白 颯,劉保華,閆榮軍,趙 輝,孫連波,張 濤,韓煥美

2019年12月發(fā)現(xiàn)的新冠肺炎疫情(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引發(fā)的一種呼吸道傳染疾病,是繼人冠狀病毒229E(HCoV-229E)[1]、HCoV-OC43、急性嚴重呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、HCoVNL63[2]、HCoV-HKU1[3-4]和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERSCoV)[5]后第7種能感染人類的冠狀病毒。因其傳播速度快、傳染性強等特性被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)宣布成為“國際公共衛(wèi)生緊急事件”,2020年3月WHO將COVID-19定義為全球性大流行病[6-10]。疫情造成的死亡人數(shù)已遠超2003年SARS大流行,對全球的健康、經(jīng)濟和社會造成沉重的負擔(dān)[11-12]。

SARS-CoV-2為單股正鏈RNA病毒,基因組全長約30 kb。隨著病毒的持續(xù)流行,SARS-CoV-2目前已經(jīng)進化出多種基因型和進化分支。本研究對3例輸入性新冠肺炎病例的呼吸道標本開展核酸檢測和二代高通量全基因組測序,并對基因序列進行變異分析和同源性分析,從分子流行病學(xué)角度為濟南市新冠疫情防控工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》中新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南[13],對濟南口岸入境的SARS-CoV-2 無癥狀感染者采集鼻咽拭子樣本,編號分別為樣本1-RJ091,樣本2-RJ034,樣本3-RJ136。

1.2 儀器和試劑 GeneRotex 96 全自動核酸提取儀和病毒RNA提取試劑均購自西安天隆科技有限公司;新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)分別購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司、江蘇碩世生物科技股份有限公司、武漢明德生物科技股份有限公司;ABI QuantStudio Q3/Q5以及臺式熒光計-Qubit4均購自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific);DNBSEQ-E5基因測序儀,測序試劑DNBSEQ-E5RS Sequencing Kit(SE100)及集成測序載片DNBSEQ-E5RS Integrated Flow Cell均來自于深圳華大智造科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核酸提取與檢測 從鼻咽拭子樣本中吸取200 μL進行核酸提取,取5 μL用于新冠病毒ORF1ab和N靶基因的檢測,具體操作步驟詳見商品化試劑盒說明書。

1.3.2 基因測序 取提取的目標樣本核酸10 μL,通過ATOPlex RNA 多重PCR擴增模塊(華大智造,貨號:940-000132-00)、MGIEasy Fast酶切DNA文庫制備試劑套裝(華大智造,貨號:940-00029-00)、高通量測序試劑盒套裝(SE100,貨號:940-000335-00)、DNBSEQ一步法DNB制備試劑盒(OS-DNB)(華大智造,貨號:1000026466)完成病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄、多重PCR、純化、定量等文庫制備以及OS-DNB的制備等步驟。DNB終濃度≥8 ng/μL后通過集成測序載片(華大智造,貨號:1000026251)上機測序。按照華大智造公司測序流程說明書進行測序。

1.3.3 基因組分析數(shù)據(jù)庫的建立 通過生物學(xué)分析軟件CLC Genomics Workbench 23.0.4(QIAGEN,Germany)對已測序列進行優(yōu)化及序列拼接。使用在線分析平臺pangolin https://pangolin.cog-uk.io/ 對測得的病毒全基因組序列進行毒株分型,Nextclade(https://clades.nextstrain.org)對其進行變異位點分析。本研究采用SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1(GenBank: MN908947.3)作為新冠病毒參考基因組進行分析,同時從GISAID和NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選出與所測序列相似性高,同時期國際上公布的序列作為同源性分析的參考基因組,共37條序列通過MEGA7.0(MasatoshiNei,University of Pennsylvania)軟件分析,最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,用bootstrap抽樣1 000次來評估進化樹的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 核酸檢測結(jié)果 通過RT-PCR法,對樣本1-RJ091、樣本2-RJ034、樣本3-RJ136的核酸提取物進行雙試劑檢測,結(jié)果顯示雙靶標(ORF1ab基因和N基因值)擴增曲線均呈標準S型且有明顯指數(shù)增長期(陽性),第三方質(zhì)控品、試劑盒中陽性標準品、陰性標準品以及環(huán)境監(jiān)測樣品均符合試劑盒結(jié)果判讀要求。

2.2 測序結(jié)果 3份樣本經(jīng)二代全基因組測序,測序質(zhì)量值(Q30)分別為95.92、95.43、98.34,基因組測序深度分別為5730.77X、2223.97X、2965.59X,拼接后有效全長在29 835 bp～29 844 bp之間;與標準參考序列SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1)比對,基因組覆蓋率(完整度)分別為99.75%、99.75%、99.65%,覆蓋一致性數(shù)據(jù)較好。

2.3 病毒突變分析 與參比毒株SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1相比,測序結(jié)果顯示3例樣本基因組變異涉及8個編碼區(qū)域,其中導(dǎo)致S基因編碼區(qū)氨基酸變異的有32～33個,占總突變的50%以上,ORF1基因上的非同義突變數(shù)為18～20個,占總突變的30%以上。其余編碼區(qū)(包括E、M、N基因)的突變數(shù)僅有10個,N基因占比50%左右。結(jié)合圖1,可發(fā)現(xiàn)3個樣本序列在S編碼區(qū)均出現(xiàn)了K444T、L452R、N460K、F486V等重要位點的變異,其中病例1和2還出現(xiàn)了R346T的變異。基因組位點詳細變異情況見表1。

表1 3例病例的基因組位點變異情況

圖1 SARS-CoV-2變異位點進化圖[19])

2.4 系統(tǒng)進化分析 應(yīng)用pangolin分型法及Nextstrain在線平臺對病毒進行分析,分型結(jié)果顯示,3例不同區(qū)域輸入的新冠病毒均位于BA.5.3.1進化分支上,Nextstrain分型為22E,樣本1-RJ091為奧密克戎變異株BQ.1.22,樣本2-RJ034為BQ.1.1,樣本3-RJ13為BQ.1。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建SARS-CoV-2全基因組序列進化樹,在進化樹上,3例新冠病毒樣本與來自日本的參考株BS006451.1、EPI_ISL_18006411聚成一簇,與同時期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遺傳距離最近,同屬于BQ.1分枝。系統(tǒng)發(fā)育樹詳見圖2。

●為參考基因組Wuhan-Hu-1株▲sample_1為樣本1-RJ091, ▲sample_2為樣本2-RJ034, ▲sample_3為樣本3-RJ13。

3 討 論

自從2019年12月新冠肺炎出現(xiàn)后,攜帶Spike蛋白D614G的SARS-CoV-2變體迅速成為全球大流行中最普遍的株型[14],經(jīng)過全球不同人群間的傳播進化以及新冠藥物及疫苗的多重選擇下,新的變種不斷出現(xiàn),感染病例不斷攀升,新冠肺炎已然成為了全球范圍內(nèi)最重大的公共衛(wèi)生事件之一[15]。研究表明,SARS-CoV-2基因組平均每月積累2個堿基突變[16]。持續(xù)深入的病毒基因組監(jiān)測和實時評估新出現(xiàn)的 SARS-CoV-2 變體的風(fēng)險至關(guān)重要。

本研究通過二代測序技術(shù)對同一時間段不同地區(qū)入境的3株新型冠狀毒株進行測序并成功獲得了相應(yīng)的全基因組序列。Pangolin 分型結(jié)果顯示,3例新冠病毒序列均為Omicron變異株,位于BA.5.3.1進化分支上,基因型分別為BQ.1.22,BQ.1.1,BQ.1。BQ.1是BA.5通過變異變遷形成了第6代的一個亞分支。3例樣本與同時期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遺傳距離最近,同屬于BQ.1分支,提示可能跟日本2022年10月開始流行的BQ.1同源。此次全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析中可發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2在全球范圍內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的傳播,世界范圍內(nèi)高密度人群流動可使病毒在短時間內(nèi)擴散,符合該毒株在該時期的上升趨勢[17]。

通過對全基因組變異位點分析以及與Wuhan-HU-1參考序列對比,3例樣本分別產(chǎn)生了77、80、78個堿基位點突變,氨基酸突變數(shù)分別為60、63、59,以S編碼區(qū)氨基酸突變頻率最高,ORF1(ORF1a和ORF1b)編碼區(qū)上的突變次之,其余編碼區(qū)(包括E、M、N基因)最少。由于S蛋白是宿主和治療性抗體作用的重要位點,通過受體結(jié)合區(qū)(RBD)與宿主細胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合導(dǎo)致細胞感染[18],因此S蛋白的變異位點對病毒感染性有著重要影響。3例毒株序列在S刺突蛋白的5個關(guān)鍵殘基處均集中獲得趨同替換K444T、L452R、N460K 和 F486V的變異,其中病例1和2還出現(xiàn)了R346T的變異,均屬于BQ.1亞系毒株特征性變異位點[19]。所有5個趨同替換都有助于增加相對基本繁殖數(shù),而包含所有5個趨同替換的 BQ.1.1 在所研究的病毒中表現(xiàn)出最高的適應(yīng)性[20]。Fabio S等在中和試驗研究中發(fā)現(xiàn),BQ.1.1比BA.5更能突破BA.2/5感染血清,BQ.1.1 刺突蛋白比 BA.5 刺突蛋白表現(xiàn)出更大的融合性,這些重要位點的突變是導(dǎo)致免疫逃逸的關(guān)鍵[21]。此外,BQ.1 取代 BA5.2 在刺突蛋白上的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該位點是COVID-19 疫苗和治療性單克隆抗體(mAbs)的主要靶點,因此這些迅速增加的亞變異及廣泛的刺突突變可能對當(dāng)前某些治療性抗體產(chǎn)生耐藥性。研究表明,臨床批準的 LY-CoV1404 (bebtelovimab)和Evusheld對 BQ.1 或 BQ.1.1 無效[22],這引起了人們的擔(dān)憂,即單抗或疫苗對 BQ.1.1 的效果可能不如其他奧密克戎菌株。

由于冠狀病毒亞變體 BQ.1 在逃避抗體方面的優(yōu)勢使其比原始的Omicron變體更容易傳播,因此,可能會導(dǎo)致突破性感染和部分人重復(fù)感染,BQ.1.1 已在全球占據(jù)過主導(dǎo)地位,但到目前為止,沒有實質(zhì)性證據(jù)表明 BQ.1及其分支比原來的奧密克戎變體引起更嚴重的疾病[19]。雖然我國已經(jīng)取消了清零政策,但是新變異株的不斷出現(xiàn)一直吸引著人們的極大關(guān)注。截至目前 BA.5.2 及 XBB 是我國的主要流行毒株,BQ 毒株未成爆發(fā)之態(tài),一方面可能跟毒株本身沒有導(dǎo)致致病性增強的變異位點有關(guān),另一方面可能跟我國的防疫政策,醫(yī)療環(huán)境等有關(guān)系,但這個亞系仍在不斷進化和傳播,使得棘突突變的復(fù)雜性也在不斷增加,由奧密克戎毒株引起的突破性感染可交叉中和 BQ.1、BQ.1.1 和 XBB.1.5 毒株等大量新毒株的血清樣本[20-22],二者融合現(xiàn)象越來越突出,形成“共循環(huán)”,未來的亞變體應(yīng)該會綜合 BQ.1.1.*與 XBB.1.5的突變的優(yōu)勢,形成終極的突變模式,這種復(fù)雜模式為疫情發(fā)展走勢帶來很大的不確定性,外防輸入仍然面臨考驗、挑戰(zhàn)和壓力,我們?nèi)孕杳芮嘘P(guān)注全球疫情形勢和病毒變異情況,防范病毒卷土重來。

本研究通過測序獲得的3例境外輸入性新冠病毒變異株 OmicronBQ.1及其分支,為濟南口岸首次檢出的輸入性新冠病毒基因型,豐富了濟南市SARS-CoV-2變異株的數(shù)據(jù)庫,為潛在的疫情溯源提供了基礎(chǔ)資料。

利益沖突：無