李 雪,孫婷婷,魏彤竹,王偉杰,刁文麗

副溶血性弧菌可引發(fā)人類與海產(chǎn)品相關(guān)的腸胃炎,是一種嗜鹽性革蘭氏陰性細(xì)菌。近5年來,由副溶血性弧菌引起的食物中毒病例增多,甚至出現(xiàn)死亡病例,已引起相關(guān)部門的重視[1]。

副溶血性弧菌由藤野在1950年首次分離,菌種鑒定主要依據(jù)血清分型、生化反應(yīng)、噬鹽性試驗(yàn)、神奈川現(xiàn)象、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。鑒定項(xiàng)目多,培養(yǎng)基消耗大,實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,檢驗(yàn)耗時(shí)長,給實(shí)際工作帶來不便。

血清分型是副溶血性弧菌分型的常用方法,副溶血性弧菌一般有13個(gè)血清O群和71個(gè)K型抗原,但很多VP分離株不能用現(xiàn)有的抗原分型,當(dāng)出現(xiàn)新的血清型時(shí)就可能給食源性疾病流行病學(xué)調(diào)查和溯源帶來困難,因此作為流行病學(xué)研究工具,血清分型是很受限制的[2-3]。血清分型于副溶血性弧菌亞型的區(qū)分和流行病學(xué)調(diào)查相對(duì)不敏感。這就需要更具辨別能力的分子分型方法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行亞型分析和溯源。細(xì)致的分子分型研究及副溶血性弧菌菌株間親緣關(guān)系的探討可為副溶血性弧菌的預(yù)防、控制、流行病學(xué)調(diào)查、協(xié)助追蹤感染源等工作提供重要理論依據(jù)[4-7]。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)具有分辨力高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)應(yīng)用在很多食源性致病菌的分子分型研究中。PFGE的原理在于凝膠中應(yīng)用交錯(cuò)電場,使DNA的運(yùn)動(dòng)方向變化,從而使大分子量DNA可以被更好的分離,研究者根據(jù)條帶來進(jìn)行鑒定與溯源等工作。

REP-PCR和ERIC-PCR技術(shù)是利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物的靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較,即可分析菌株間基因組存在的差異。這些重復(fù)序列在原核生物界廣泛存在,在一些細(xì)菌屬和種中是保守的。該技術(shù)對(duì)于大量或少量的菌株分型均適用,簡單易行。與其他分類技術(shù)相比,這種技術(shù)有更高的分辨力。

本研究對(duì)2020年遼寧省副溶血性弧菌進(jìn)行3種分子分型方法研究,探討3種方法間的關(guān)聯(lián)性和菌株間的親緣關(guān)系,分析遼寧省副溶血性弧菌的流行趨勢及分布規(guī)律,為食源性疾病的防控提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 海產(chǎn)品采自2020年遼寧省14個(gè)市的農(nóng)貿(mào)市場。糞便樣品來源于2020年遼寧省內(nèi)食源性疾病監(jiān)測醫(yī)院食物中毒病人。

采集海產(chǎn)品和糞便樣品進(jìn)行VP增菌、分離和鑒定,得到食品分離株22株和臨床分離株22株,44株菌全部由省疾控中心用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀鑒定為VP。ATCC 17802(來源于遼寧省疾控中心),PFGE實(shí)驗(yàn)分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株SalmonellaBraenderupH9812來自于國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心。

1.2 主要儀器與試劑 脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)(美國伯樂CHEFMAPPER-XA)、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂GelDocXR+)、培養(yǎng)箱(中國海河HHB11-22)、PCR儀(美國伯樂S1000)、全自動(dòng)微生物生化鑒定儀和比濁儀(法國梅里埃VITEK2)。儀器均通過計(jì)量檢定或校準(zhǔn)。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水-3%APW(北京陸橋批號(hào)20210326)、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂(北京陸橋批號(hào)20210428)、弧菌顯色培養(yǎng)基(法國科馬嘉批號(hào)20201228)、弧菌血清(SSI 批號(hào)20200113)、NotI酶(Promega 批號(hào)20200806)、金膠(Promega 批號(hào)20201209)Q、REP-PCR和ERIC-PCR引物(沈陽匯佰公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離鑒定 按照GB 4789.7—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[8]中方法進(jìn)行菌的分離鑒定。樣品經(jīng)過3% APW選擇性增菌后,劃線接種于弧菌顯色平板,挑取疑似單菌落37 ℃純培養(yǎng)后,經(jīng)過VITEK2系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。VP分離株保存于-80 ℃冰箱中備用。44株分離菌株全部由省疾控中心用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀鑒定為VP。

1.3.2 血清分型 按照《GB4789.7-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[8]中玻片凝集法對(duì)VP分離株進(jìn)行血清分型。

1.3.3 PFGE分型及聚類分析 按照國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心下發(fā)的《2020年食源性疾病監(jiān)測工作手冊》[9]操作。細(xì)菌懸液濃度4.5麥?zhǔn)蠁挝?Not I限制性內(nèi)切酶40 U/膠塊;37 ℃酶切4 h;電泳19 h;膠塊GelRed染色30 min。應(yīng)用BioNumerics7.6軟件對(duì)PFGE圖譜分析校準(zhǔn)、聚類分析(非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法,UPGMA)及同源性研究。

1.3.4 REP-PCR和ERIC-PCR分型及聚類分析 按文獻(xiàn)[10-11]方法利用REP和ERIC設(shè)計(jì)引物并按照其反應(yīng)體系進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn),擴(kuò)增出不同DNA片段圖譜,引物序列見表1。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)圖譜聚類分析,用系統(tǒng)聚類分析法中的組內(nèi)聚類法,對(duì)各菌株進(jìn)行聚類分析,這種方法曾被Martin-Kearley等人描述過[10],最終使用Hunter和Gaston的方法計(jì)算出各種分型方法的區(qū)分能力即分辨力(DI)[11]。

表1 REP-PCR和ERIC-PCR引物序列

上述公式中,DI是分辨力,s是型別數(shù),nj是j型菌株數(shù),N是菌株總數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 血清分型結(jié)果 44株VP,其中有8株不能進(jìn)行K分型,不可分型率為18.2%。其他菌株共分為15個(gè)血清型。食源性疾病22株分離株,主要血清群為O3,其次為O1,且分為4個(gè)血清型,O3∶K6(12)O1∶K5(6),O4∶K8(2)O3∶K29(2)。食品分離株22株,主要的血清群為O2,其次為O1和O3群。其中8株為O2群但不可進(jìn)行K抗原分型,其他14株可分為11個(gè)血清型, O2∶K28(3),O2∶K3(1),O1∶K32(1),O1∶K19(1),O1∶K33(1),O4∶K42(1),O4∶K34(1),O3∶K45(2),O3∶K6(1),O5∶K17(1),O10∶K24(1)。44株VP血清型結(jié)果具體見表2。

表2 44株VP血清分型結(jié)果

2.2 PFGE聚類分析結(jié)果 PFGE的分辨力(DI)達(dá)到0.986。按相似度>85%,44株VP分離株可分成3組優(yōu)勢帶型,主要分子型為A-C組。A組共16株全部來源于臨床分離株:202009(大連)、202010(大連)、202007(大連)、202011(大連)、202012(大連)、202015(沈陽)、202016(沈陽)、202017(沈陽)、202020(大連)、202001(沈陽)、202022(大連)、202014(盤錦)、202019(大連)、202013(大連)、202003(沈陽)。B組共4株全部來源于臨床分離株:202006(沈陽)、202008(大連)、202021(大連)、202002(沈陽)。C組共2株全部來源于鞍山市食品分離株:202036、202039。臨床分離株血清分型和PFGE分型結(jié)果一致。臨床分離株間相似度>85%,相似度高。食品分離株除個(gè)別株與臨床分離株相似度>95%,相似度高,其他食品分離株與臨床分離株間相似度均<85%,相似度低,食品分離株血清分型和PFGE分型結(jié)果一致。食品分離株間相似度<85%,相似度低。一些可生食的即食食品分離株與臨床分離株間相似度>95%,相似度高。主要分子型與血清占比分析情況見表3。表3可以看出,A組、B組和C組每組里均由血清群O3和O1菌株組成,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高。

表3 VP主要分子型與血清群占比分析

2.4 REP-PCR和ERIC-PCR聚類分析結(jié)果 REP-PCR的分辨力(DI)達(dá)到0.947,ERIC-PCR的分辨力(DI)為0.935。REP-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4組優(yōu)勢帶型A-D組,ERIC-PCR按∑2 <5可以把44株菌分成4組優(yōu)勢帶型A-D組。PFGE聚類分析中分型的A-C組菌株,每組菌株均在REP-PCR和ERIC-PCR聚類分析中按∑2 <5而被分成相同的組,REP-PCR、ERIC-PCR分型結(jié)果和PFGE分型結(jié)果一致,但PFGE可以把REP-PCR和ERIC-PCR分型結(jié)果相同的菌株進(jìn)一步分成不同亞型,例如菌株(9、10、7、11、12、15、16、17、20、1、22、14、19、13、3)(6、8、2、21),(34、35),(36、39)。

3 討 論

血清分型結(jié)果顯示,血清鑒定過程中,部分菌株不能分型,且部分菌株還需高壓處理后再次做凝集實(shí)驗(yàn),提示VP抗原不穩(wěn)定易變異,現(xiàn)階段不能做到所有菌株都被分型,且VP血清型鑒定繁瑣復(fù)雜。22株食品分離株中8株不能分型,提示食品分離株較臨床分離株血清型更難區(qū)分[12-14]。臨床分離株血清分型較少,食品分離株血清分型較多。

遼寧省2020年VP分離株的流行血清型與遼寧省近5年VP分離株的流行血清型一致,臨床VP分離株流行血清型仍為O3∶K6,食品VP分離株流行血清群仍為O2[4,15-17]。

聚類分析結(jié)果顯示,臨床分離株親緣關(guān)系近,關(guān)聯(lián)性強(qiáng),提示臨床分離株可能起源于相同的致病菌。食品分離株親緣關(guān)系遠(yuǎn),關(guān)聯(lián)性弱,提示食品分離株可能起源于不同菌株。個(gè)別食品分離株與臨床分離株親緣關(guān)系近,關(guān)聯(lián)性強(qiáng),提示個(gè)別食品分離株可能起源于相同致病菌。絕大多數(shù)食品分離株與臨床分離株親緣關(guān)系遠(yuǎn),關(guān)聯(lián)性弱,提示絕大多數(shù)食品分離株可能不致病。一些可生食的即食食品分離株與臨床分離株親緣關(guān)系較近,關(guān)聯(lián)性強(qiáng),提示可生食的即食海產(chǎn)品比烹飪后的海產(chǎn)品可能更易致病。

食品分離株沈陽市202005與大連市202018與臨床分離株在3種分型方法中相似度均較高,提示該食品分離株具有引起食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)給予關(guān)注。食品分離株202018來源是即食食品三文魚,且圖1顯示,即食食品血清型主要為O2和O1,由于即食食品的直接入口的特殊性,這株菌及血清型O2和O1均應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。文獻(xiàn)顯示,80年代,我國臨床VP分離株血清型主要以O(shè)1、O4群為主[18-21]。近5年來,遼寧省和國外一些國家及國內(nèi)其他一些省份流行血清型以O(shè)3、O1群為主[22],提示VP分離株流行血清型由O4群逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镺3群。表3可以看出,O3和O1菌株相似度>85%,相似度高,親緣關(guān)系近,O3群和O1群菌株密切相關(guān),因此推斷血清型O3群菌株很可能來源于O1群菌株。

神奈川現(xiàn)象是副溶血弧菌在我萋氏培養(yǎng)基上的溶血現(xiàn)象[3],此陽性反應(yīng)是由耐熱直接溶血毒素(TDH)所造成的,日本學(xué)者認(rèn)為神奈川現(xiàn)象和腸道致病性密切相關(guān)[3]。本研究發(fā)現(xiàn),22株臨床分離株REP-PCR指紋圖譜都有600 bp這條帶,而ERIC-PCR指紋圖譜中都有1 000 bp這條帶,值得注意的是,這22株全部都是致病菌,通過鑒定它們都產(chǎn)生神奈川現(xiàn)象。600 bp、1 000 bp兩條共有擴(kuò)增帶與毒力基因及其致病性的相關(guān)性有待進(jìn)一步探討。

評(píng)價(jià)分型方法因素[2]:1) 分型力。即種內(nèi)的細(xì)菌都能通過某種方法的使用得到分型的能力。2) 鑒別力(DI)。對(duì)兩個(gè)不相關(guān)菌株被區(qū)分為不同型的可能性進(jìn)行定量。3) 可重復(fù)性。是指使用某一種方法對(duì)某一特定菌株重復(fù)測試時(shí)能產(chǎn)生相同結(jié)果的能力。4) 結(jié)果是否易于解釋。電泳帶型是否易于解釋成為評(píng)定一種分型方法實(shí)用性的一個(gè)因素。5) 同時(shí)還應(yīng)考慮該技術(shù)是否經(jīng)濟(jì)、操作是否簡便以及是否能快速地獲得結(jié)果等。

PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR方法對(duì)遼寧省VP分離株分型均是可行的,這3種分子分型方法滿足上述5種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR 3種方法擴(kuò)增均基本穩(wěn)定,每次試驗(yàn)均能重復(fù)產(chǎn)生一定復(fù)雜程度的比較清晰且有不同程度多態(tài)性DNA主條帶。PFGE分型方法的分辨力更優(yōu)于REP-PCR和ERIC-PCR分型方法,REP-PCR分辨力要優(yōu)于ERIC-PCR。REP和ERIC重復(fù)基因序列在2020年遼寧省副溶血性弧菌分離株中普遍存在,此外,REP-PCR和ERIC-PCR方法操作簡便和快捷,所需的費(fèi)用低時(shí)間短,但分型的分辨力卻很高,再現(xiàn)性好,因此利用REP-PCR和ERIC-PCR方法對(duì)副溶血性弧菌菌株分型具有可行性。大量的研究表明,雖然有時(shí)REP-PCR和ERIC-PCR分辨力和再現(xiàn)性比PFGE方法稍低,但與PFGE獲得的結(jié)果確有很好的關(guān)聯(lián)度。與PFGE方法相比,REP-PCR、ERIC-PCR分型操作簡單快捷,所需的費(fèi)用非常低、不需要昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備和分析軟件,實(shí)驗(yàn)周期短,現(xiàn)階段遼寧省市、區(qū)(縣)級(jí)疾控實(shí)驗(yàn)室普遍缺乏實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和PFGE專業(yè)設(shè)備、軟件的情況下,可應(yīng)用REP-PCR和ERIC-PCR方法對(duì)YE進(jìn)行食源性疾病及食物中毒暴發(fā)流行的溯源研究。

綜上,3種方法分型結(jié)果一致,對(duì)于評(píng)估遼寧省副溶血性弧菌流行趨勢及分布規(guī)律是可行的,在副溶血性弧菌所引起食源性疾病暴發(fā)流行時(shí),有條件的實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用這3種方法對(duì)致病菌進(jìn)行快速有效溯源。

利益沖突：無