韓慧娟,劉 歡,趙志軍

人類冠狀病毒(human coronavirus,HCoV)可以引起輕微的普通感冒以及嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,是影響呼吸道健康的重要病因之一,也是我國(guó)兒童最常見的呼吸道疾病的主要病因[1-2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種高致病性人類冠狀病毒,分別是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-associated coronavirus,SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)[3-4]。然而,在人群中傳播最廣泛的4種常見人類冠狀病毒分別是屬于α冠狀病毒的HCOV-229E(human coronavirus 229E)和HCOV-NL63(human coronavirus NL63)和屬于β冠狀病毒的HCOV-HKU1(human coronavirus HKU1)和HCOV-OC43(human coronavirus OC43),這些病毒通常引起人類自限性的輕度上呼吸道感染,約占普通感冒病例的1/3[5-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),高爾基體在人類冠狀病毒復(fù)制周期中起到關(guān)鍵作用[8-9],主要作用是通過(guò)反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network,TGN)將含有包膜病毒顆粒的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面,通過(guò)胞吐的方式釋放成熟病毒,然而,參與調(diào)控這一轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的關(guān)鍵分子和機(jī)制尚不清楚。

蛋白激酶D (Protein kinase D,PKD)是由 PKD1、PKD2 和 PKD3組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、高爾基復(fù)合體和質(zhì)膜。在上皮細(xì)胞中,3種PKD亞型主要定位于反式高爾基體上[10]。細(xì)胞水平和動(dòng)物模型的研究證明PKD參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展,包括癌癥、代謝紊亂、心臟病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、炎癥性疾病和免疫失調(diào)等[11]。研究發(fā)現(xiàn)PKD抑制劑能夠顯著抑制多種癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,并對(duì)其他疾病的進(jìn)展也顯示出較強(qiáng)的抑制作用[12]。盡管已有研究證實(shí)PKD參與細(xì)胞免疫應(yīng)答,但在人類冠狀病毒感染過(guò)程中的PKD功能仍知之甚少。因此,本研究以參與調(diào)控TGN的關(guān)鍵分子PKD為切入點(diǎn),側(cè)重分析PKD在人類冠狀病毒229E復(fù)制過(guò)程中的作用及其生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒 MRC-5(醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)細(xì)胞株5,貨號(hào)CCL-171)細(xì)胞和Vero-E6(非洲綠猴腎,貨號(hào)CRL-1586)細(xì)胞購(gòu)買自ATCC公司。MRC-5細(xì)胞和Vero-E6在含10% 胎牛血清(HyClone,貨號(hào)SH30071.03IH30-45)的改良DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich,貨號(hào)D0822)于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

HCoV-229E由美國(guó)羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心免疫系Stephen Dewhurst博士提供。實(shí)驗(yàn)用HCoV-229E在MRC-5細(xì)胞中擴(kuò)增收集,并在MRC-5細(xì)胞上檢測(cè)病毒滴度以確定感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)值。在HCoV感染實(shí)驗(yàn)中,不同的時(shí)間和MOI值的HCoV-229E用來(lái)感染細(xì)胞,病毒在常溫孵育1 h后,放置在37 ℃下孵育進(jìn)行細(xì)胞感染。

1.2 RNAi轉(zhuǎn)染 MRC-5細(xì)胞用靶向人蛋白PKD3(siPKD3,thermofisher,貨號(hào)AM51331)轉(zhuǎn)染24 h,使用Si-Control(thermofisher,貨號(hào)AM4611)作為非靶向?qū)φ?。Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,貨號(hào)12566014)在Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基(Invitrogen,貨號(hào)31985062)中以3∶1 Si-RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞達(dá)到70%融合度時(shí),細(xì)胞以MOI值為10的HCoV-229E預(yù)感染24 h,用Si-RNA轉(zhuǎn)染以敲低PKD3,收集細(xì)胞和病毒上清液用于測(cè)定。

1.3Prkd3過(guò)表達(dá) 在細(xì)胞達(dá)到70%融合度時(shí),加入1 MOI的對(duì)照腺病毒(Ad-control)或Prkd3腺病毒(Ad-Prkd3)(signagen,貨號(hào)SL100971)轉(zhuǎn)染 MRC-5 細(xì)胞24 h,接下來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)處理。

1.4 PKD抑制劑處理和PI4KⅢβ抑制劑處理細(xì)胞 CRT0066101,購(gòu)買自Tocris,純度為99.9%。PI4KIIIβ抑制劑(BQR695,貨號(hào)CAS 1513879-21-4)購(gòu)買自MedKoo,純度為99.9%。為了測(cè)定抑制劑對(duì)病毒復(fù)制的影響,MRC-5細(xì)胞中加入的HCoV-229E MOI值為10;室溫下孵育1 h;然后用PBS洗滌以去除未結(jié)合的病毒; 用濃度梯度增高的劑量依賴性CRT0066101,BQR695或?qū)φ赵?7 ℃下處理細(xì)胞24 h。感染/復(fù)制結(jié)束時(shí),收集細(xì)胞和上清液,并在4 ℃下以10 000 ×g離心5 min以除去細(xì)胞碎片,使用含有HCoV-229E的上清液進(jìn)行TCID50滴度測(cè)定。細(xì)胞在感染/復(fù)制期結(jié)束時(shí)于RLT緩沖液中進(jìn)行裂解收集總RNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR分析mRNA含量。

1.5 活細(xì)胞PIP2檢測(cè) 活細(xì)胞PI(4,5)P2檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)D0400G)購(gòu)自Montana Molecular,分離細(xì)胞并在完全培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞,將 20 μL傳感器BacMam儲(chǔ)備液與 0.6 μL 500 mmol/L SB(丁酸鈉儲(chǔ)備溶液)和 24.4 μL完全培養(yǎng)基混合以制備轉(zhuǎn)導(dǎo)溶液。將細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)混合物混勻,在96孔板上于室溫下孵育30 min,后在培養(yǎng)箱中孵育24 h,然后通過(guò)自動(dòng)熒光板讀數(shù)器測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞活力測(cè)定 CCK8檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)HY-K0301)購(gòu)自MCE, 通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)于96孔板中進(jìn)行活力測(cè)定,其中用CRT0066101處理未感染的MRC-5細(xì)胞和Vero-E6細(xì)胞。在處理結(jié)束前3 h,將10 μL CCK8溶液加入細(xì)胞中。將細(xì)胞于37 ℃下孵育4 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞活力。

1.7 病毒終點(diǎn)滴度測(cè)定(TCID50) 將MRC-5細(xì)胞或Vero-E6細(xì)胞在96孔板中用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基孵育,病毒連續(xù)稀釋8個(gè)稀釋度,重復(fù)6次,孵育3～5 d。根據(jù)Karber法計(jì)算每個(gè)孔中存在CPE的數(shù)量進(jìn)行病毒滴度評(píng)估。

1.8 免疫熒光染色 細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min,使用0.25% 的Triton X-100處理15 min。PBS清洗3遍,加10%牛血清白蛋白孵育30 min。隨后,將細(xì)胞與指定的一抗mouse PI(4,5)P2(PI(4,5)P22C11) (Santa Cruz,貨號(hào)sc-53412), rabbit Anti-TGN46 antibody (Abcom,貨號(hào)Ab50595), HCoV-229E Human Coronavirus Spike RBD Antibody (R&D,貨號(hào)MAB10938), and mouse anti-P230 (fishersci,貨號(hào)BDB611280) 一起在冷藏室孵育過(guò)夜,然后與適當(dāng)?shù)腁lexa Fluor偶聯(lián)二抗(thermofisher)孵育1.5 h。最后用4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,thermofisher,貨號(hào)D1306)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以可視化DNA。在共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)下觀察細(xì)胞,并獲得圖像,使用ImageJ軟件分析圖像。

1.9 蛋白質(zhì)印跡 收集HCoV-229E感染的細(xì)胞后,在含有蛋白酶(Sigma-Aldrich,貨號(hào)A32963)的冰細(xì)胞裂解緩沖液中裂解細(xì)胞,并將其用5X上樣緩沖液(thermofishe,貨號(hào)A32963)煮沸10 min。將蛋白質(zhì)上樣到10% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜封閉在5%牛血清白蛋白中1 h。將一抗(PKD1抗體, PKD2抗體, PKD3抗體和Tubulin抗體,均購(gòu)自Cell signaling, 貨號(hào)2052,8188,5655和2144S)在4 ℃孵育過(guò)夜,二抗在室溫下孵育1.5 h,然后加入ECL試劑(Bio-Rad,貨號(hào)1705060S)并在imgaeDoc(Bio-Rad)上收集數(shù)據(jù)。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 從細(xì)胞中提取總RNA,PBS洗滌細(xì)胞,用含有β-巰基乙醇(Sigma,貨號(hào)19-1335)的RLT緩沖液(Qiagen,貨號(hào)74104)以1∶100稀釋度裂解。mRNA提取利用RNeasymini試劑盒(Qiagen,貨號(hào)74104)進(jìn)行。使用Omniscript RT 試劑盒(Qiagen,貨號(hào)205113)在 37 ℃下逆轉(zhuǎn)錄 1 μg的 mRNA后進(jìn)行 cDNA 的合成。CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)與iQ SYBR綠色超級(jí)混合物(Bio-Rad,貨號(hào)1725150)在94 ℃條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)10 min,40 次循環(huán),94 ℃持續(xù) 15 s,58 ℃持續(xù) 30 s,72 ℃持續(xù) 30 s;并在 72 ℃下最終伸長(zhǎng)15 min。使用引物對(duì)目標(biāo)mRNA的水平進(jìn)行定量,如下所示:HumanPrkd1上游引物5′- ACC CTT GGC TAC AGG ACT AT-3′, HumanPrkd1下游引物 5′- CCA CCT CAG GTC ATC ACT TTC-3′; HumanPrkd2上游引物5′- AGG GTT GGG TGG TTC ATT AC-3′, HumanPrkd2下游引物5′- TAT CTG TTG GTC GTG TTG TTC T-3′ ; HumanPrkd3上游引物5′- TGT TCC CTG CAA CTG TTT CTG-3′, HumanPrkd3下游引物5′- CTC TCT CGT GTG AGG CCA ATC-3′; Human Gapdh上游引物5′- GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3′, Human Gapdh下游引物5′- CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG-3′; HCoV- 229E 上游引物5′- TTC CGA CGT GCT CGA ACT TT-3′, HCoV- 229E 下游引物5′- CCA ACA CGG TTG TGA CAG TGA-3′, 18S rRNA 上游引物5′- CGC CGC TAG AGG TG A AAT TCT-3′, 18S rRNA 下游引物5′- CAT TCT TGG CAA ATG CTT TCG-3′。將每個(gè)基因的水平歸一化至18S rRNA或Gapdh的水平進(jìn)行定量,并使用DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因的確切拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 PKD家族成員在HCoV-229E感染過(guò)程中的表達(dá) 將MRC-5細(xì)胞以MOI值為10的HCoV-229E感染7 d,并在感染后的每天收集細(xì)胞樣品,通過(guò)qPCR分析檢測(cè)病毒的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,HCoV-229E的病毒感染量在第4 d達(dá)到峰值(圖1 A)。同時(shí), 與未感染組相比,Prkd1,Prkd2和Prkd3的表達(dá)水平均增加(圖1 B),Western blot結(jié)果顯示PKD1, PKD2和 PKD3的蛋白表達(dá)水平也顯著升高(圖1 C)。這些結(jié)果表明PKD家族成員參與HCoV-229E的復(fù)制過(guò)程。

注:A. qPCR檢測(cè)10MOI HCoV-229E感染MRC-5細(xì)胞過(guò)程中的mRNA水平;B和C. MOI值為10的HCoV-229E感染MRC-5細(xì)胞,共培養(yǎng)7 d,每天收集細(xì)胞并制備細(xì)胞提取物,qPCR檢測(cè)PKD家族的RNA水平(B), Western blot檢測(cè)PKD1, PKD2和 PKD3的蛋白表達(dá)水平(C),每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2.2Prkd3敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)HCoV-229E復(fù)制的影響 使用Si-RNA敲低Prkd3的表達(dá),qPCR檢測(cè)結(jié)果表明Prkd3的表達(dá)水平下降了80%,而Prkd1和Prkd2的水平?jīng)]有顯著性改變(圖2 A)。Prkd3敲低的MRC-5細(xì)胞感染10 MOI HCoV-229E 48 h后,與對(duì)照組相比,HCoV-229E的mRNA表達(dá)量和滴度顯著降低(t表達(dá)量=8.999,P<0.001;t滴度=6.920,P<0.001)(圖2 B 和圖2 C)。在Prkd3過(guò)表達(dá)組,qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示Prkd3表達(dá)增加了約4倍,而Prkd1和Prkd2水平?jīng)]有顯著性改變(圖2 D),且HCoV-229E的mRNA表達(dá)量和滴度水平顯著增加(t表達(dá)量=6.630,P<0.001;t滴度=5.794,P<0.001)(圖2 E 和圖2 F)。這些結(jié)果表明PKD3參與調(diào)節(jié)HCoV-229E在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

注:A. MRC-5細(xì)胞進(jìn)行Si-Prkd3或Si-Control的轉(zhuǎn)染處理,轉(zhuǎn)染后48 h提取RNA,qPCR定量Prkd1,Prkd2和Prkd3的mRNA水平;B和C. Si-Prkd3或Si-Control的轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞48 h,感染10 MOI HCoV-229E,qPCR(B)和TCID50實(shí)驗(yàn)(C)測(cè)定測(cè)定病毒的mRNA和滴度;D. MRC-5細(xì)胞以1 MOI Ad-Prkd3或Ad-Control的轉(zhuǎn)染處理,轉(zhuǎn)染后48 h提取mRNA,qPCR定量Prkd1,Prkd2和Prkd3的mRNA水平;E和F. 1 MOI Ad-Prkd3或Ad-Control轉(zhuǎn)染48 h,MRC-5細(xì)胞感染10 MOI HCoV-229E,qPCR(E)和TCID50實(shí)驗(yàn)(F)測(cè)定病毒的mRNA和滴度。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 PKD抑制劑CRT0066101在HCoV-229E復(fù)制過(guò)程中的作用 采用不同濃度(0,3,6,9,12,15 μmol/L)的CRT0066101處理MRC-5 細(xì)胞24 h,通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,當(dāng)CRT0066101濃度超過(guò)9.0 μmol/L時(shí),出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性,而濃度在3.0 μmol/L以下對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有明顯影響(圖3 A)。以不同濃度(0,1,3,6 μmol/L)的CRT0066101處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細(xì)胞72 h,通過(guò)qPCR和TCID50檢測(cè)病毒mRNA表達(dá)量和滴度水平,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,3.0 μmol/L CRT0066101處理的MRC-5 細(xì)胞,HCoV-229E復(fù)制水平顯著下降(t=6.931,P<0.001;t=4.055,P<0.01)(圖3 B 和圖3 C)。此外,免疫熒光染色結(jié)果顯示在HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞中,HCoV-229E-RBD的表達(dá)水平顯著升高,TGN發(fā)生裂變,在CRT0066101處理組中,HCoV-229ERBD的表達(dá)水平顯著降低,TGN明顯聚合(圖3 D)。這些結(jié)果表明PKD抑制劑能夠有效減少HCoV-229E的復(fù)制和表達(dá),且可能通過(guò)影響TGN裂變導(dǎo)致的。

注:A. 不同濃度梯度的CRT0066101處理MRC-5細(xì)胞,孵育24 h,并通過(guò)CCK8測(cè)定細(xì)胞活力;B和C. MRC-5細(xì)胞感染10 MOI HCoV-229E后,與不同濃度梯度的CRT0066101孵育72 h,qPCR(B)和TCID50實(shí)驗(yàn)(C)測(cè)定病毒的mRNA和滴度,D. 對(duì)10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞進(jìn)行3.0 μmol/L CRT0066101處理,采用抗TGN46抗體和抗229E-RBD抗體進(jìn)行免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下,比例尺為20 μm,每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.4 PKD通過(guò)PI4KIIIβ調(diào)控TGN的裂變參與的HCoV-229E復(fù)制 為了進(jìn)一步研究PKD是否通過(guò)調(diào)控TGN結(jié)構(gòu)影響病毒復(fù)制,將10 MOI HCoV-229E感染MRC-5細(xì)胞1 h后加入3.0 μmol/L CRT0066101培養(yǎng)48 h,免疫熒光染色結(jié)果顯示,在病毒感染的對(duì)照組細(xì)胞中,TGN膜結(jié)構(gòu)發(fā)生裂變,形成囊泡,然而在 CRT0066101處理后,TGN結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,與空白對(duì)照組形態(tài)幾乎一致(圖4A)。已有研究表明,PKD通過(guò)磷酸化底物磷脂酰肌醇 4-激酶 IIIβ(PI4KIIIβ)將磷酸肌醇(PI)磷酸化為磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P),在磷脂酰肌醇5-激酶(PI4P5K)的磷酸化作用下生成磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2],進(jìn)而參與維持TGN的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[13]。為了明確這一信號(hào)通路是否參與PKD調(diào)控的HCoV-229E復(fù)制,采用siRNA敲低Prkd3的表達(dá),檢測(cè)活細(xì)胞中PI(4,5)P2的生成,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,Prkd3的降低顯著抑制了PI(4,5)P2的表達(dá)水平(t=7.394,P<0.001)(圖4 B)。免疫熒光染色和活細(xì)胞PI(4,5)P2檢測(cè)結(jié)果顯示3.0 μmol/L CRT0066101處理的MRC-5細(xì)胞24 h的PI(4,5)P2的表達(dá)水平顯著降低(t=5.968,P<0.01)(圖4 C和圖4D)。采用1.0 μmol/L PI4KIIIβ抑制劑(BQR695)處理MRC-5細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞中的PI(4,5)P2表達(dá)水平降低(圖4E),值得注意的是,1.0 μmol/L BQR695挽救了Prkd3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的PI(4,5)P2表達(dá)升高(t=6.671,P<0.01)(圖4 F),免疫熒光結(jié)果顯示1.0 μmol/L BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,TGN明顯聚合在一起(圖4 G),1.0 μmol/L的BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞72 h后,免疫熒光染色表明BQR-695處理的MRC-5細(xì)胞中HCoV-229ERBD的表達(dá)水平顯著降低(圖4 H),不同濃度的BQR-695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細(xì)胞72 h后,通過(guò)qPCR和TCID50檢測(cè)HCoV-229E的mRNA表達(dá)量和滴度水平,與對(duì)照組相比,0.1 μmol/L BQR-695處理的MRC-5 細(xì)胞中HCoV-229E的mRNA表達(dá)量和滴度水平顯著下降(t表達(dá)量=5.151,P<0.001;t滴度=7.744,P<0.001)(圖4 I 和J)。這些結(jié)果表明PKD通過(guò)調(diào)控PI4KIIIβ參與的PI(4,5)P2生成和TGN裂變,從而影響了HCoV-229E的復(fù)制。

注:A. 10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞在3.0 μmol/L CRT0066101處理48 h,使用抗P230抗體和抗TGN46抗體進(jìn)行免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察TGN結(jié)構(gòu)變化;B. 采用Si-Prkd3或Si-Control 轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞24 h,通過(guò)活細(xì)胞PI(4,5)P2法定量PI(4,5)P2水平;C和D. 10 MOI HCoV-229E感染MRC-5細(xì)胞后經(jīng)3.0 μmol/L CRT0066101處理24 h,使用抗PI(4,5)P2抗體和抗TGN46抗體進(jìn)行免疫熒光染色(C),共聚焦顯微鏡下觀察PI(4,5)P2和TGN結(jié)構(gòu)變化,活細(xì)胞PI(4,5)P2測(cè)定法(D)定量PI(4,5)P2表達(dá)水平。E. 1.0 μmol/L BQR695處理HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞24 h,通過(guò)活細(xì)胞PI(4,5)P2測(cè)定法測(cè)量PI(4,5)P2水平。F. 活細(xì)胞PI(4,5)P2測(cè)定法測(cè)量1.0 μmol/L BQR695處理Ad-Prkd3轉(zhuǎn)染的MRC-5細(xì)胞的PI(4,5)P2水平。G. 1.0 μmol/L BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞72 h,使用P230抗體和抗TGN46抗體進(jìn)行免疫染色,分析TGN結(jié)構(gòu)。H. 1.0 μmol/L BQR-695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞72 h,使用抗TGN46抗體和抗229E-RBD抗體進(jìn)行免疫染色,并分析HCoV-229E含量。I和J:MRC-5細(xì)胞感染10 MOI HCoV-229E,并與不同濃度梯度的BQR-695孵育72 h。通過(guò)qPCR(I)和TCID50實(shí)驗(yàn)(J)測(cè)定mRNA表達(dá)量和滴度水平。比例尺為20 μm,每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.5 CRT0066101對(duì)HCoV-229E在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制影響 基于CRT0066101在MRC-5細(xì)胞中對(duì)HCoV-229E復(fù)制和表達(dá)具有顯著抑制效果,進(jìn)一步驗(yàn)證CRT0066101在其他類型細(xì)胞中的作用。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示,CRT0066101濃度低于3.0 μmol/L下對(duì)Vero-E6細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性作用。在10 MOI HCoV-229E感染的Vero-E6細(xì)胞中使用不同濃度(0,1,3 μmol/L)的CRT0066101處理72 h后,qPCR和TCID50檢測(cè)病毒mRNA表達(dá)量和滴度水平。與對(duì)照組相比,3.0 μmol/L CRT0066101處理的Vero-E6細(xì)胞中的HCoV-229E的mRNA表達(dá)量(t=7.480,P<0.001)和滴度水平(t=7.228,P<0.01)顯著下降。這些結(jié)果表明CRT0066101在Vero-E6細(xì)胞中也能夠抑制HCoV-229E的復(fù)制。

3 討 論

蛋白激酶D在調(diào)節(jié)高爾基體膜裂變和融合,反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)到質(zhì)膜的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[14-15]。然而,PKD與人類冠狀病毒復(fù)制是否相關(guān)尚不完全清楚。本研究分析了PKD在HCoV-229E感染MRC-5細(xì)胞和Vero-E6細(xì)胞中的生物學(xué)作用,明確了PKD在HCoV-229E感染過(guò)程中顯著升高。與PKD1和PKD2相比,PKD3表達(dá)量的變化在HCoV-229E感染階段發(fā)揮重要作用。RNAi干擾敲低PKD3的表達(dá)和PKD抑制劑CRT0066101抑制PKD活性顯著降低HCoV-229E的mRNA表達(dá)和病毒滴度,表明PKD參與HCoV-229E的復(fù)制過(guò)程,機(jī)制上,PKD通過(guò)調(diào)控PI4KIIIβ影響TGN裂變參與HCoV-229E的復(fù)制。

本研究評(píng)估了PKD抑制劑CRT0066101在抑制HCoV-229E復(fù)制中的有效性。已有研究表明CRT0066101對(duì)多種病毒具有抗病毒活性,包括人類鼻病毒[16]、甲型流感病毒[17]、單純皰疹病毒1[14]和丙型肝炎病毒[18]。動(dòng)物模型研究也表明,在80 mg/kg的劑量給藥情況下,CRT0066101具有良好的細(xì)胞耐受性[19]。本研究結(jié)果表明,3 μmol/L的CRT0066101在HCoV-229E感染的MRC-5細(xì)胞中的病毒抑制作用最顯著。值得注意的是,細(xì)胞活力測(cè)定的CRT0066101有效濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞毒性劑量。這表明CRT0066101可以有效阻斷病毒mRNA復(fù)制和釋放,這是病毒復(fù)制周期中至關(guān)重要的晚期事件。本研究結(jié)果提示進(jìn)一步使用動(dòng)物模型評(píng)估CRT0066101的抗HCoV-229E復(fù)制作用值得研究。

本研究探索了PKD抑制劑阻斷冠狀病毒復(fù)制的潛在機(jī)制。研究表明,磷脂酰肌醇4-激酶 IIIβ(Phosphatidylinositol 4-kinase III beta,PI4KIIIβ)是高爾基體復(fù)合體結(jié)構(gòu)的重要成分,也是PKD的底物之一[20]。PKD磷酸化PI4KIIIβ可以激活其脂質(zhì)激酶活性并增強(qiáng)囊泡運(yùn)輸[21]。PI4KIIIβ將磷酸肌醇(Phosphates Isositol,PI)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4-磷酸(Phosphatidylinositol 4-phosphate,PI4P),后者在高爾基體膜定位中起到重要作用[13]。PI4P經(jīng)過(guò)磷脂酰肌醇5-激酶(Phosphatidylinositol 5-kinase,PI4P5K)的磷酸化轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2)[22]。因此,測(cè)定PI(4,5)P2水平可間接反映PI4KIIIβ的激活情況。本研究發(fā)現(xiàn),PI4KIIIβ抑制劑(BQR695)挽救PKD3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的PI(4,5)P2升高,表明PI4KIIIβ參與PKD調(diào)控的PI(4,5)P2的生成,這與先前觀察到的PKD調(diào)節(jié)PI4KIIIβ激活的結(jié)果一致[13]。Grazia Martina等[23]已經(jīng)證實(shí)PI4KIIIβ的抑制劑抑制SARS-CoV-2的復(fù)制,這提示本研究的分子機(jī)制的合理性。

已有研究表明,PI4KIIIβ對(duì)于幾種小RNA病毒的RNA復(fù)制至關(guān)重要[24-25]。PI4KIIIβ是SARS-CoV刺突蛋白進(jìn)入細(xì)胞的必需分子,它不會(huì)影響病毒在SARS-CoV S-ACE2結(jié)合或病毒內(nèi)化階段,而是在病毒融合之前或融合時(shí)發(fā)揮作用,表明PI4KIIIβ調(diào)控SARS-CoV進(jìn)入宿主細(xì)胞[26]。本研究結(jié)果表明,BQR695抑制PI4KIIIβ的活性能夠阻斷高爾基體裂變和囊泡運(yùn)輸,且顯著降低HCoV-229E的mRNA復(fù)制和病毒滴度。這些數(shù)據(jù)表明,細(xì)胞膜和高爾基體之間的脂質(zhì)循環(huán)對(duì)冠狀病毒的復(fù)制起到重要作用。最近的一項(xiàng)研究表明,宿主脂質(zhì)激酶PI4KIIIβ的抑制劑可以在低至微摩爾濃度下阻斷SARS-CoV-2的復(fù)制[23]。但是,PI4KIIIβ能否抑制SARS-CoV-2的復(fù)制的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證實(shí)PKD作為一種新的宿主因子,通過(guò)調(diào)控PI4KIIIβ在冠狀病毒復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并影響冠狀病毒感染細(xì)胞中的高爾基體的裂變和囊泡形成。本研究不僅加深了對(duì)PKD/PI4KIIIβ通路調(diào)控冠狀病毒復(fù)制機(jī)制的理解,也通過(guò)體外試驗(yàn)證明了PKD抑制劑和PI4KIIIβ抑制劑顯著抑制人類冠狀病毒的作用,為研發(fā)廣譜抗病毒藥物以應(yīng)對(duì)冠狀病毒感染提供了基礎(chǔ)。

(致謝:本研究項(xiàng)目在美國(guó)羅徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Zheng-gen Jin教授實(shí)驗(yàn)室完成。)

利益沖突：無(wú)