng)性病患的無(wú)進(jìn)展生存周期顯著小于陰性病患,差異性十分顯著(P=0.011<0.05),見(jiàn)圖3。

圖1 PD1抑制劑治療總體的無(wú)進(jìn)展生存期

圖2 CD8陽(yáng)性與CD8陰性患者的無(wú)進(jìn)展生存曲線

圖3 Foxp3陽(yáng)性與Foxp3陰性患者的無(wú)進(jìn)展生存曲線

3 討論

惡性黑色素瘤組織內(nèi),CD8表達(dá)和惡性黑色素瘤的生存時(shí)間有著極大的聯(lián)系,可能與CD8 T淋巴細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞有關(guān)[2]。國(guó)外有研究顯示,CD8在黑色素瘤中的表達(dá)的數(shù)量以及空間分布與免疫治療應(yīng)答呈正相關(guān)[3]。血液中循環(huán)CD8 T淋巴細(xì)胞的類型可以預(yù)測(cè)PD-1抑制劑治療的療效[4]。有實(shí)驗(yàn)證明CD8 T淋巴細(xì)胞的功能失調(diào)將導(dǎo)致PD-1抑制劑的耐藥[5]。在肺癌患者中,血液中CD8細(xì)胞數(shù)量缺失與PD-1抑制劑的治療進(jìn)展相關(guān)[6]。Foxp3為叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族主要組成之一,特異性表達(dá)于Tregs,另外和Tregs的發(fā)育以及免疫抑制的發(fā)揮有著重要聯(lián)系。Tregs是關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,有關(guān)研究說(shuō)明,惡性黑色素瘤內(nèi)Tregs細(xì)胞浸潤(rùn)情況和病患的預(yù)后為反向聯(lián)系[7]。皮膚惡性黑色素瘤內(nèi),Foxp3陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞參與了腫瘤的免疫逃避,從而導(dǎo)致病變進(jìn)展[8]。FOXP3可能是黑色素瘤的有用治療靶點(diǎn),因?yàn)橐种艶OXP3陽(yáng)性腫瘤克隆和調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以消除腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫防御的能力[9]。國(guó)外有研究表面在轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤細(xì)胞中,Foxp3的表達(dá)明顯增高,可以作為惡性黑色素瘤進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物[10]。在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中,CD8+及Foxp3+可以作為惡性黑色素瘤的預(yù)后的生物標(biāo)志物[11]。

我國(guó)的有關(guān)研究提到,惡性黑色素瘤內(nèi),腫瘤位置的差異性、Foxp3+Treg以及CD8+T的數(shù)目,是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤病患的PFS都不一樣。Tregs數(shù)和惡性黑色素瘤的進(jìn)展高度關(guān)聯(lián),黏膜惡性黑色素瘤預(yù)后不理想或許和Tregs浸潤(rùn)有著聯(lián)系[12]。此次探究,PD-1抑制劑對(duì)54例惡性黑色素瘤患者的總體疾病控制率為51.85%,中位PFS為10個(gè)月。而CD8陽(yáng)性病患的疾病管控水平和生存期都要比CD8的陰性病患更理想,Foxp3陰性病患的疾病管控水平和生存期都要比陽(yáng)性病患更理想,CD8的表達(dá)和PD-1抑制劑的應(yīng)用之間為正向關(guān)系,而Foxp3的表達(dá)則與其之間為負(fù)反饋關(guān)系,下一步有望通過(guò)提高CD8的表達(dá)及降低Foxp3的表達(dá)建立更為理想的腫瘤免疫微環(huán)境,提升PD-1的免疫治療水平。