張曉華，李素娟，侯得山

（鄭州煤炭工業(yè)（集團）有限公司總醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

PHC 是惡性腫瘤之一， 每年的新發(fā)病例和死亡病例均超過80 萬例，而我國的肝癌病例約占全球病例的一半，該病具有發(fā)病隱匿、進展迅速、惡性程度高及致死率高等特點[1-3]。 由于發(fā)病隱匿，大部分患者在患病早期沒有任何臨床癥狀， 經(jīng)檢查確診時病情已發(fā)展至中晚期， 導致進行手術(shù)切除的可能性渺小。因此，如何對PHC 進行早期診斷及其預后評估對臨床降低PHC 患者的死亡率有重要意義。 血清Smad4 是調(diào)節(jié)細胞侵襲遷移的重要下游信號通路，與腫瘤擴散關(guān)系密切；TK1 是嘧啶補救合成的關(guān)鍵酶，與腫瘤細胞的增殖具有很高的相關(guān)性[4-5]；VEGF 是最強的促新生血管形成的生長因子，在肝癌形成與進展中起關(guān)鍵作用[6]。 現(xiàn)階段，臨床關(guān)于Smad4、TK1、VEGF 三者聯(lián)合診斷PHC 和預測其患者預后的報道尚少， 故本研究分析PHC患 者 血 清Smad4、TK1、VEGF 水 平 變 化 及 其 與PHC 發(fā)生和預后的關(guān)系，為PHC 的早期診斷和預后評估提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年4 月至2019 年4 月醫(yī)院確診的102 例PHC 患者， 將一般資料及隨訪資料均完整的96 例PHC 患者納入病例組，其中男52 例，女44 例，年齡39～70（55.42±8.17）歲。 納入標準：經(jīng)病理學檢查確診為PHC；既往沒有接受過手術(shù)切除治療；臨床資料完整；患者及家屬了解并積極配合研究治療，符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)標準。 排除標準：伴有心、肺、腎功能障礙者；有凝血功能、免疫系統(tǒng)疾病者；其他腫瘤或巨塊型者。 選擇年齡相似的健康體檢者96 例作為對照組，男58例，女38 例，年齡36～73（53.48±8.36）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法 （1）Smad4：于清早收集被檢者的空腹外周靜脈血4 mL， 以轉(zhuǎn)速為3 500 r/min 離心10 min， 留取血清，-80 °C 冷藏待檢， 使用酶聯(lián)免疫（ELISA）法測定Smad4 水平，步驟按照檢測試劑盒（美國Biolegend 公司） 的說明書嚴格操作。 （2）TK1： 同上收集肘部靜脈血4 mL 放于真空采血管中， 室溫靜置30 min， 轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，留取血清，-25 °C 冷藏待檢，使用CIS-1 型化學發(fā)光數(shù)字成像分析儀測定TK1 水平， 步驟按照檢測試劑盒 （深圳華瑞同康生物技術(shù)深圳有限公司）的說明書嚴格操作。 （3）VEGF：同上收集靜脈血4 mL，室溫靜置30 min，轉(zhuǎn)速2 500 r/min 離心15 min，留取血清，-30 °C 冷藏待檢，ELISA 法測定VEGF 水平，步驟按照檢測試劑盒（上海銘睿生物科技有限公司）的說明書嚴格操作。

1.3 治療與隨訪 病例組患者確診后均予以保肝、白蛋白補充、營養(yǎng)支持等對癥治療，當患者肝功能改善達到A 級，且一般情況好轉(zhuǎn)后，擇期進行肝切除術(shù)， 并于術(shù)后5 周開始行輔助性的經(jīng)導管動脈化療栓塞術(shù)治療。 術(shù)后每2 個月通過門診復查患者血清指標以及肝臟B 超， 每4 個月復查胸部X線片。 對可能復發(fā)的患者進行腹部CT 掃描和(或)MRI 檢查以證實。 必要情況下，可進行超聲引導下穿刺活組織病理學檢查明確診斷， 隨訪總時間為手術(shù)后1 年或死亡。 以末次隨訪記錄作為隨訪結(jié)果，患者腫瘤復發(fā)、死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為預后不良，收集發(fā)生預后不良的患者數(shù)，分為預后不良組和預后良好組。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0 處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用（%）表示，行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，t檢驗，采用Logistic回歸分析影響患者預后的獨立危險因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。應用受試者工作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）評價各時間點Smad4、TK1、VEGF預測PHC 患者預后評估的準確度。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較 病例組術(shù)后血清Smad4、TK1、VEGF 水平低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且病例組術(shù)前和術(shù)后血清Smad4、TK1、VEGF 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 病例組與對照組血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較（±s）

表1 病例組與對照組血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較（±s）

注：與病例組術(shù)前比較，①P＜0.05；與病例組術(shù)后比較，②P＜0.05

組別 n 觀察時間 Smad4（ng/mL） TK1（pmol/L） VEGF（pg/mL）病例組96術(shù)前術(shù)后對照組96 23.65±2.63 16.87±1.51①12.54±2.14①②5.67±1.13 3.14±0.23①0.81±0.22①②206.85±29.36 158.82±11.27①84.73±13.21①②

2.2 血清Smad4、TK1、VEGF 水平及三者聯(lián)合診斷PHC 的ROC曲線 根據(jù)AUC選取Smad4、TK1、VEGF 的最佳診斷截點，ROC曲線分析顯示，Smad4、TK1、VEGF 聯(lián)合的AUC為0.889 高于單一指 標Smad4 的0.796、TK1 的0.675 和VEGF 的0.793（Z=9.360、4.485、9.088，P＜0.05），見圖1，表2。

圖1 Smad4、TK1、VEGF 及聯(lián)合診斷PHC 的ROC 曲線

表2 Smad4、TK1、VEGF 及聯(lián)合診斷PHC 結(jié)果分析

2.3 PHC 預后不良與預后良好組血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較 96 例PHC 患者中，24 例預后不良，其中腫瘤復發(fā)10 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8 例，死亡6 例，預后不良率為25.00%。預后不良組術(shù)前和術(shù)后血清Smad4、TK1、VEGF 水平高于預后良好組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 病例組預后不良和預后良好組患者血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較（±s）

表3 病例組預后不良和預后良好組患者血清Smad4、TK1、VEGF 水平比較（±s）

注：與預后不良組術(shù)前比較，①P＜0.05；與預后不良組術(shù)后比較，②P＜0.05；與本組術(shù)前比較，③P＜0.05。

組別 n 觀察時間 Smad4（ng/mL） TK1（pmol/L） VEGF（pg/mL）預后不良組24預后良好組72術(shù)前術(shù)后術(shù)前術(shù)后33.27±7.61 19.16±1.24③20.55±3.42①16.31±1.51②③9.83±1.96 3.76±0.21③4.37±0.86①3.01±0.23②③237.21±67.09 172.14±14.25③196.15±32.21①154.48±12.08②③

2.4 血清Smad4、TK1、VEGF 水平及三者聯(lián)合預測PHC 預后不良的ROC曲線 根據(jù)AUC選取Smad4、TK1、VEGF 的最佳診斷截點，ROC曲線分析顯示，Smad4、TK1、VEGF 聯(lián)合的AUC為0.865高 于 單 一 指 標Smad4 的0.791、TK1 的0.796 和VEGF 的0.773 （Z=8.885、9.325、8.020，P＜0.05），見圖2，表4。

圖2 Smad4、TK1、VEGF 及聯(lián)合預測PHC 預后不良的ROC 曲線

表4 Smad4、TK1、VEGF 及聯(lián)合預測PHC 預后不良結(jié)果分析

2.5 PHC 預后不良單因素分析 預后不良組的年齡、性別、巴塞羅那肝癌臨床分期（BCLC）分期、肝功能Child Pugh 分級、 血小板計數(shù)與預后良好組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；預后不良組腫瘤最大直徑、肝硬化、脈管癌栓、TNM 分期、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目與預后良好組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 預后不良組- 預后良好組一般情況比較[n(%)]

2.6 PHC 預后不良多因素Logisitic回歸分析 是否出現(xiàn)術(shù)后預后不良作為因變量， 以上述有統(tǒng)計學意義項（Smad4、TK1、VEGF、腫瘤最大直徑、肝硬化、脈管癌栓、TNM 分期、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目） 作為自變量， 對上述因素進行賦值，Smad4≤22.06 ng/mL=0，＞22.06 ng/mL=1；TK1≤8.85 pmol/L=0，＞8.85 pmol/L=1；VEG ≤192.74 pg/mL=0，＞192.74 pg/mL=1； 腫 瘤 最 大 直 徑≤5 cm=0，＞5 cm=1，合并肝硬化無=0，有=1，脈管癌栓無=0，有=1，TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期=0，Ⅲ-Ⅳ期=1；腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無=0，有=1，腫瘤數(shù)目單個=0，多個=1 并將其納入Logisitic回歸模型中，發(fā)現(xiàn)Smad4＞22.06 ng/mL、TK1＞8.85 pmol/L、VEGF＞192.74 pg/mL、 合并肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期是PHC 患者預后不良的獨立危險因素，見表6。

表6 PHC 預后不良多因素分析

2.7 病例組不同血清Smad4、TK1、VEGF 表達狀態(tài)患者生存分析 分別以血清Smad4、TK1、VEGF 表達水平22.06 ng/mL、8.85 pmol/L、192.74 pg/mL 作為截點值，將大于截點值納入高表達，小于等于截點值納入低表達，結(jié)果顯示Smad4 高表達、TK1 高表達、VEGF 高表達者1 年無進展生存率分別為41.38%（12/29）、57.78%（26/45）、58.33%（28/48）低于低表達者89.55% （60/67）、90.20% （46/51）、91.67%（44/48）（P＜0.05）；Smad4 高表達、TK1 高表達、VEGF 高表達者1 年總生存率分別為62.07%（18/29）、73.33%（33/45）、72.92%（35/48）低于低表達 者97.01%（65/67）、96.08%（49/51）、95.83%（46/48）（P＜0.05）。 見圖3。

圖3 病例組不同血清Smad4、TK1、VEGF 表達狀態(tài)患者生存分析

3 討論

PHC 包括肝細胞癌、 肝內(nèi)膽管癌和肝細胞膽管細胞混合癌， 其中肝細胞癌占85%~90%。 PHC的發(fā)展是一個多基因突變、 多信號通路的癌變過程，大多遵循從慢性肝炎、肝硬化、肝硬化增生結(jié)節(jié)、不典型增生結(jié)節(jié)、早早期肝癌、早期肝癌、進展期肝癌這一過程， 這是一個多步驟從分子到臨床的演變過程[7-9]。 目前，針對PHC 的治療，早期患者以手術(shù)切除和射頻消融等根治性治療為主要手段， 中晚期患者使用局部治療聯(lián)合系統(tǒng)治療的方式，以有效延長患者的生存時間[10-12]。 隨著醫(yī)學的高速發(fā)展， 手術(shù)切除方法的切除率和整體治療效果逐漸提高， 但是仍存在患者由于診斷延誤等原因?qū)е骂A后效果不理想， 因此早期診斷PHC 和預測其預后不良的發(fā)生對于提高患者的臨床療效具有重要的意義。

Smad4 是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 通路至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，介導TGF-β 的生物學作用，當TGF-β 與其受體結(jié)合后利用Smad4 影響機體細胞內(nèi)信號通路的轉(zhuǎn)導，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，Smad4 水平的增大會促進肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)階段，臨床關(guān)于Smad4 與癌癥的相關(guān)研究較多，韓翔[13]發(fā)現(xiàn)，Smad4 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達明顯上調(diào)，其可以通過介導信號通路促進腫瘤轉(zhuǎn)移。金向宇[14]等也發(fā)現(xiàn)， 在肝癌患者中Smad4 表達水平明顯高于健康人群，Smad4 可以參與肝癌的發(fā)展過程，與肝癌的預后有著密切的關(guān)系。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)，PHC 患者Smad4 呈高水平表達， 經(jīng)手術(shù)后水平顯著下降，其中預后良好者下降更為明顯，原因可能為Smad4 降低可能導致TGF-β 超家族信號途徑的抑制作用消失，從而在腫瘤發(fā)生、進展中起重要作用。 上述研究提示，Smad4 在肝癌的形成中發(fā)揮著促癌作用。

TK1 是一種細胞周期依賴酶， 主要參與細胞DNA 增殖過程。健康人細胞中的TK1 水平較低，細胞增殖過程正常，而TK1 水平的升高，可以為細胞DNA 增殖創(chuàng)造良好的條件， 且惡性腫瘤細胞有無限增殖的特點， 從而造成腫瘤細胞DNA 合成旺盛，促進腫瘤的發(fā)生、增殖[15-16]。目前對于TK1 如何參與腫瘤DNA 增殖的過程沒有定論，但相關(guān)研究表明，其在肝癌患者體內(nèi)的水平較高，且與術(shù)后的預后不良情況有關(guān)，具有預測價值[17]。 在本研究結(jié)果中，病例組TK1 水平與正常人相比明顯偏高，表明肝癌組織中TK1 水平高于正常肝組織， 另外，PHC 預后不良者的TK1 水平要高于預后良好者，說明伴隨TK1 的升高預后不良的概率會增大。

除了血清Smad4 和TK1 外， 有研究證實VEGF 可以作為評估患者病情發(fā)展及預后的參考指標[18]。 VEGF 是一種促血管內(nèi)皮增殖的重要因子，可以與多種血管生成因子相互作用， 促進新血管的生成和血管內(nèi)皮的增大，為腫瘤生長提供基礎(chǔ)，直接影響腫瘤細胞的分化遷移，VEGF 水平的增高可以促進腫瘤細胞的增殖[19]。 本研究結(jié)果提示，血清VEGF 水平可以用于肝癌病情評估，推測VEGF通過加速心血管生成促進腫瘤的增殖， 與PHC 的發(fā)展和預后相關(guān)，隨著VEGF 水平升高，患者預后越差，此結(jié)果與既往楊錦鋒等[20]研究結(jié)果一致。

為了進一步探討Smad4、TK1、VEGF 與PHC發(fā)生及預后的關(guān)系， 本研究通過ROC曲線進行分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad4、TK1、VEGF 聯(lián)合檢測診斷PHC 的AUC高于三者單一檢測， 且Smad4、TK1、VEGF 聯(lián)合預測預后不良的準確性優(yōu)于單一檢測的準確性，表明Smad4、TK1、VEGF 聯(lián)合對PHC 患者的早期診斷和預后評估具有臨床應用價值，目前尚無文獻有類似報道。 考慮到PHC 的預后可能與患者的臨床特征有關(guān)， 本研究根據(jù)預后情況進一步Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，除了合并傳統(tǒng)肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期因素外，Smad4＞22.06 ng/mL、TK1＞8.85 pmol/L、VEGF＞192.74 pg/mL 也是影響PHC 預后的獨立危險因素， 由此可見，PHC 預后情況與血清Smad4、TK1、VEGF 水平有關(guān)， 進一步比較血清Smad4、TK1、VEGF 水平高表達與低表達患者生存情況， 結(jié)果顯示高表達患者無進展生存率與總生存率均低于低表達患者， 說明臨床可以通過對Smad4、TK1、VEGF 的檢測和識別進行早期的臨床干預，改善患者的預后情況。 王征夏等[21]研究發(fā)現(xiàn)， 肝硬化、TNM 分期與PHC 患者發(fā)生不良預后有關(guān)，本研究結(jié)果與其一致，關(guān)于合并肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期因素為PHC 預后不良的危險因素的研究已有較多，在此不再過多描述。

綜上所述，PHC 患者伴隨Smad4、TK1、VEGF水平上升， 且預后不良者上升更加明顯， 三者與PHC 的發(fā)生、預后密切相關(guān)，可以作為臨床預測患者預后的重要血清學指標。